CN103911418A

CN103911418A - 一种利用亚麻刺盘孢霉静息细胞高效催化去氢表雄酮的方法

Info

Publication number: CN103911418A
Application number: CN201410094309.1A
Authority: CN
Inventors: 许正宏; 史劲松; 李会; 张汝金; 尹思淇
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2014-07-09

Abstract

本发明公开了一种利用亚麻刺盘孢（Colletotrichumlinli）ST-1的静息细胞高效转化去氢表雄酮的方法。本发明将静息细胞转化及底物助溶相结合，在提高底物利用率的同时也提高了产物得率。磷酸钠缓冲液为转化反应提供了稳定的pH环境，吐温80助溶的同时又可促进菌体的生长，利用新的转化工艺，产物摩尔得率较传统转化方法提高了78.3%，产物的转化率也从传统方法的67.3%提高到了90.4%。

Description

一种利用亚麻刺盘孢霉静息细胞高效催化去氢表雄酮的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini ) ST-1静息细胞高效催化去氢表雄酮的方法。

背景技术

三羟基雄甾烯酮（7α,15α-diOH-DHEA）是合成新型口服避孕药屈螺酮的重要前体，传统的化学合成方法，步骤繁杂，工艺复杂，且大量有机溶剂的使用也给环境带来了很大的污染。现在通过微生物法催化底物去氢表雄酮（DHEA）就可以一步得到目的产物三羟基雄甾烯酮。简化了反应步骤，同时也减少了有机溶剂的使用。

但是现有的菌株对底物的转化也存在一定的局限。首先，原始菌株对底物的转化能力较差，并且转化过程存在较多的副产物；其次，去氢表雄酮是疏水性的白色粉末，其在水中的溶解度极低，所以大大限制了转化时底物的投料浓度和底物的转化率。

发明内容

本发明的目的在于针对现有三羟基雄甾烯酮生产过程中的技术难点及存在的问题，对现有的转化工艺进行改良，希望可以提高底物的利用率，节约生产成本。本发明所述的亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini ) ST-1保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6051，分类命名为亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini ) ，保藏日期为2012年4月24日。

具体的步骤如下：

1）静息细胞的制备

从斜面挑取适量菌丝接种至种子培养基中（250mL的锥形瓶装液量为30mL），在30℃，220rpm的条件下，摇床培养72 h，，然后按8 %-10 % V/V的接种量转接至新的种子培养基中（500mL的锥形瓶装液量为100mL）同上述摇床培养条件，继续培养24 h得到均匀的二级种子，再将二级种子按8 %-10 % V/V的接种量转接至发酵培养基相同摇床条件培养24 h，此时菌体处于对数生长期，离心，菌体用等体积pH 7.0的浓度为0.01M的磷酸钠缓冲液洗涤2遍（以除去发酵液中的其余成分），收集菌体，重新悬浮于pH5.5-7.5的磷酸钠缓冲液中，缓冲液浓度为0.02-0.2 M，制备成细胞浓度为10-12 g/L的静息细胞悬液，待转化使用。

2）静息细胞转化

取适量（1）中所述的静息细胞悬液，投加底物，底物终浓度为10 g/L，同时添加1 %-2 %的吐温80作为助溶剂（吐温80对底物进行预溶后投料，转化效果一样），30 ℃、220 r/min的摇床条件下转化36 h。

3）生长细胞转化

将步骤（1）中制备好的细胞液体培养物以8 %-10 %（w/w）的接种量接入发酵培养基，装液量 30mL/ 250mL，于30℃，220 r/min的转速下培养24 h后，投加底物去氢表雄酮（DHEA）300 mg，30 ℃、220 r/min的摇床条件下继续转化36 h。

4）产物的检测

均匀取1mL步骤（2/3）中转化液用800 μL的乙酸乙酯进行萃取（可适当利用超声和震荡来提高萃取效率），然后12000 r/min下离心2min，吸取上清液，如此反复萃取5遍，收集上清液，烘干，用8倍体积乙腈复溶，后用0.22 μm的有机膜过滤除杂，最后采用HPLC的方法检测转化结果。高效液相色谱（Agilent TC-C18，4.6×250 mm, 5 μm）的检测条件，流动相：乙腈：水（7:3）；柱温30 ℃；检测波长206 nm；流速0.5 mL/min；进样量10μL。

其中

步骤（1）中所述的固体培养基的成分及配比为：土豆 200 g/L；葡萄糖20 g/L；琼脂20 g/L；pH自然，补充蒸馏水至1 L，自然pH，121℃下高压蒸汽灭菌20min；

