CN103275884B - 史雷克氏菌auh-jlc159及其转化制备(-)-5-oh-雌马酚的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种史雷克氏菌AUH-JLC159，保藏号为CGMCC No.5304，及其在制备(-)-5-OH-雌马酚中的应用。（1）菌株AUH-JLC159的培养；（2）染料木素与菌株AUH-JLC159共培养和代谢产物的分离纯化：将菌株AUH-JLC159的种子液转接到BHI培养基中，在厌氧工作站内培养2～3天即可将底物染料木素转化为(-)-5-OH-雌马酚；代谢产物的分离纯化。本发明的史雷克氏菌AUH-JLC159能在厌氧条件下将底物染料木素高效转化为5-OH-EQ；解决了5-OH-EQ的微生物生物合成及资源匮乏问题，对5-OH-EQ生理、药理活性以及新药研发具有极大的推动作用。

Description

史雷克氏菌AUH-JLC159及其转化制备(-)-5-OH-雌马酚的方法

技术领域

本发明涉及一种菌及其应用方法，尤其是一种斯奈克氏菌及其在染料木素转化制备(-)-5-OH-雌马酚中的应用方法。 

背景技术

天然大豆中的异黄酮绝大部分以结合型糖苷存在，以游离型苷元存在的大豆异黄酮只有3种，即黄豆苷原（Daidzein）、染料木素（Genistein）和金雀花异黄素（Glycitein），其中黄豆苷原和染料木素占大豆异黄酮总苷元的95%~97%，为大豆异黄酮苷元的主要成分。大量流行病学和实验室研究结果均表明，大豆异黄酮具有明显的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、缓解妇女更年期症状、防治骨质疏松和降低心脑血管发病率等功效，有关大豆异黄酮的生理功能目前已引起社会和学术界的普遍关注。 

被摄入机体的结合型大豆异黄酮糖苷在肠道和肝组织中β-葡萄糖苷酶作用下首先被水解为游离型苷元，进而被胃肠道内的微生物菌群降解为各种不同代谢产物。目前人们对大豆异黄酮黄豆苷原在人体及其他动物体内的代谢研究得比较透彻，而对染料木素在动物体内的代谢研究则相对较少。从人和其他动物的血液和尿液中分离鉴定的黄豆苷原的代谢产物主要包括：二氢黄豆苷原（Dihydrodaidzein，简称DHD）、四氢黄豆苷原（Tetrahydrodaidzein，简称THD）、雌马酚、去氧甲基安哥拉紫檀素（O-desmethylangolensin，简称O-Dma）等；染料木素的代谢产物主要包括二氢染料木素（Dihydrogenistein，简称DHG）、4-乙基苯酚（4-Ethylphenol）和对羟基苯丙酸（4-Hydroxyphenyl-2-Propionic Acid, 简称2-HPPA）等。2008年日本和德国学者分别报道了能将染料木素转化为5-OH-雌马酚（简称5-OH-EQ） 的人肠道细菌菌株DZE（Biol. Pharm. Bull., 2008, 31:1621-1625 ）和鼠肠道细菌菌株Mt1B8（Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74:4847-4852），2009年德国学者将从人肠道分离的能将染料木素转化为5-OH-EQ的细菌菌株鉴定为斯奈克氏菌属的新菌种Slackia isoflavoniconvertens（Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75:1740-1744）。有关5-OH-EQ的生物合成途径，目前普遍认为是底物染料木素首先被转化为DHG，再由DHG转化为5-OH-EQ。  

