CN104371950B - 耐氧梭菌及其在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用 - Google Patents
耐氧梭菌及其在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种耐氧梭菌Aeroto‑AUH‑JLC108，保藏号为CGMCC No.9550及其在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用。属于微生物技术领域。应用包括以下步骤：（1）耐氧菌株Aeroto‑AUH‑JLC108的培养；（2）底物黄豆苷原与耐氧菌株Aeroto‑AUH‑JLC108共培养：将耐氧菌株Aeroto‑AUH‑JLC108种子液转接到BHI液体培养基中，同时加入黄豆苷原进行共培养；（3）代谢产物的分离纯化。本发明耐氧梭菌Aeroto‑AUH‑JLC108使黄豆苷原可在有空气氧条件下高效转化，转化性能稳定，且方法简单，解决了去氧甲基安哥拉紫檀素难于在有空气氧条件下规模化生产的难题。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是一种梭菌及其在去氧甲基安哥拉紫檀素生物合成中的应用。
背景技术
大豆异黄酮（soy isoflavones）是大豆等少数豆科植物在其生长过程中形成的一类次生代谢产物，迄今已从大豆中分离了12种异黄酮成分，包括游离型苷元（aglycone）和结合型糖苷（glucosides）两大类，天然大豆中95%以上的异黄酮为结合型糖苷，共9种；另外3种为大豆异黄酮苷元，包括黄豆苷原（daidzein）、染料木素（genistein）和黄豆黄素（glycitein），其中黄豆苷原和染料木素占大豆异黄酮总苷元的95%以上，为大豆异黄酮苷元的主要成分。大量流行病学研究证实，大豆异黄酮具有抗氧化、抗癌、降低心脑血管发病率、减少骨质流失以及缓解妇女更年期综合症等多种生理功能。
动物实验结果表明，大部分以结合型糖苷存在的异黄酮在胃肠道微生物菌群作用下被水解，脱去糖基转变为游离型苷元才被胃肠粘膜直接吸收，被吸收的染料木素和黄豆苷原再进一步被细菌代谢为各种不同产物。与染料木素相比，黄豆苷原在人体内的代谢研究更为详尽，迄今从人体尿液和血液中已检测到的黄豆苷原的代谢产物包括：二氢黄豆苷原（dihydrodaidzein，简称DHD）、四氢黄豆苷原（tetrahydrodaidzein，简称THD）、去氧甲基安哥拉紫檀素（O-desmethylangolensin 简称O-Dma）和雌马酚（equol）等，其中O-Dma 和雌马酚是黄豆苷原体内代谢的两个终产物。由于雌马酚的强抗氧化和抗癌活性，以往对雌马酚研究报道最多。大量流行病学研究表明，人群中只有大约30～50%的个体，其肠道微生物菌群能将摄入体内的黄豆苷原转化为雌马酚，而80～90%的个体则是将摄入体内的黄豆苷原转化为O-Dma。因而，最近几年研究人员开始关注O-Dma这一开环产物。
Axelson等最早于1982年在人体尿液中检测到黄豆苷原代谢产物O-Dma（BiochemJ 1982）其后又在血清和血浆（Setchell et al, Am J Clin Nutr 1998）、乳汁（Franke &Custer, Clin Chem 1996）、羊水和脐带血（Adlercreutz et al, Am J Obstet Gynecol1999）以及前列腺液（Hedlund et al, J Nutr 2005）等中检测到O-Dma。不同人群或不同个体体内O-Dma含量差异较大。根据Valentin等报道，受试的美国人尿液和血液组织中O-Dma含量分别为4.34 mg/L和1.0 mg/L（J Expo Anal Environ Epidemiol 2003），而Kunisue等发现受试的日本人尿液中的O-Dma含量则高达110 mg/L（J Agri Food Chem 2010）。
体外研究结果表明，O-Dma不仅与人体雌激素受体ERa和ERb的亲和力明显高于其前体黄豆苷原，而且与ERa结合后在诱导基因转录上O-Dma也强于黄豆苷原。此外，当浓度高于10 微摩尔/升时，O-Dma能明显抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长（Kinjo et al, Biol PharmBull 2004）；Hedlund 等研究结果证实，O-Dma可明显抑制前列腺癌细胞的增长（Prostate2006）。2008年日本学者比较了O-Dma与雌马酚在体内外对切除子宫小鼠的骨密度及脂类代谢的影响，发现O-Dma与雌马酚一样，均能促进脂类物质的正常代谢，但在体外破骨细胞生长方面，O-Dma则只表现轻微抑制作用（Ohtomo et al, Eur J Nutr 2008）。此外，O-Dma还被报道有免疫调节作用（Gredel et al, Food Chem Toxicol 2008）以及抑制瘦素分泌的功能（Niwa et al, phytochem Lett 2010）。我们通过对比黄豆苷原和O-Dma对二苯代苦味酰基自由基（DPPH）的体外清除作用时发现，较低浓度（0.33-1.33毫摩尔/升）下，O-Dma和黄豆苷原对DPPH自由基的清除作用无显著差异；但当浓度升高到3.33毫摩尔/升时，O-Dma对DPPH自由基的体外清除作用极显著高于其亲本化合物黄豆苷原（XL Lianget al, J AgricFood Chem 2010）。
