CN102120977B - 一种巧克力微杆菌及利用其制备(4s,5r)-半酯的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum)SIT101，CGMCC NO.4436，以及利用该巧克力微杆菌作为生物催化剂催化内消旋二酯（II）不对称水解产生(4S,5R)-半酯(I)的制备方法。所述方法将巧克力微杆菌细胞置于缓冲溶液中向其中加入内消旋二酯，经催化不对称水解反应得到目标产物(4S,5R)-半酯。本发明的利用该巧克力微杆菌作为生物催化剂制备(4S,5R)-半酯的方法，所用的生物催化剂易于制备、反应条件温和，(4S,5R)-半甲酯的产率高达95%，对映体过量值大于99%，生产成本低，具有相当的工业应用开发前景。

Description

一种巧克力微杆菌及利用其制备(4S,5R)-半酯的方法

技术领域

本发明涉及一种微杆菌及其用途，更具体地说是涉及一种巧克力微杆菌以及利用该巧克力微杆菌作为生物催化剂制备如式(I)所示的(4S, 5R)-半酯的方法。

式中R为C₁~C₃烷基、C₁~C₃烯基；Ar为苯基。

背景技术

已知如式（I）所示的(4S, 5R)-半酯是合成d-生物素(d-Biotin，又名维生素H和辅酶R)的关键中间体。

d-生物素又名维生素H，是水溶性B簇维生素之一。它是羧化酶的辅酶，也是糖、蛋白质和脂肪中间代谢中的一个重要辅酶。除了一部分细菌，酵母和植物能自身合成生物素外，几乎所有的动物和一部分微生物都要从外源获得生物素。生物素用途广泛，20-30%用于医用原料，50%用于饲料，另外还用作化妆品原料、营养添加剂等。上世纪90年代初，西方药理学家发现生物素具有不少令人感兴趣的新用途，其中包括防止胎儿因神经管发育异常所引起的畸胎、促进人体脂肪分解--减肥作用等，此后，生物素引起了医学界的重视。最新研究证实，生物素还能有效治疗目前世界各国发病率极高的2型糖尿病，这一发现使得原来销路平平的生物素一举成为世界医药市场的抢手货。

  Gerecke等最早报道了(4S, 5R)-半酯的合成，以环酸酐与环己醇单酯化制备外消旋环酸单环己醇酯，然后与伪麻黄碱进行非对映体结晶拆分得到所需的(4S, 5R)-半酯(I)；德国专利2058234报道了以环酸酐与伯醇单酯化制成外消旋环酸半酯，再与手性胺声称非对映异构体盐，经结晶法分离后得到(4S, 5R)-半酯。陈芬儿等（高等学校化学学报，2001，1141）报道用氯霉素副产物(1S, 2S)-苏式-1-（对硝基苯基）-1, 3-丙二醇为拆分剂拆分外消旋环酸半酯制备(4S, 5R)-半酯(I)的工艺。然而这些方法均存在单次拆分率低、操作繁琐，成本偏高等缺点。

近年来，也有文献报道了生物催化制备的方法。日本学者（Agric. Biol Chem., 1982, 46(7), 1907）用猪肝酯酶不对称水解前手性二丙酯得到光学活性单酯，产率为85%，ee值为75%。陈芬儿等（Adv. Synth. Catal. 2005, 347, 549）用Eupergit C固定化的猪肝酯酶催化前手性二甲酯水解，产物手性单甲酯产率为90%，ee值为91%（重结晶后达到98.5%）。利用酯酶催化不对称水解内消旋二酯的方法理论上可以以100%的产率得到光学纯的单酯产物，克服了传统动力学拆分50%的理论局限性，而且避免了传统拆分剩余底物需要化学消旋的弊端。与化学还原不对称环酰亚胺的方法比，不需要引入手性胺，因此将有效的减小生产物料的成本和生产废水中有机物的含量，结合酶催化特有的反应条件温和、选择性高、能耗小等优点，是很有希望的取代现有化学工艺的新方法。目前存在的主要问题是猪肝酯酶的选择性不够高而且昂贵，其动物来源限制了催化剂的大规模获得与使用。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种新筛选的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101 CGMCC NO.4436。

本发明的目的之二在于提供一种上述的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101 CGMCC NO.4436的培养方法。

本发明的目的之三在于提供一种将上述的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101 CGMCC NO.4436作为生物催化剂应用的方法，即作为生物催化剂催化内消旋二酯（II）不对称水解产生(4S, 5R)-半酯（I）的制备方法。本发明所提供的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101 CGMCC NO.4436作为生物催化剂可以高选择性、高收率、低生产成本的催化合成(4S, 5R)-半酯。

