CN103146598B - 梭菌auh-jlc39及其在鸢尾黄素转化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种梭菌AUH-JLC39，保藏号为CGMCC No.7221，及其在鸢尾黄素转化中的应用。梭菌（Clostridiumsp.）AUH-JLC39在鸢尾黄素转化中的应用包括下述步骤：将菌株JLC39的种子液按10-15%接种量转接到液体培养基中并加入底物鸢尾黄素,在厌氧工作站内静置培养48-60小时；用等体积乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液蒸干后用制备柱在HPLC上对产物进行分离制备。本发明的菌株能将鸢尾黄素高效转化为二氢鸢尾黄素，产物二氢鸢尾黄素对二苯代苦味酰基自由基（DPPH）的体外清除率极显著高于底物鸢尾黄素（p<0.01），解决了二氢鸢尾黄素的微生物生物合成问题及其资源匮乏问题，对新药研发具有极大的推动作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌株及其应用，尤其是一种梭菌AUH-JLC39及其在鸢尾黄素转化中的应用。
背景技术
葛花又称葛条花，为豆科植物野葛 (Pueraria lobata (Wild.) Ohwi) 或甘葛藤(Pueraria thomsonii Benth.) 的干燥花蕾。据中华人民共和国药典记载，葛花性甘、凉，用于解酒醒脾，治伤酒发热，烦渴，不思饮食，长期以来被用于缓解酒后呕吐等症状。药理学研究结果表明，葛花具有护肝、降血糖、降血脂以及类雌激素等多种药理活性。
葛花是我国传统中药，其主要药效成分是异黄酮类化合物，葛花中的异黄酮主要由葛花苷 (kakkalide) 、次葛花苷 (Kakkalidone)、鸢尾黄素(tectorigenin) 、鸢尾苷 (tectoridin)、尼泊尔鸢尾异黄酮(irisolidon) 等多酚羟基化合物组成，尽管产地不同各组分含量也有明显差异，但一般以葛花苷含量最高。有研究表明，葛花苷、次葛花苷和鸢尾苷等结合型糖苷在酸性条件下可被水解为鸢尾黄素（亚太传统医药，2008，4：24-26）；实际上，葛花不管是做成中成药还是作为汤药熬服，最终都要经口服进入体内，葛花中的众多药理活性成分均存在被胃肠道微生物菌群降解的可能性。Yong Chen 等就曾在灌喂鸢尾苷的大鼠尿液中检测到了鸢尾苷代谢产物鸢尾黄素和二氢鸢尾黄素（Pharm. Pharmacol., 2008,60:709-716），由于从未有人在天然葛花提取物中检测到二氢鸢尾黄素，因而推测是大鼠肠道微生物菌群将鸢尾苷转化为鸢尾黄素，鸢尾黄素再进一步被转化为二氢鸢尾黄素，但有关二氢鸢尾黄素的生理和药理活性，迄今尚未见任何报道。
近年来有大量文献对鸢尾黄素的药理活性进行了报道，2011年中南大学药学院王霆教授等针对鸢尾黄素的药理作用专门撰写了综述（中南药学，2011，9（12）：913-916）。鸢尾黄素又称鸢尾苷元，其化学名为5,7,4'-三羟基-6-甲氧基异黄酮，鸢尾黄素在很多方面均表现出了较强的药理作用：如抗氧化和清除自由基、调节内分泌和抗骨质疏松（即类似雌激素样作用）、保护肝脏、抗癌、抗炎、降低血糖和减少糖尿病并发症、抗动脉粥样硬化、抗过敏和治疗肺纤维化等（中南药学，2011，9（12）：913-916）。一方面，代谢产物二氢鸢尾黄素与底物鸢尾黄素在化学结构上极为相似，二者在结构上的唯一差异就在于C2-C3之间是饱和键还是不饱和键。鸢尾黄素的C2-C3之间为不饱和双键，而二氢鸢尾黄素的C2-C3间则为饱和单键。由于二氢鸢尾黄素与底物鸢尾黄素结构类似，通过构效关系可以推测，代谢产物二氢鸢尾黄素应该具有与底物鸢尾黄素相似的生理和药理活性。另一方面，体外清除自由基实验结果表明，在所检测浓度范围内（0.25-1.0 毫摩尔/升），二氢鸢尾黄素对二苯代苦味酰基自由基（1,1-Diphenyl- 2-Picrylhydrazyl，即DPPH）的体外清除能力均极显著高于底物鸢尾黄素（p<0.01）。尤为值得一提的是，相同浓度下（0.25-1.0 毫摩尔/升）二氢鸢尾黄素和鸢尾黄素对DPPH自由基的清除作用均极显著高于高活性植物雌激素雌马酚（p<0.01）。非天然产物雌马酚为大豆异黄酮黄豆苷原的微生物代谢产物，经研究证实，在一定浓度范围内，代谢产物雌马酚体外清除超氧阴离子自由基和DPPH自由基能力显著高于大豆异黄酮黄豆苷原和染料木素，同时也显著高于二氢黄豆苷原（dihydrodaidzein）、二氢染料木素（dihydrogenistein）、去氧甲基安哥拉紫檀素（O-desmethylangolensin）等大豆异黄酮的其它微生物代谢产物（J.Agric.Food Chem. 2010,58:11548-11552）。抗氧化实验结果表明，雌马酚的抗氧化活性是其底物黄豆苷原的100多倍（Eur. J. Cancer, 1997,33:2384-2389）；药理学研究表明，雌马酚在抗癌、防治骨质疏松和心脑血管疾病等方面的活性在大豆异黄酮及其代谢产物中是最高的。由于自由基常与癌症、炎症等多种疾病直接相关，利用化合物的抗氧化特性有效清除体内过剩自由基已成为一些重大疾病防治的重要手段。二氢鸢尾黄素在相同浓度下表现出远高于其底物鸢尾黄素的体外清除自由基能力，这预示代谢产物二氢鸢尾黄素的生理和药理活性会高于底物鸢尾黄素，与底物鸢尾黄素相比，产物二氢鸢尾黄素将具有更广阔的研发前景和市场竞争力。但迄今未见从自然界中分离和人工合成二氢鸢尾黄素的报道，也未见将鸢尾黄素转化为二氢鸢尾黄素的单一微生物菌株的报道。