专利文献CN102391969A公开了一种梭菌AUH-JLC140及其在去氧甲基安哥拉紫檀素生物合成中的应用，其利用肠道梭菌菌株AUH-JLC140转化底物黄豆苷原合成O-Dma，由于细菌菌株AUH-JLC140为严格厌氧细菌菌株，该菌株只能在严格厌氧条件下完成转化过程。而长期维持厌氧环境需要大量的经济投入。文献“大豆异黄酮转化菌株的分离、耐氧驯化及耐氧机制研究”（ 李慧2013硕士论文，河北农业大学）对菌株AUH-JLC140进行了长期耐氧驯化，得到AUH-JLC140耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140，其能在有空气氧条件下生长和转化底物黄豆苷原为O-Dma，但由于菌株AUH-JLC140耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC140在菌体外壁存在较厚的以多糖为主要成分的抗氧化“保护膜”结构（李慧2013硕士论文，河北农业大学），导致耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC140在有空气氧条件下的转化效率较低，不具有可应用性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108及其在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用，上述菌株能将底物黄豆苷原（daidzein）在自然条件（即有空气氧条件下）下高效转化为去氧甲基安哥拉紫檀素（O-desmethylangolensin，简称O-Dma），且转化性能稳定，解决了O-Dma在有空气氧条件下的规模化生物合成的问题，对O-Dma 新药理活性及新药研发具有极大的推动作用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种耐氧梭菌（Clostridium sp.）Aeroto-AUH-JLC108，保藏号为CGMCC No.9550。
耐氧梭菌Clostridium sp. Aeroto-AUH-JLC108是严格厌氧梭菌Clostridiumsp. AUH-JLC108（KM277367）经过耐氧驯化后得到的、既能在有空气氧条件下生长又能高效转化黄豆苷原为O-Dma的耐氧突变株。梭菌菌株Clostridium sp. AUH-JLC108 是从鸡粪样中分离得到的一株革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株，该菌株在厌氧工作站内能将底物黄豆苷原开环转化为O-Dma。有关O-Dma微生物生物合成途径如下所示：
本发明中的耐氧梭菌Clostridium sp. Aeroto-AUH-JLC108菌株（简称耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108）已于2014年08月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为 CGMCC No.9550。中国科学院微生物研究所菌种保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
耐氧梭菌Clostridium sp. Aeroto-AUH-JLC108菌的分类学特征为：
菌落直径3.5~5.5 毫米，菌落边缘整齐，中央稍黄白但无明显凸起，菌落外围稍透明，在BHI液体培养基液体中菌体为黏连的短杆状，该菌株革兰氏染色呈阳性；
该菌株淀粉水解活性阳性，吲哚反应阳性，脲酶阴性，可同时产硫化氢和氢气，利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、甘油、棉籽糖能力强，但对甘露醇、乳糖、松三糖、海藻糖的利用能力较弱。
本发明还提供了耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用。
应用包括下述步骤：
（1）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的培养；
（2）底物黄豆苷原与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108共培养；
（3）代谢产物的分离纯化。
其中，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的培养方法为：将低温冷冻保存的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108融化并按10～15%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃下培养24小时；再以10%接种量将试管中的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108重新转接到新鲜BHI液体培养基中，培养12～18小时作为种子液；
底物黄豆苷原与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108共培养方法为：
将耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的种子液按10～15%接种量转接到BHI液体培养基中培养，然后加入底物黄豆苷原，使得黄豆苷原在培养基中的浓度不超过2.0毫摩尔/升，在普通生化培养箱内培养2～3天，即可将底物黄豆苷原高效转化为去氧甲基安哥拉紫檀素（O-Dma）；底物黄豆苷原浓度为40～60毫摩尔/升。
代谢产物的分离纯化采用下述方法：
用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离制备O-Dma。
其中，所述耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的获得包括下述步骤：
（1）公鸡粪样的采集与培养
用已灭菌的棉签挑取新鲜粪样，放入5毫升新鲜BHI液体培养基中，置厌氧工作站内在37°C温度下培养24小时，作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；
（2）转化菌株的分离培养
①单一菌落式分离培养
将新鲜BHI液体培养基内的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10–1、10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7、10–8，再分别将100微升浓度分别为10–5、10–6、10–7、10–8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养24～48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号；
②单菌落的混合培养及转化活性测定