本发明采用的技术方案

本发明的巧克力微杆菌细胞(Microbacterium chocolatum) SIT101是一种属于细菌类微杆菌属的菌株，该菌株是通过以下方法得到的，即从中国南方地区富含油脂的土壤中采集土样,以二甲酯（II）或其类似物为唯一碳源经过多轮富集培养后筛选得到的。

本发明的菌种具有如下的微生物学特征：

1、形态特征

本发明所得的巧克力微杆菌细胞为不规则的小杆菌，0.4~0.8 μm×1.0~3.0 μm，不常见分支，不形成菌丝体。

2、培养学特征

在酵母膏-蛋白胨-葡萄糖琼脂上菌落不透明，有光泽，橙色。

3、生理生化特征

（1）             革兰氏阳性杆状菌；好氧菌；

（2）             运动性：不运动；

（3）             接触酶试验：阳性；

（4）             硫化氢产生实验：阳性；

（5）             淀粉水解试验：弱阳性；

（6）             明胶液化试验：阴性；

（7）             甲基红试验：阴性

（8）             伏-普二氏试验（VP实验）：阴性

（9）             碳源同化 

阳性：麦芽糖、甘露糖、甘露醇、葡萄糖、葡萄糖酸

阴性：阿拉伯糖、N-乙酰葡糖胺、乙酸盐、己二酸盐、奎酸盐

（10）        生长最适宜温度：25～35℃；

根据生理生化试验和《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰细菌鉴定手册》，该菌为巧克力微杆菌（Microbacterium chocolatum），结合16S rDNA分子生物学鉴定，该细菌属于巧克力微杆菌（Microbacterium chocolatum）,但又与现有技术中报道的巧克力微杆菌有明显不同,其主要不同之处在于:可以作为生物催化剂，催化内消旋二酯（II）不对称水解产生(4S, 5R)-半酯（I），并具有较高的产率和良好的选择性（e.e.>99%）。

本发明的巧克力微杆菌细胞(Microbacterium chocolatum) SIT101于2010年12月8日在中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为CGMCC NO. 4436。

采用上述巧克力微杆菌作为生物催化剂催化内消旋二酯（II）不对称水解产生(4S, 5R)-半酯（I）的制备方法，其制备过程的反应过程示意图如图1所示，其制备过程包括下列步骤：

（1）、培养巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101，CGMCC NO.4436 

取4^oC保存的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101，CGMCC NO.4436斜面菌种，挑取一环接种至装有50ml培养基的250ml摇瓶中，在25～35^oC下，160～220 rpm振摇培养48～72 h，离心收获细胞；然后将所得的巧克力微杆菌菌体置于缓冲溶液中；

所述的培养基配方：葡萄糖15.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，MgSO₄ 1 g/L，pH 7.0；

所述的缓冲溶液为磷酸钾缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液，pH值为6～9；

（2）、向步骤（1）中含有巧克力微杆菌的缓冲溶液中加入内消旋二酯(II)，经巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101，CGMCC NO.4436静息细胞催化不对称水解反应，控制反应温度为10～60℃，反应时间为3～120小时；

上述反应过程中所用的巧克力微杆菌细胞量、内消旋二酯、缓冲溶液的量按微杆菌细胞量:内消旋二酯:缓冲溶液为5～150 g(湿重)：10～200mmol：1L计算；

（3）、将步骤（2）所得的反应液进行分离、纯化，最终得到目标产物(4S, 5R)-半酯(I)。

上述的制备(4S, 5R)-半酯(I)的方法中，由于反应底物在水中的溶解度较低，在反应体系中还可选择性加入体积为反应体系体积0.2%～50%的有机助溶剂来增大其溶解度，提高反应物的浓度。所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、异辛烷、正己烷、环己烷中的一种或一种以上的混合物。

本发明的有益效果

本发明采用新的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101 CGMCC NO.4436，作为生物催化剂对内消旋的二酯（II）进行不对称水解制备出高光学纯度(4S, 5R)-半酯（I），由于本发明的生物催化剂易于制备、反应条件温和，最终产率可达90%以上，光学纯度e.e.大于99%。与现有技术，如日本学者公开的用猪肝酯酶不对称水解前手性二丙酯得到光学活性单酯，产率仅为85%，ee值仅为75%；陈芬儿等人公开的用Eupergit C固定化的猪肝酯酶催化前手性二甲酯水解，产物手性单甲酯产率为90%，ee值为91%等相比，本发明的最终产物的产率及对映体过量值（e.e.值）均有明显的提高。