大豆异黄酮的不同代谢产物具有不同的生理活性，这主要取决于代谢产物的化学结构。在目前已报道的大豆异黄酮所有代谢产物中，雌马酚被认为是活性最高的成分，其抗氧化活性比其亲本化合物黄豆苷原高出100多倍（Eur. J. Cancer. 1997, 33:2384-2389）。我们曾对大豆异黄酮黄豆苷原、染料木素及生物合成的DHD、二氢染料木素（Dihydrogenistein，简称DHG）、去氧甲基安哥拉紫檀素（O-desmethylangolensin，简称O-Dma）和雌马酚的体外清除自由基能力进行对比分析，结果发现，相同浓度下雌马酚清除超氧阴离子和二苯代苦味酰基自由基（1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl，简称DPPH）能力远高于黄豆苷原、染料木素及DHD、DHG和O-Dma等大豆异黄酮其他代谢产物 （J. Agri. Food Chem. 2010, 58(22):11548-11552）。在疾病防治方面，现有研究结果表明，雌马酚具有明显的抗肿瘤、防治骨质疏松和降低心血管发病率等功效。Chin-Dusting等（Bri. J. Pharmaco. 2001, 133:595-605） 和Jiang等（J. Vasc. Res. 2003, 40:276-284）分别分析比较了化学合成的黄豆苷原代谢产物和黄豆苷原对心血管的保护作用，研究发现，供试不同化合物作用由强到弱的顺序为：雌马酚（Equol）> 四氢黄豆苷原（Tetrahydrodaidzein，简称THD）> 二氢黄豆苷原（Dihydrodaidzein，简称DHD）> 黄豆苷原。有关雌马酚的抗癌作用已涉及白血病、胃癌、肺癌、肝癌、皮肤癌等非性激素癌症以及人结肠癌、前列腺癌和乳腺癌等与性激素相关的癌症。通过我们的实验发现，雌马酚在极低浓度下（20微摩尔/升）即可导致人肝癌细胞SMMC-7721发生细胞凋亡（中西医结合, 2008, 17:5124-5129）。尽管有关雌马酚生理活性报道近年来日益增多，然而，有关5-OH-EQ活性方面目前尚无任何报道，这与5-OH-EQ资源匮乏直接相关。代谢产物雌马酚是底物黄豆苷原经肠道微生物转化而来，代谢产物5-OH-EQ则是底物染料木素经肠道微生物转化而来，底物黄豆苷原和底物染料木素之间的结构差异恰好是雌马酚与5-OH-EQ之间的结构差异（即5位碳原子上是否存在羟基）。目前国内外已对天然产物黄豆苷原和染料木素的生物学活性（特别是抗氧化和抗癌活性）进行了大量对比性研究，研究结果表明，相同浓度下染料木素的生理或药理活性均高于黄豆苷原，这表明异黄酮第5位碳原子上羟基的有无会直接影响化合物本身的生理或药理活性。由于5-OH-EQ与雌马酚在化学结构上的差异与染料木素和黄豆苷原的结构差异完全相同，根据构效关系可以推测，相同浓度下的5-OH-EQ的生理和药理活性很可能会高于雌马酚。 

雌马酚为手性化合物，有R-和S-两种对映异构体。目前雌马酚既可通过化学加氢法人工合成（合成的为外消旋体雌马酚，即(±)-雌马酚），也可通过已分离的雌马酚产生菌进行生物合成，且研究结果已证实通过雌马酚产生菌合成的为100% S-型-左旋雌马酚，即100% S-(-)-雌马酚。尽管目前有关R-雌马酚和S-雌马酚活性方面报道仍十分有限，但已有研究结果表明R-雌马酚和S-雌马酚与人雌激素受体ER_a和ER_b的亲和力存在明显不同（Setchell等2005）。与雌马酚相似，5-OH-EQ也为手性化合物，理论上也应存在R-和S-两种对映异构体，虽然日本和德国学者相继从人和小鼠粪便中分离了5-OH-EQ产生菌，但迄今尚不清楚由菌体转化染料木素生成的5-OH-EQ是否像雌马酚一样也为单一对映体（即仅为S-型或仅为R-型）；另外，目前仍不清楚由菌体转化生成的5-OH-EQ是否有旋光性，如有旋光性，目前还不清楚究竟为左旋还是右旋。化合物5-OH-EQ本身在自然界中并不存在，在目前国内外尚不能进行人工化学合成前提下，通过微生物转化法合成5-OH-EQ是目前获得5-OH-EQ的唯一途径。因而，有关5-OH-EQ产生菌的分离及转化特点的研究变得尤为重要。 

发明内容

本发明解决了左旋-5-OH-雌马酚，即(-)-5-OH-EQ的资源匮乏问题，提供一种斯奈克氏菌AUH-JLC159及该斯奈克氏菌将染料木素高效转化为(-)-5-OH-EQ的方法。 

本发明采取的技术方案为： 

一种斯奈克氏菌（Slackiasp.）AUH-JLC159，保藏号为CGMCC No.5304。

斯奈克氏菌Slackiasp. AUH-JLC159（KC523277）是从公鸡新鲜粪样中分离得到的一株革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株，该菌株在厌氧工作站内能将大豆异黄酮染料木素高效转化为单一对映体左旋-5-OH-雌马酚。为书写方便，这里将产物左旋-5-OH-雌马酚简称(-)-5-OH-EQ，将菌株Slackiasp. AUH-JLC159简称JLC159，以下均使用简称形式，(-)-5-OH-EQ代表化合物左旋-5-OH-雌马酚，菌株JLC159与菌株Slackiasp. AUH-JLC159为同一菌株。 