将已编号的单菌落随机取10个为一组，将每组的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1毫升BHI液体培养基的同一试管内，再分别加入10毫摩尔/升黄豆苷原母液10微升，在厌氧工作站内培养3天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成；
③特定功能微生物菌落的分离筛选
一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管中的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 毫升BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入10毫摩尔/升的底物黄豆苷原母液10微升，共同培养3天后，取100微升培养液加入1000微升乙酸乙酯进行提取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出有转化活性的10个菌落的混合培养物中能够开环转化底物黄豆苷原的单菌落。我们将其命名为菌株AUH-JLC108。
（3）菌株AUH-JLC108的纯化培养、菌种鉴定与保藏
①单菌落的纯化培养与菌种保藏
将筛选出的具有转化功能的菌落或菌苔在BHI固体培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，重复至少3次以上，确保长出的单菌落形态一致。将纯化后的单菌落接种到1毫升BHI液体培养基中，培养24小时取菌液150微升，加入到盛有500微升事先已灭菌的10%脱脂奶粉的冻存管中，混匀后在其表面加2毫米厚事先已灭菌的液体石蜡，再将其保藏在-80℃的超低温冰箱中，对低温保藏的功能微生物菌株定期进行复壮培养和转化活性测定。
②对分离出的特定功能微生物菌株进行菌种鉴定
以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R
（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）为引物，对16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析。通过BLAST比对，菌株AUH-JLC108与菌株Clostridiumorbiscindens strain NML 00-A-095（AY730664）相似性最高，其16S rDNA序列相似性为98.1%，与Clostridiumviride strain T2-7（NR026204）相似性为96.2%。因而，将该功能菌株初步鉴定为梭菌属菌株，并将该功能菌株命名为AUH-JLC108。菌株AUH-JLC108的16S rDNA序列已上交美国NCBI核苷酸库，获得菌株AUH-JLC108的注册号（Accession Number）为 KM277367。
（4）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的获得
将在厌氧工作站内培养24 小时生长至指数增长期的严格厌氧梭菌AUH-JLC108以10%接种量接种到事先准备好的驯化培养基。初始的驯化培养基组成为：BHI培养基中添加0.15% L-半胱氨酸和0.15%抗坏血酸（Vc）。培养基中Vc从0.15%依次降低（每次降低0.01～0.02%）、L-半胱氨酸从0.15%依次降低（每次降低0.01～0.02%），待生长稳定之后（转接5-10代），转接到下一个梯度继续驯化，依次类推，逐渐将培养基中Vc和L-半胱氨酸含量降低为零。在转接过程中，用HPLC跟踪测定，检测底物黄豆苷原被转化情况。最终获得在有空气氧条件下既能生长又能将黄豆苷原转化为O-Dma的耐氧突变株，我们将其命名为耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC108，以下简称菌株Aeroto-AUH-JLC108，菌株Aeroto-AUH-JLC108与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108或耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108为同一菌株。
菌株AUH-JLC108耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC108在菌体外壁存在一层非常薄的以多糖为主要成分的抗氧化“保护膜”结构，不会对有空气氧条件下转化底物黄豆苷原生成O-Dma的转化率产生影响，由于耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的生长量较原出发菌株AUH-JLC108的增加了近3倍，使得该耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108在有空气氧条件下，对底物黄豆苷原的转化效率是原出发菌株AUH-JLC108在厌氧条件下的近3倍。同时，Aeroto-AUH-JLC108在有空气氧条件下的转化效率是已授权专利中报道的严格厌氧菌株AUH-JLC140在厌氧条件下的转化效率的3.3倍。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108使黄豆苷原可在有空气氧条件下高效转化，转化性能稳定，且方法简单，解决了去氧甲基安哥拉紫檀素难于在有空气氧条件下规模化生产的难题。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明实施例1中菌株AUH-JLC108转化底物黄豆苷原的高效液相色谱图；
图2为菌株AUH-JLC108转化底物黄豆苷原生成产物的紫外吸收图谱；
图3为耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108在有空气氧条件下代谢底物黄豆苷原后所生成的代谢产物纯品在手性柱上的高效液相色谱图；
图4为耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108对底物黄豆苷原的转化动态曲线；