步骤（1）所述种子培养基的成分及配比为：葡萄糖15 g/L；酵母粉15 g/L；玉米浆3 g/L；豆饼粉10 g/L;补充蒸馏水至1 L，自然pH，121℃下高压蒸汽灭菌20min；

步骤（1）所述发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖15 g/L；酵母粉15 g/L；玉米浆3 g/L；自然pH，121℃高压蒸汽下灭菌20 min。

本发明所述的利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini ) ST-1 静息细胞转化高效转化去氢表雄酮的方法，包括静息细胞的制备及其转化条件优化。在静息细胞转化过程中，除添加2 %的吐温80以外，无需添加其他辅底物，实验发现吐温80在转化过程中不仅可以用作助溶剂也可以代替葡萄糖用作碳源促进菌体生长。此法可以显著提高底物的利用率和产物得率，同时也降低了副产物的量，便于后续产物分离提取，此方法对甾体生物转化方面的研究具有重要意义。

附图说明

图1 为本发明的添加2 %（w/v）吐温80对亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini )ST-1静息细胞生长曲线的影响

【有益效果】

静息细胞转化体系营养单一，可避免杂菌生长；磷酸盐的缓冲体系可调节pH，转化过程酶活比较稳定，保证了良好的转化能力；吐温80不仅具有良好的底物助溶能力并且可以促进菌体生长，整个转化过程底物的利用率和产物得率都有了明显提高，且副产物的量也降低了。

具体实施方式

实施例1 亚麻刺盘孢(Colletotrichum linli )ST-1 生长细胞转化与静息细胞转化比较

（1）制备亚麻刺盘孢的细胞液体培养物

挑取适量斜面培养基上的亚麻刺盘孢菌丝，接种于装有30 mL 种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃下，置于摇床上以220 r/min的转速培养72 h进行活化，然后将一级种子以（8%-10% V/V）的接种量接入新的种子培养基（装有100 mL 种子培养基的500 mL锥形瓶中）同上摇床条件进行扩增培养24 h，得到相当浓度的细胞液体培养物。

（2）制备亚麻刺盘孢的静息细胞悬液

将步骤（1）中制备好的细胞液体培养物以10 %（w/w）的接种量接入发酵培养基，装液量 100 mL/ 500mL，于30℃，220 r/min的转速下培养24 h，离心收集菌体，用pH 7.0的浓度为0.01M的磷酸钠缓冲液洗涤菌体 2遍（除去发酵液中的其余成分），收集菌体，悬浮于pH 6.5的磷酸钠缓冲液中，缓冲液浓度为0.2M，制备成细胞浓度为10-12 g/L的静息细胞悬液，待转化使用。

（3）静息细胞转化

取（2）中的静息细胞悬液30 mL装于250mL锥形瓶中，投加底物去氢表雄酮（DHEA）300 mg，30 ℃、220 r/min的摇床条件下转化36 h后，用HPLC的方法检测底物的转化情况。

（4）生长细胞转化

将步骤（1）中制备好的细胞液体培养物以10 %（w/w）的接种量接入发酵培养基，装液量 30mL/ 250mL，于30℃，220 r/min的转速下培养24 h后，投加底物去氢表雄酮（DHEA）300 mg，30 ℃、220 r/min的摇床条件下继续转化36 h，用HPLC的方法检测底物的转化情况。

表1 生长细胞与静息细胞转化情况比较

实施例2 pH对亚麻刺盘孢(Colletotrichum linli ) ST-1静息细胞转化的影响

（1）制备亚麻刺盘孢的细胞液体培养物

同实施例1中的（1）

（2）制备亚麻刺盘孢的静息细胞悬液

将步骤（1）中制备好的细胞液体培养物以8-10%（w/w）的接种量接入发酵培养基，装液量 100 mL/500mL，于30℃，220 r/min的转速下培养24 h，离心收集菌体，用pH 7.0的浓度为0.01M的磷酸钠缓冲液洗涤菌体 2遍（除去发酵液中的其余成分），收集菌体，分别悬浮于pH 5.5/6.5/7.5的磷酸钠缓冲液中，缓冲液浓度为0.2M，制备成细胞浓度为10-12 g/L的静息细胞悬液，待转化使用。

（3）静息细胞转化

取（2）中的细胞悬液30 mL装于250mL锥形瓶中，投加底物去氢表雄酮（DHEA）300 mg，30 ℃、220 r/min的摇床条件下转化36 h后，用HPLC的方法检测底物的转化情况。