本发明中的史雷克氏菌Slackiasp. AUH-JLC159菌株（简称JLC159）已于2011年9月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为 CGMCC No.5304。该保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

所述斯奈克氏菌JLC159的分类学特征为：菌落直径1.0~2.5 毫米，菌落透明，中央有凸起，菌落边缘整齐，在BHI培养基中菌体为短杆状，该菌株革兰氏染色呈阳性。 

本发明还提供斯奈克氏菌（Slackiasp. ）AUH-JLC159在染料木素转化中的应用。 

斯奈克氏菌AUH-JLC159在染料木素转化制备左旋-5-OH-雌马酚中的应用方法，包括以下步骤： 

（1）菌株JLC159的培养

将低温冷冻保存的斯奈克氏菌JLC159融化后按15～20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37下培养24小时，再以15%接种量将试管中菌株JLC159重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，继续在厌氧工作站内培养20-24小时作为种子液；

（2）底物染料木素与菌株JLC159共培养与代谢产物的分离纯化

①底物染料木素与菌株JLC159共培养

将菌株JLC159的种子液按15～20%接种量转接到BHI液体培养基中培养，根据染料木素母液浓度（40-60毫摩尔/升）及三角瓶中培养基体积，确定母液加入量，使染料木素在培养基中的浓度为0.4毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养2-3天；

②代谢产物的分离纯化

用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上分离制备代谢产物。

其中，所述菌株JLC159的分离培养包括下述步骤： 

（1）公鸡粪样的采集与培养

用已灭菌的棉签挑取新鲜粪样，放入1毫升新鲜BHI液体培养基中，并放置在37°C厌氧工作站内，以此作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；

（2）转化菌株的分离培养

①单一菌落式分离培养

用新鲜BHI液体培养基内的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10^–1，10^–2、10^–3、10^–4、10^–5、10^–6、10^–7、10^–8，再分别将100微升浓度分别为10^–5、10^–6、10^–7、10^–8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养24-48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号；

②单菌落的混合培养及转化活性测定

将已编号的单菌落随机取10个为一组，将每组的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1毫升BHI液体培养基的同一试管内，再分别加入10毫摩尔/升染料木素母液10微升，在厌氧工作站内培养2天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成；

③特定功能微生物菌落的分离筛选

一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管中的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 毫升BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入10毫摩尔/升的底物染料木素母液10微升，共同培养2天后，取100微升培养液加入1000微升乙酸乙酯进行提取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出具有转化活性的10个菌落的混合培养物中能转化底物染料木素的单菌落。

本发明的有益效果： 

1. 本发明提供的鸡肠道分离菌株斯奈克氏菌AUH-JLC159能在厌氧工作站内将染料木素高效转化为左旋-5-羟基-雌马酚（即(-)-5-OH-EQ）；当底物浓度在10-200微摩尔/升时，产物(-)-5-OH-EQ 对DPPH的清除率均极显著高于雌马酚、染料木素和黄豆苷原（p<0.01）；相同浓度下产物(-)-5-OH-雌马酚对DPPH的体外清除作用比雌马酚高出20余倍。

2. 本发明的斯奈克氏菌AUH-JLC159解决了(-)-5-OH-EQ资源匮乏问题，对(-)-5-OH-EQ药理活性及新药研发具有极大的推动作用。 

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。 

图1为本发明实施例1中菌株JLC159转化底物染料木素的高效液相色谱图； 

图2为本发明实施例1中菌株JLC159转化底物染料木素生成的(-)-5-OH-EQ纯品的质谱图；

图3为本发明实施例1中菌株JLC159转化底物染料木素纯化后的代谢产物在手性柱上的高效液相色谱图；

图4为本发明实施例1中菌株JLC159对底物染料木素的转化动态曲线；

图5为本发明实施例1中菌株JLC159对不同浓度底物染料木素转化能力比较；

图6为本发明实施例1中菌株JLC159代谢底物染料木素后所生成的产物(-)-5-OH-EQ对超氧阴离子自由基体外清除能力测定，以及其与雌马酚、染料木素和黄豆苷原清除能力的比较；

图7为本发明实施例1中所得产物(-)-5-OH-EQ不同浓度下对DPPH自由基体外清除能力测定。

具体实施方式

实施例1 

1.菌株JLC159的分离培养

（1）公鸡粪样的采集与培养

用已灭菌的棉签挑取新鲜粪样，放入1毫升新鲜BHI液体培养基中，并放置在37°C厌氧工作站内，以此作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；