图5为耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108对不同浓度底物黄豆苷原转化能力比较。
具体实施方式
实施例1
1、菌株AUH-JLC108的分离培养
（1）公鸡粪样的采集与培养
用已灭菌的棉签挑取公鸡新鲜粪便，放入5毫升新鲜BHI液体培养基中，置厌氧工作站内在37°C温度下培养24小时，作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；
（2）分离培养菌株AUH-JLC108
①单一菌落式分离培养
将新鲜BHI液体培养基内的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10–1、10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7、10–8，再分别将100微升浓度分别为10–5、10–6、10–7、10–8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养24～48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号；
②单菌落的混合培养及转化活性测定
将已编号的单菌落随机取10个为一组，将每组的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1毫升BHI液体培养基的同一试管内，再分别加入10毫摩尔/升黄豆苷原母液10微升，在厌氧工作站内培养3天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成；
③特定功能微生物菌落的分离筛选
一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管中的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 毫升BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入10毫摩尔/升的底物黄豆苷原母液10微升，共同培养3天后，取100微升培养液加入1000微升乙酸乙酯进行提取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，通过HPLC检测，最终确定出有转化活性的10个菌落的混合培养物中能够开环转化底物黄豆苷原的单菌落，我们将其命名为菌株AUH-JLC108（见附图1和附图2）。
2、菌株AUH-JLC108的纯化培养、菌种鉴定与保藏
①单菌落的纯化培养与菌种保藏
将筛选出的具有转化功能的菌落或菌苔在BHI固体培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，重复至少3次以上，确保长出的单菌落形态一致。将纯化后的单菌落接种到1毫升BHI液体培养基中，培养24小时取菌液150微升，加入到盛有500微升事先已灭菌的脱脂奶粉的冻存管中，混匀后在其表面加2毫米厚事先已灭菌的液体石蜡，再将其保藏在-80℃的超低温冰箱中，对低温保藏的功能微生物菌株定期进行复壮培养和转化活性测定。
②对分离出的特定功能微生物菌株进行菌种鉴定
以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R
（27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）为引物对16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析。通过BLAST比对，菌株AUH-JLC108与菌株Clostridiumorbiscindens strain NML 00-A-095（AY730664）相似性最高，其16S rDNA序列相似性为98.1%，与Clostridiumviride strain T2-7（NR026204）相似性为96.2%。因而，将该功能菌株初步鉴定为梭菌属菌株，并将该功能菌株命名为AUH-JLC108。菌株AUH-JLC108的16S rDNA序列已上交美国NCBI核苷酸库，获得菌株AUH-JLC108的注册号（Accession Number）为 KM277367。
3、耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的获得
将在厌氧工作站内培养24 h生长至指数增长期的严格厌氧梭菌AUH-JLC108以10%接种量接种到事先准备好的驯化培养基。初始的驯化培养基组成为：BHI培养基中添加0.15% L-半胱氨酸和0.15%抗坏血酸（Vc）。培养基中Vc从0.15%依次降低（每次降低0.01～0.02%）、L-半胱氨酸从0.15%依次降低（每次降低0.01～0.02%），待生长稳定之后（转接5～10代），转接到下一个梯度继续驯化，依次类推，逐渐将培养基中Vc和L-半胱氨酸含量降低为零。在转接过程中，用HPLC跟踪测定，检测底物黄豆苷原被转化情况。最终获得在有空气氧条件下既能生长又能将黄豆苷原转化为O-Dma的耐氧突变株，我们将其命名为耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108。
4、耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108在黄豆苷原有氧转化中的应用
（1）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的培养
将低温冷冻保藏的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108融化并按10～15%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃下培养24小时；再以10%接种量将试管中的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108重新转接到新鲜BHI液体培养基中，培养12～18小时作为种子液；
（2）底物黄豆苷原与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108共培养