发明内容
本发明提供一种梭菌AUH-JLC39及其在鸢尾黄素转化中的应用，解决了二氢鸢尾黄素的微生物生物合成问题及其资源匮乏问题，对新药研发具有极大的推动作用。
本发明所采取的技术方案是：
一种梭菌（Clostridium sp.）AUH-JLC39，保藏号为CGMCC No.7221。
梭菌Clostridium sp. AUH-JLC39（KC523278）是从鸡粪便中分离得到的一株革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株，该菌株在厌氧工作站内能将中药葛花提取物的酸水解物（即鸢尾黄素）高效转化为二氢鸢尾黄素。有关鸢尾黄素向二氢鸢尾黄素的转化过程，推测是鸢尾黄素在菌株Clostridium sp. AUH-JLC39（为方便书写，在这里将菌株Clostridium sp. AUH-JLC39简称JLC39，以下均使用该转化菌株的简称形式，菌株JLC39与菌株Clostridium sp. AUH-JLC39为同一菌株）分泌的还原酶作用下被加氢还原成二氢鸢尾黄素，根据葛花中所含异黄酮的化学结构、葛花苷在小白鼠体内代谢情况以及实验结果，推测二氢鸢尾黄素的生物合成途径可能如下所示:
本发明中的梭菌Clostridium sp. AUH-JLC39, 菌株（简称JLC39）已于2013年1月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为 CGMCC No.7221。该保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述梭菌Clostridium sp. AUH-JLC39 的分类学特征为：
菌落直径2.0~3.0 毫米，菌落外周整齐，菌落外围有明显的透明环；菌落发浅半透明，中央发白不透明有圆锥状凸起；在BHI液体培养基中菌体呈中短杆状或中丝状；该菌株革兰氏染色呈阳性；
本发明还提供了梭菌AUH-JLC39在鸢尾黄素转化中的应用，其特征在于包括下述步骤：
（1）菌株AUH-JLC39的培养
将低温冷冻保存的梭菌AUH-JLC39融化并按10-15%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37°C下培养20-24小时；再以10-15%接种量将试管中的菌株AUH-JLC39重新转接到盛有新鲜BHI液体的培养基中，继续在厌氧工作站内培养18-24小时作为种子液；
（2）底物鸢尾黄素与菌株AUH-JLC39共培养与代谢产物的分离纯化
①底物鸢尾黄素与菌株AUH-JLC39共培养
将菌株AUH-JLC39的种子液按10-15%接种量转接到液体培养基中培养，根据三角瓶中培养基体积加入浓度为40-60毫摩尔/升鸢尾黄素母液，使得鸢尾黄素在培养基中的浓度为0.8-1.0毫摩尔/升，然后在厌氧工作站内培养48-60小时，即可将底物鸢尾黄素高效转化为二氢鸢尾黄素；
②代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离制备二氢鸢尾黄素。
其中，所述梭菌AUH-JLC39的分离培养包括下述步骤：
（1）鸡粪样的采集与培养
用已灭菌的棉签挑取新鲜粪便，放入1毫升新鲜BHI液体培养基中，置厌氧工作站内在37°C温度下培养24小时，作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；
（2）分离培养梭菌AUH-JLC39
①单一菌落式分离培养
用新鲜BHI液体培养基将事先在厌氧工作站内培养24小时的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10–1，10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7、10–8，再分别将100微升浓度分别为10–5、10–6、10–7、10–8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号；
②单菌落的混合培养及转化活性鉴定
将已编号的单菌落随机取10个为一组，将每组的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1毫升BHI液体培养基的同一试管内，再分别加入10毫摩尔/升鸢尾黄素纯品10微升，在厌氧工作站内培养2天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成；