（2）转化菌株的分离培养

①单一菌落式分离培养

用新鲜BHI液体培养基内的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10^–1，10^–2、10^–3、10^–4、10^–5、10^–6、10^–7、10^–8，再分别将100微升浓度分别为10^–5、10^–6、10^–7、10^–8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号；

②单菌落的混合培养及转化活性测定

将已编号的单菌落随机取10个为一组，将每组的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1毫升BHI液体培养基的同一试管内，再分别加入10毫摩尔/升的染料木素母液10微升，在厌氧工作站内培养2天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成；

③特定功能微生物菌落的分离筛选

一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管中的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 毫升BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入10毫摩尔/升的底物染料木素母液10微升，共同培养2天后，取100微升培养液加入1000微升乙酸乙酯进行提取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出具有转化活性的10个菌落的混合培养物中能转化底物染料木素的单菌落；

2.菌株JLC159的纯化培养、菌种鉴定与保藏

（1）单菌落的纯化培养

将筛选出的具有转化功能的菌落或菌苔在BHI固体培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，重复至少3次以上，确保长出的单菌落形态一致。将纯化后的单菌落接种到1毫升BHI液体培养基中，培养24小时取菌液200微升，加入到盛有500微升事先已灭菌的50％甘油水溶液的冻存管中，混匀后在其表面加2毫米厚事先已灭菌的液体石蜡，再将其保藏在-70的超低温冰箱中，对低温保藏的功能微生物菌株定期进行复壮培养和转化活性测定。

（2）对分离出的特定功能微生物菌株进行菌种鉴定 

以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R（27F: 

5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′）为引物对16S rDNA序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生工生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析。通过BLAST比对，菌株JLC159与已知菌的16S rDNA序列相似性均较远，与Slackia piriformis和Slackia faecicanis的相似性最高，但也仅为92%，表明该转化菌株为斯奈克氏菌属的一个新分类单元。因而，将该功能菌株初步鉴定为斯奈克氏菌属菌株，并将该功能菌株命名为AUH-JLC159。菌株AUH-JLC159的16S rDNA序列已上交美国NCBI核苷酸库，获得菌株JLC159的注册号（Accession Number）为KC523277。

3.菌株JLC159在染料木素转化中的应用 

（1）菌株JLC159的培养

将–70低温保存的鸡肠道分离菌株JLC159冻融后，按20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37下培养20-24小时后试管中菌液呈混浊。再以15%接种量将试管中已长混浊的菌株JLC159重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的塑料离心管中，继续在厌氧工作站内培养24小时作为种子液；

（2）底物染料木素与菌株JLC159共培养

在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株JLC159的种子液按15-20%接种量转接到盛有液体培养基的三角瓶内培养，同时加入一定体积的浓度为40-60毫摩尔/升的染料木素母液，使培养基中染料木素终浓度为0.4毫摩尔/升，并在厌氧工作站内培养2天，菌株JLC159可将底物染料木素高效转化为(-)-5-OH-EQ。

（3）用HPLC检测底物染料木素被菌株JLC159的转化情况 

从上述三角瓶中培养物取100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入800微升100%甲醇溶液。 

（4）代谢产物的分离纯化与结构鉴定 

 经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集产物峰。将收集的产物峰蒸干后，在分析型高效液相色谱仪上测定其纯度，再分别测定代谢产物的紫外吸收图谱、质谱、核磁共振氢谱（¹H-NMR）和碳谱（¹³C-NMR）。结果表明，经HPLC检测，在保留时间7.909分钟检测到一个产物峰（即峰1），出现在保留时间14.915分钟的峰（即峰2）为剩余的未被转化的底物染料木素（附图1）。经全波长扫描，该产物峰在275纳米处有最大紫外吸收（见附图1中的紫外吸收图谱）。为准确鉴定产物的化学结构，我们对纯化后的产物分别进行了质谱以及核磁共振氢谱和碳谱的测定。经ESI阴离子质谱测定，发现在257处有一分子离子峰（附图2），表明该产物的分子量应为258，这恰好与5-OH-EQ分子式C₁₅H₁₄O₄的分子量相一致。结合该产物的质谱及核磁共振氢谱和碳谱的解析结果，最终将代谢产物鉴定为5-OH-EQ。该代谢产物的核磁共振氢谱和碳谱的解析结果如下：