分别将耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的种子液按10～15%接种量转接到BHI液体培养基中，同时加入黄豆苷原进行共培养；
（3）代谢产物纯品的制备方法；
用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱（8.0毫米×250毫米）在HPLC上收集代谢产物峰，收集液用旋转蒸发仪蒸干。
（4）代谢产物的分离纯化及对映体过量率（e.e.%）测定
经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集代谢产物。将收集的代谢产物蒸干后加入100%甲醇中，在手性柱上检测出峰情况，并根据峰面积计算对映体过量率。本发明中产物O-Dma经手性柱后分别在25.59分和30.22分出现两个物质峰（见附图3），经计算本发明中合成的O-Dma的对映体过量率(e.e.%)为88.3%。
实施例2
严格厌氧菌株AUH-JLC108的分离方法以及耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的获得方法同实施例1，
耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108在黄豆苷原转化中的应用包括下述步骤：
（1）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的培养
将–80℃低温保存的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108冻融后，按12%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在普通生化培养箱内37℃下培养15小时后菌体已大量沉于试管底物。再以10%接种量将试管中已长混浊的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，继续在37℃普通生化培养箱内培养12小时作为种子液；
（2）底物黄豆苷原与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108共培养
在超净台内将上述事先培养好的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的种子液按15%接种量转接到盛有液体培养基的输液瓶内，培养6小时后，加入60毫摩尔/升的黄豆苷原，使得培养基中黄豆苷原浓度为1.2毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养2.5天，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108可将底物黄豆苷原高效转化为O-Dma。
（3）用HPLC检测底物黄豆苷原被耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的转化情况
从上述输液瓶中取培养物100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入800微升100%甲醇溶液，经HPLC检测底物转化情况。
（4）代谢产物的分离纯化及对映体过量率（e.e.%）测定
经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集代谢产物。将收集的代谢产物蒸干后加入100%甲醇中，在手性柱上检测出峰情况，并根据峰面积计算对映体过量率。本发明中产物O-Dma经手性柱后分别在25.59分和30.22分出现两个物质峰（见附图3），经计算本发明中合成的O-Dma的对映体过量率(e.e.%)为88.3%。
实施例3
严格厌氧菌株AUH-JLC108的分离方法以及耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的获得方法同实施例1，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108在黄豆苷原有氧转化中的应用包括下述步骤：
（1）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的培养
将–80℃低温保存的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108冻融后，按14%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在普通生化培养箱内37℃下培养12小时后菌体大量沉落于试管底部。再以13%接种量将试管中已长混浊的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的塑料离心管中，继续在在普通生化培养箱内培养18小时作为种子液；
（2）底物黄豆苷元与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108共培养
在普通生化培养箱内将上述事先培养好的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的种子液按12%接种量转接到盛有液体培养基的输液瓶内培养，同时加入50毫摩尔/升的黄豆苷原，使得培养基中黄豆苷原浓度为1.0毫摩尔/升，在普通生化培养箱内培养2天，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108可在有空气氧条件下将底物黄豆苷原转化为O-Dma。
（3）用HPLC检测底物黄豆苷原被耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的转化情况
从上述输液瓶中取培养物100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入800微升100%甲醇溶液，经HPLC检测底物转化情况。
（4）代谢产物的分离纯化和结构鉴定
经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将输液瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集代谢产物O-Dma，在旋转蒸发仪上蒸干。