表2 缓冲液pH对亚麻刺盘孢(Colletotrichum linli ) ST-1静息细胞转化的影响

实施例3 缓冲液的浓度对亚麻刺盘孢(Colletotrichum linli ) ST-1静息细胞转化的影响

（1）制备亚麻刺盘孢的细胞液体培养物

同实施例1中的（1）

（2）制备亚麻刺盘孢的静息细胞悬液

将步骤（1）中制备好的细胞液体培养物以8-10%（w/w）的接种量接入发酵培养基，装液量 100 mL/500mL，于30℃，220 r/min的转速下培养24 h，离心收集菌体，用pH 7.0的浓度为0.01M的磷酸钠缓冲液洗涤菌体 2遍（除去发酵液中的其余成分），收集菌体，分别悬浮于浓度为0.02M/0.05M/0.1M/0.2M的磷酸钠缓冲液中（pH均为6.5），制备成细胞浓度为10-12 g/L的静息细胞悬液，待转化使用。

（3）静息细胞转化

表3 缓冲液浓度对亚麻刺盘孢(Colletotrichum linli ) ST-1静息细胞转化的影响

实施例4 吐温80对亚麻刺盘孢(Colletotrichum linli ) ST-1静息细胞和生长细胞转化的影响

（1）制备亚麻刺盘孢的细胞液体培养物

同实施例1中的（1）

（2）制备亚麻刺盘孢的静息细胞悬液

同实施例1中的（2）

（3）静息细胞转化

取（2）中的细胞悬液30 mL装于250mL锥形瓶中，投加底物去氢表雄酮（DHEA）300 mg和2 % 的吐温80，于30 ℃、220 r/min的摇床条件下转化36 h后，用HPLC的方法检测底物的转化情况。

（4）生长细胞转化

将步骤（1）中制备好的细胞液体培养物以10 %（w/w）的接种量接入发酵培养基，装液量 30mL/ 250mL，于30℃，220 r/min的转速下培养24 h后，投加底物去氢表雄酮（DHEA）300 mg和2 % 的吐温80，于30 ℃、220 r/min的摇床条件下继续转化36 h，用HPLC的方法检测底物的转化情况。

表4 吐温80对生长细胞转化与静息细胞转化过程影响比较

实施例5 吐温80浓度对亚麻刺盘孢(Colletotrichum linli ) ST-1静息细胞转化的影响

（1）制备亚麻刺盘孢的细胞液体培养物

同实施例1中的（1）

（2）制备亚麻刺盘孢的静息细胞悬液

同实施例1中的（2）

（3）静息细胞转化

取（2）中的细胞悬液30 mL装于250mL锥形瓶中，投加底物去氢表雄酮（DHEA）300 mg，同时分别添加1 %、1.5 %和2 % 的吐温80，于30 ℃、220 r/min的摇床条件下转化36 h后，用HPLC的方法检测底物的转化情况。

表5 吐温80浓度对亚麻刺盘孢(Colletotrichum linli ) ST-1静息细胞转化的影响

实施例6 吐温80对菌体生物量的影响

（1）制备亚麻刺盘孢的细胞液体培养物

同实施例1中的（1）

（2）制备亚麻刺盘孢的静息细胞悬液

同实施例1中的（2）

（3）生物量的测定

在（2）中的细胞悬液中添加2 %（w/v）的吐温80，摇床培养48 h，每隔6 h取1mL均匀的细胞悬液于已干燥称重的2mL离心管中，用无菌水洗涤菌体两遍，离心后去上清，于烘箱烘干后称重。每次取样设3-4个平行组。菌体的生物量用细胞干重（g/L）表示（附图1）。

Claims

1.一种利用亚麻刺盘孢ST-1静息细胞高效转化底物去氢表雄酮生产三羟基雄甾烯酮的方法，其特征在于，底物投料时添加了2 % 的吐温80，具体的步骤如下：

将生长至对数生长期的菌液离心，菌体用0.01M的磷酸钠缓冲液洗涤2遍，收集洗涤过后的菌体悬浮于pH 6.5磷酸钠缓冲液中，进行下一步的转化实验，转化过程添加2 % 的吐温80。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亚麻刺盘孢ST-1为本实验室保藏的亚麻刺盘孢ST-1，该菌株命名为Colletotrichum linli，于2012年4月24日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学研究院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6051。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述静息细胞为非固定化细胞，并且用0.01M的磷酸钠缓冲液洗涤过2遍，除去了原有的培养基成分。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用新的优化后的转化工艺，产物摩尔得率较传统转化方法提高了78.3 %，底物的转化率也从传统方法的67.3 % 提高到了90.4 % 。