¹H-NMR(Acetone, 400MHz): 7.17(2H, d, J=8.8Hz′, H-2′,6′), 6.82(2H, d, J=8.8Hz, H-3′,5′), 4.16 (1H, ddd, Ja,b=10.4Hz, J2,3=3.2Hz, J2,4=2.0Hz, H-2a), 3.89(1H, t,  Ja,b=10.4Hz), 3.03(1H, m), 2.89(1H,ddd, Ja,b=16.0Hz, J3,4=3.9Hz, J2,4=2.0Hz, H-4a), 2.61(1H, dd, Ja,b=16.0Hz, J3,4=11.2Hz, H-4b)。

¹³C-NMR(Acetone, 100MHz): 157.4(C-7), 157.0(C-4′,C-5), 156.9(C-9), 133.8(C-1′), 129.2(C-2′,6′), 116.2(C-3′,5′), 102.1(C-10), 95.7(C-6), 95.5(C-8), 71.3 (C-2), 38.5 (C-3), 27.6(C-4)。 

（5）代谢产物手征性测定 

由于产物5-OH-EQ结构中的第三位碳原子为手性碳原子（C^*），理论上该物质存在两种对映异构体，即R-型-5-OH-EQ和S-型-5-OH-EQ。为检测由鸡肠道菌株AUH-JLC159代谢底物染料木素所生成的产物5-OH-EQ是单一异构体还是两种对映异构体并存，将3（4）中获得的5-OH-EQ纯品重新溶解在100%甲醇中，在手性柱高效液相色谱上检测出峰情况。本发明中的产物5-OH-EQ经手性高效液相色谱柱后只在保留时间29.841分钟出现一个物质峰（见附图3），表明经细菌菌株JLC159代谢染料木素后生成的产物为单一对映体，即产物5-OH-EQ的对映体过量率（e.e.%）为100%。经旋光性测定发现，产物5-OH-EQ使偏振光偏向左侧，表明产物5-OH-EQ为左旋，即(-)-5-OH-EQ，测得单一对映体(-)-5-OH-EQ 的旋光度为-6.1°。

（6）菌株JLC159对底物染料木素的转化动态 

为了解菌株JLC159转化底物染料木素的速度，以便确定最佳转化时间，我们对菌株JLC159转化底物染料木素的转化动态进行了测定，具体方法如下：

将事先培养好的种子液（培养方法同上所述）按15%接种量接种到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入40 毫摩尔/升的染料木素母液0.5 毫升，在厌氧工作站内分别培养12小时、24小时、48小时、72小时和96小时后取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸干后加入100微升100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况，根据不同培养时间剩余底物和生成的产物浓度绘制菌株转化动态（见附图4），由附图4可以看出，底物与菌株JLC159共同培养12小时后即有少量底物生成，共同培养12小时至48小时产物(-)-5-OH-EQ生成量急剧增加，共同培养72小时后产物(-)-5-OH-EQ稍有上升，此后基本保持稳定。

4.菌株JLC159对不同浓度底物染料木素最大转化能力测定   

将菌株JLC159分别与不同浓度的染料木素在厌氧工作站内共同培养3天，然后用等体积乙酸乙酯对培养物进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物染料木素被转化情况。结果表明，菌株JLC159对浓度分别为0.2毫摩尔/升和0.4毫摩尔/升的染料木素的转化能力相似，平均转化率分别为96.5%和94.7%；当浓度为0.6毫摩尔/升时，转化率明显降低，平均转化率为76.5%；当所加入的底物浓度为0.8毫摩尔/升时，菌株JLC159几乎不能转化底物染料木素（见附图5）。平均转化率的计算方法为：转化率=产物浓度/（剩余底物浓度+产物浓度）×100%）。

.代谢产物(-)-5-OH-EQ与底物染料木素、雌马酚、黄豆苷原纯品对超氧阴离子自由基体外清除能力比较   

分别将纯品(-)-5-OH-EQ、染料木素、雌马酚和黄豆苷原配制为5毫摩尔/升的母液，然后依次稀释为以下浓度：10微摩尔/升、20微摩尔/升、40微摩尔/升、100微摩尔/升、200微摩尔/升和400微摩尔/升，对比测定不同浓度下(-)-5-OH-EQ、染料木素、雌马酚和黄豆苷原对超氧阴离子自由基的体外清除能力。结果表明，当浓度为10-200微摩尔/升，产物(-)-5-OH-EQ 对超氧阴离子自由基清除能力极显著高于雌马酚（p<0.01），当浓度为200-400微摩尔/升时，产物(-)-5-OH-EQ 对超氧阴离子自由基清除能力显著高于雌马酚（p<0.05）；当浓度为10微摩尔/升时，染料木素和黄豆苷原对超氧阴离子自由基不表现清除作用，当浓度为20-400微摩尔/升时，产物(-)-5-OH-EQ 对超氧阴离子自由基清除能力均极显著高于染料木素和黄豆苷原（p<0.01），结果见附图6。