另外由于本发明的生物催化剂巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101 CGMCC NO.4436，其培养方便，即反应的原料易得，反应条件温和，从而降低生产成本，有利于进一步的工业化生产。

附图说明

图1、本发明的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101作为催化剂催化内消旋二酯（II）不对称水解产生(4S, 5R)-半酯（I）的反应示意图，其中的R为C₁～C₃烷基、C₁～C₃烯基；Ar为苯基。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步详细描述，但并不限制本发明。

本发明所用的试剂皆为分析纯或化学纯规格。

本发明用的二酯是通过二酸与相应的醇在酸（如硫酸）催化下合成，消旋的半酯是利用二酸的酸酐与相应的醇在碱（如三乙胺）催化作用下合成的。

SR半酯的检测方法：手性液相色谱（色谱柱为Chiralcel OJ-H色谱柱，流动相为正己烷：异丙醇：三氟乙酸=92：8：0.1，紫外检测波长220nm，流速0.5 ml/min）；

本发明中所指的细胞羧酸酯酶活力单位的定义为：在30^oC，pH 8.0的条件下，每分钟催化内消旋二甲酯(II)水解生成1.0 μmol (4S, 5R)-半甲酯（I）所需的细胞量即为1个活力单位。

实施例1

巧克力微杆菌的培养

新鲜斜面培养基：葡萄糖15.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，MgSO₄ 1g/L，琼脂15-20 g/L，pH 7.0。

斜面种子的培养

取冰箱4^oC保存的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101 CGMCC NO.4436菌种，取出后接种到上述所述的新鲜斜面培养基上，在30 ^oC下培养48 h，得巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101斜面种子，并将其保存在4^oC的冰箱中。

发酵培养基：葡萄糖15.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，MgSO₄ 1 g/L，pH 7.0。

取4^oC保存的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101 CGMCC NO.4436斜面种子，挑取一环接种至装有50 ml发酵培养基的250 ml摇瓶中，在30^oC下，160 rpm振摇培养48 h，以10000 g离心约15 min得到静息细胞。

最终所得的发酵液产羧酸酯酶活力约为20～50 U/L，细胞浓度约10～20 g (湿重)/L，单位细胞的酶活力约为2 U/g湿细胞。

实施例2

内消旋二甲酯的制备

将内消旋的二酸 (28.32 g, 0.08 mol), 无水甲醇 (16.2 mL, 0.4 mol),

浓硫酸 (0.4 mL, 7.5 mmol)和苯(65 mL)在搅拌条件下加热回流6 h。减压除掉溶剂，剩余物加入水（40 mL）和乙酸乙酯（40 mL），有机相分层后，水相再用乙酸乙酯(10 mL)萃取3次。合并乙酸乙酯相，分别用2 M Na₂CO₃ (共3次，每次5 ml)和水(共4次，每次5 ml)洗涤。之后用无水硫酸钠干燥，减压除掉溶剂后得到内消旋二甲酯（II），收率约为92%，纯度为99%。

取湿重1.0 g的实施例1所得的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101静息细胞，悬浮于9.5ml磷酸钠盐缓冲溶液中（0.1 M, pH 8.0），加入上述所得的内消旋二甲酯0.1 mmol，再加入0.5 ml二甲基亚砜，反应混合物在30°C、160 r/min的恒温摇床上振摇反应，间歇取样以乙酸乙酯萃取，用手性液相色谱分析产物的对映体过量值和产率，反应24小时后，(4S, 5R)-半甲酯的产率为95%，对映体过量值(e.e.)大于99%。

实施例3

取湿重1.0 g的实施例1所得的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101静息细胞，悬浮于9.5 ml磷酸钠盐缓冲溶液中（0.1 M, pH 8.0），加入实施例中所得的内消旋二甲酯0.1 mmol，再加入0.5 ml甲醇，反应混合物在30°C、160 r/min的恒温摇床上振摇反应，间歇取样以乙酸乙酯萃取，用手性液相色谱分析产物的对映体过量值和产率，反应24小时后，(4S, 5R)-半甲酯的产率为87%，对映体过量值(e.e.)大于99%。