对制备的代谢产物O-Dma进行结构鉴定，鉴定方法及鉴定结果如下：
将旋转蒸发仪上蒸干后的代谢产物进行核磁共振氢谱（1HNMR）和碳谱（13C NMR）测定(Bruker AVANCE 400型超导核磁共振波谱仪)，溶剂采用丙酮-d6。通过谱图解析，并与文献报道中的O-Dma的核磁共振氢谱和碳谱进行对比分析（Wang et al, J MicrobiolBiotechnol, 2004），最终将该代谢产物准确鉴定为O-Dma。代谢产物的1H-NMR和13C-NMR结果如下：
（5）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108对底物黄豆苷原的转化动态
为了解耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108转化底物牛蒡苷元的速度，以便确定最佳转化时间，我们对耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108转化底物黄豆苷原的转化动态进行了测定，具体方法如下：
将事先培养好的种子液（培养方法同上所述）按10%接种量接种到盛有100毫升液体培养基的250毫升输液瓶内培养，同时加入20 毫摩尔/升的黄豆苷原1毫升，分别在普通生化培养箱内培养3小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时后取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸干后加入100微升100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况，根据不同培养时间底物和产物浓度绘制菌株转化动态（见附图4），由图4可知，底物加入6小时后即开始有产物O-Dma被生成，继续培养6 小时后，所加入的底物黄豆苷原全部被转化为O-Dma，第15～18小时产物量基本不再上升。
（6）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108对不同浓度底物黄豆苷原最大转化能力测定
以10%接种量将事先准备好的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的种子液接种在新鲜BHI液体培养基中培养5小时后，加入不同浓度的底物黄豆苷原，并继续在普通生化培养箱内共同培养3天，然后用等体积乙酸乙酯对培养物进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物黄豆苷原被转化情况，并根据标准曲线和出峰峰面积计算转化率（转化率=产物浓度/（剩余底物浓度+产物浓度）×100%）。结果表明，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108对浓度为1.2毫摩尔/升和1.6毫摩尔/升的黄豆苷原的平均转化率分别为98.77%和87.83%；当底物浓度增至2.0毫摩尔/升时，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108对底物黄豆苷原的转化效率有所降低，平均转化率为82.53%；而当所加入的底物浓度为2.4毫摩尔/升时，耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108对底物黄豆苷原转化能力急剧下降，平均转化率仅为35.43%（见附图5）。
实施例4
严格厌氧菌株AUH-JLC108的分离方法以及耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的获得方法同实施例1。
耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用，包括以下步骤：
（1）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的培养
将低温冷冻保存的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108融化并按10%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃下培养24小时；再以10%接种量将试管中的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，培养18小时作为种子液；
（2）底物黄豆苷原与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108共培养
将耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的种子液按15%的量转接到100毫升BHI液体培养基中，同时加入50毫摩尔/升放入黄豆苷原母液使黄豆苷原的终浓度为1.8毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养3天；
（3）代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物去氧甲基安哥拉紫檀素。
实施例5
严格厌氧菌株AUH-JLC108的分离方法以及耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的获得方法同实施例1。
耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用，包括以下步骤：
（1）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的培养
将低温冷冻保存的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108融化并按15%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃下培养24小时；再以10%接种量将试管中的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，培养12小时作为种子液；