.代谢产物(-)-5-OH-EQ对DPPH自由基体外清除能力比较   

将底物(-)-5-OH-EQ纯品配制为5毫摩尔/升的母液，然后依次稀释为以下浓度：3.3微摩尔/升、6.7微摩尔/升、13.3微摩尔/升和33.3微摩尔/升，测定不同浓度下产物对二苯代苦味酰基自由基（1,1-Diphenyl- 2-Picrylhydrazyl，即DPPH）的体外清除能力。结果表明，产物(-)-5-OH-EQ对DPPH自由基表现出极强的清除作用。当浓度为13.3微摩尔/升时，产物(-)-5-OH-EQ 对DPPH自由基的平均清除率高达58%；当浓度为33.3微摩尔/升时，产物(-)-5-OH-EQ 对DPPH自由基的平均清除率高达88%，结果见附图7。需指出的是，由于雌马酚、染料木素和黄豆苷原在上述4种不同浓度（即3.3微摩尔/升、6.7微摩尔/升、13.3微摩尔/升和33.3微摩尔/升）下对DPPH自由基均不表现清除能力，我们只能对更高浓度的雌马酚、染料木素和黄豆苷原清楚DPPH能力进行测定，所测结果与我们以前报道的雌马酚、染料木素和黄豆苷原对DPPH清除能力完全一致（J. Agri. Food Chem. 2010, 58(22):11548-11552）。相同浓度下的雌马酚对DPPH体外清除能力远大于染料木素和黄豆苷原，而相同浓度的(-)-5-OH-EQ对DPPH清除能力则远大于雌马酚。雌马酚清除DPPH自由基的IC₅₀为0.295毫摩尔/升（即295微摩尔/升）（J. Agri. Food Chem. 2010, 58(22):11548-11552），而(-)-5-OH-EQ 的IC₅₀仅为11.3微摩尔/升，表明相同浓度下5-OH-EQ对DPPH的清除率比雌马酚高26倍，这在以往研究中从未有过报道。由于自由基与癌症、炎症等多种疾病直接相关，利用化合物的抗氧化特性有效清除体内过剩自由基已成为一些重大疾病防治的重要手段。天然产物染料木素的微生物代谢产物(-)-5-OH-EQ 在相同浓度下表现出远高于雌马酚的体外抗氧化能力（包括超氧阴离子自由基和DPPH），这预示代谢产物(-)-5-OH-EQ 在新药研发方面具有比雌马酚更大的研发前景和市场竞争力。

实施例2 

菌株JLC159的分离方法同实施例1。

在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株JLC159的种子液按15%接种量转接到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入40毫摩尔/升的染料木素母液1.25 毫升，在厌氧工作站内培养3天。用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，得到(-)-5-OH-EQ的转化率为83.3%。 

Claims (2)

1.一种史雷克氏菌（Slackia sp.）AUH-JLC159，保藏号为CGMCC No.5304。

2.如权利要求1所述的史雷克氏菌AUH-JLC159转化染料木素制备(-)-5-OH-雌马酚的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）菌株AUH-JLC159的培养

将低温冷冻保存的史雷克氏菌AUH-JLC159融化并按15～20%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37oC下培养24小时；再以15%接种量将试管中的菌株AUH-JLC159重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基中，继续在厌氧工作站内培养20～24小时作为种子液；

（2）底物染料木素与菌株AUH-JLC159共培养与代谢产物的分离纯化

①底物染料木素与菌株AUH-JLC159共培养

将菌株AUH-JLC159的种子液按15～20%接种量转接到BHI液体培养基中培养，根据染料木素母液中底物染料木素及三角瓶中培养基体积，确定母液加入量，使得染料木素在培养基中的浓度为0.4～0.6毫摩尔/升，染料木素母液中底物染料木素浓度为40～60毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养2～3天即可将底物染料木素转化为(-)-5-OH-雌马酚；

②代谢产物的分离纯化

用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离制备(-)-5-OH-雌马酚。