实施例4

取湿重1.0 g的实施例1所得的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101静息细胞，悬浮于10 ml磷酸钠盐缓冲溶液中（0.1 M, pH 8.0），加入实施例1所得的内消旋二甲酯0.1 mmol，再加入10 ml异辛烷，反应混合物在30°C、160 r/min的恒温摇床上振摇反应，间歇取样，用手性液相色谱分析产物的对映体过量值和产率，反应24小时后，(4S, 5R)-半甲酯的产率为91%，对映体过量值(e.e.)大于99%。

实施例5

内消旋二丙酯的制备

将内消旋的二酸 (28.32 g, 0.08 mol), 无水正丙醇 (29.9 mL, 0.4 mol),

浓硫酸(0.4 mL, 7.5 mmol)和苯(60 mL)在搅拌条件下加热回流8 h。减压除掉溶剂，剩余物加入水（40 mL）和乙酸乙酯（40 mL），有机相分层后，水相再用乙酸乙酯(10 mL)萃取3次。合并乙酸乙酯相，分别用2 M Na₂CO₃ (共3次，每次5 ml)和水(共4次，每次5 ml)洗涤。之后用无水硫酸钠干燥，减压除掉有机相后得到内消旋二丙酯（II），收率为89%，纯度为97%。

取湿重1.0 g的实施例1所得的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101静息细胞，悬浮于9.5 ml磷酸钠盐缓冲溶液中（0.1 M, pH 8.0），加入上述所得的内消旋二丙酯0.1 mmol，再加入0.5 ml二甲基亚砜，反应混合物在30°C、160 r/min的恒温摇床上振摇反应，间歇取样以乙酸乙酯萃取，用手性液相色谱分析产物的对映体过量值和产率，反应24小时后，(4S, 5R)-半丙酯的产率为52%，对映体过量值(e.e.)大于99%。

实施例6

取湿重10 g的实施例1所得的巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101静息细胞，悬浮于95 ml磷酸钠盐缓冲溶液中（0.1 M, pH 8.0），加入实施例1所得的3 mmol内消旋二甲酯，再加入5 ml二甲基亚砜，反应混合物在30°C、160 r/min的恒温摇床上振摇反应，反应48小时后，加入2 mol/L盐酸调水相pH值到2.0，用乙酸乙酯萃取酸化液3次，每次30 ml。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，之后减压蒸干有机相得到(4S, 5R)-半甲酯，其收率为90%，纯度为98%，对映体过量值(e.e.)大于99%。

以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种巧克力微杆菌(Microbacterium chocolatum) SIT101，CGMCC NO.4436。

2.如权利要求1所述的巧克力微杆菌SIT101的培养方法，其特征是巧克力微杆菌SIT101培养过程中以葡萄糖为碳源、以酵母膏和蛋白胨为氮源，在pH为7.0、温度为25～35℃下培养48～72h。

3.利用权利要求1所述的巧克力微杆菌作为生物催化剂催化内消旋二酯（II）不对称水解产生(4S, 5R)-半酯(I)的制备方法，其特征在于其制备过程具体包括下列步骤：

（1）、培养巧克力微杆菌SIT101，然后将所得的上述巧克力微杆菌菌体置于缓冲溶液中；

（2）、向上述含有巧克力微杆菌菌体的缓冲溶液中加入内消旋二酯(II)，其经巧克力微杆菌SIT101催化不对称水解反应，反应过程控制反应温度为10～60℃，反应时间为3～120小时；

上述反应过程中所用的巧克力微杆菌细胞量、内消旋二酯、缓冲溶液的量按微杆菌细胞量湿重:内消旋二酯:缓冲溶液为5～150g：10～200mmol：1L计算；

（3）、将步骤（2）所得的反应液进行分离、纯化，最终得到目标产物(4S, 5R)-半酯(I)；

上述所述的内消旋二酯(II)及(4S, 5R)-半酯(I)的结构式分别如下：

                                                          

     

    

其中的R为C₁～C₃烷基、C₁～C₃烯基；Ar为苯基。

4.如权利要求3所述的利用巧克力微杆菌作为生物催化剂催化内消旋二酯（II）不对称水解产生 (4S, 5R)-半酯(I)的制备方法，其特征在于制备步骤（1）中所述的缓冲溶液为磷酸钾缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液，其pH值为6～9。

5.根据权利要求3或4所述的利用巧克力微杆菌作为生物催化剂催化内消旋二酯（II）不对称水解产生 (4S, 5R)-半酯(I)的制备方法，其特征在于反应体系中选择性加入体积为反应体系体积0.2%～50%的有机助溶剂；

所述有机助溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、异辛烷、正己烷、环己烷中的一种或一种以上的混合物。

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