（2）底物黄豆苷原与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108共培养
将耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的种子液按10%的量转接到BHI液体培养基中，同时加入40毫摩尔/升黄豆苷原母液，使黄豆苷原的终浓度为1.6毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2天；
（3）代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物去氧甲基安哥拉紫檀素。
实施例6
严格厌氧菌株AUH-JLC108的分离方法以及耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的获得方法同实施例1。
耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用，包括以下步骤：
（1）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的培养
将低温冷冻保存的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108融化并按12%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃下培养24小时；再以10%接种量将试管中的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，培养16小时作为种子液；
（2）底物黄豆苷原与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108共培养
将耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的种子液按15%的量转接到BHI液体培养基中，同时加入60毫摩尔/升黄豆苷原母液，使黄豆苷原的终浓度为1.8毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养3天；
（3）代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物去氧甲基安哥拉紫檀素。
Claims (6)
1.一种耐氧梭菌（Clostridium sp.）Aeroto-AUH-JLC108，保藏号为CGMCC No.9550。
2.权利要求１所述的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用。
3.根据权利要求2所述的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用，其特征在于包括以下步骤：
（1）耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的培养
将低温冷冻保存的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108融化并按10～15%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，37℃下培养24小时；再以10%接种量将试管中的耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，培养12～18小时作为种子液；
（2）底物黄豆苷原与耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108共培养
将耐氧菌株Aeroto-AUH-JLC108的种子液转接到BHI液体培养基中，同时加入黄豆苷原进行共培养；
（3）代谢产物的分离纯化。
4.根据权利要求3所述的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用，其特征在于所述步骤（2）中种子液按10～15%的量接种，加入黄豆苷原母液使黄豆苷原的终浓度为1.6～2.0毫摩尔/升，37℃恒温培养箱内培养2～3天。
5.根据权利要求4所述的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用，其特征在于黄豆苷原母液浓度为40～60毫摩尔/升。
6.根据权利要求3所述的耐氧梭菌Aeroto-AUH-JLC108在去氧甲基安哥拉紫檀素有氧合成中的应用，其特征在于所述步骤（3）中分离纯化方法为：用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离得到代谢产物去氧甲基安哥拉紫檀素。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102391969A (zh) * | 2011-11-18 | 2012-03-28 | 河北农业大学 | 梭菌auh-jlc140及其在去氧甲基安哥拉紫檀素生物合成中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Enhanced biosynthesis of O-desmethylangolensin from daidzein by a novel oxygen-tolerant cock intestinal bacterium in the presence of atmospheric oxygen;M. Li,et al;《Journal of applied microbiology》;20150330;第118卷(第3期);619–628 * |
| 大豆异黄酮转化菌株的分离耐氧驯化及耐氧机制研究;李慧;《CNKI-中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20140315(第3期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104371950A (zh) | 2015-02-25 |
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