③特定功能微生物菌落的分离筛选
一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管中的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 毫升BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入10毫摩尔/升的底物鸢尾黄素10微升，共同培养24小时后，取100微升培养液加入1000微升乙酸乙酯进行提取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出有转化活性的10个菌落的混合培养物中具有转化底物鸢尾黄素功能的单菌落；
鸢尾黄素纯品通过以下方法分离制备：
（1）葛花苷粗品的提取方法
从药店购买中药葛花（产地：保定安国），将葛花充分晾干后用粉碎机粉粹。称取粉碎后的葛花粉10 克加到250毫升三角瓶中，同时加入100毫升的100%的甲醇（固液比为1：10），浸泡1小时后用超声波常温萃取30分钟，葛花中的大部分葛花苷即被提取到甲醇中了，提取效果可用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）进行检测（见附图1中实线图）。HPLC色谱条件为：色谱柱为Kromasil C18反相色谱柱（4.6毫米×250毫米）；流动相为乙腈和水，具体为A液为10%乙腈水溶液加入0.1%乙酸，B液为90%乙腈水溶液同时加入0.1%乙酸；梯度洗脱方法： 0 min, 80%A; 12 min, 40%A; 20 min, 80%A；流速为1毫升/分钟，检测波长为265纳米。
（2）鸢尾黄素粗品的制备方法
将上述溶解在是甲醇中的葛花苷粗提物用滤纸过滤后，滤液再用旋转蒸发仪浓缩蒸干得，再按30毫升/克加入6%的盐酸，在80°C水浴锅中保温3小时酸水解。水解结束后，待水解液冷却至室温，用8摩尔/升NaOH溶液中和。然后按体积比1：1加入乙酸乙酯进行萃取。乙酸乙酯被蒸干后所得物即为鸢尾黄素粗品。葛花的甲醇提取物的酸水解物用HPLC只检测到一个大物质峰，该物质峰与葛花提取物中的峰3的保留时间一致（见图1，实线代表葛花甲醇提取物，虚线代表葛花甲醇提取物酸水解产物），推测该物质峰为鸢尾黄素，HPLC检测条件同上所述。
（3）鸢尾黄素纯品的制备及结构鉴定
葛花的甲醇溶液提取物的酸水解产物在265纳米处有一最大紫外吸收峰（见图2），这恰好与文献中报道的鸢尾黄素的紫外图谱相吻合。为了对葛花甲醇提取物的酸水解产物做准确结构鉴定，将水解后产物用制备柱（10毫米×250毫米）在HPLC上进行分离制备，对水解产物峰进行收集，收集液用旋转蒸发仪蒸干后分别进行核磁共振氢谱（1H-NMR）和碳谱（13C-NMR）测定，通过谱图解析并与文献报道中的鸢尾黄素的核磁共振谱（J. China Pharm. Univ., 2005,36:111-113）进行对比分析，准确将该水解后产物鉴定为鸢尾黄素。葛花甲醇提取物的酸水解产物的1H-NMR和13C-NMR具体结果如下：
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 13.06 (1H, s, 5-OH), δ 10.75 (1H, s, 7-OH), δ 9.58 (1H, s, 4 
-OH), δ 8.33 (1H, s, H-2), δ 7.37 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2 
,6 
), δ 6.82 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3 ,5 
), δ 6.50 (1H, s, H-8), δ 3.75 (3H, s, 6-OCH3)。
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 181.1 (C-4), δ 158.0 (C-5), δ 157.8 (C-4 
), δ 154.5 (C-7), δ 153.7 (C-9), δ 153.2 (C-2), δ 131.9 (C-6), δ 130.6(C-2 
,6 
), δ 122.3 (C-1 
), δ 121.7 (C-3), δ115.5(C-3 ,5 
), δ 105.3 (C-10), δ 94.3 (C-8), δ 60.4 (6-OCH3)。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
1. 本发明的梭菌JLC39解决了二氢鸢尾黄素资源匮乏问题，为新药研发提供了宝贵的新物质资源，对二氢鸢尾黄素药理活性及新药研发具有极大的推动作用。
2. 本发明提供的鸡肠道分离菌株梭菌JLC39能在厌氧工作站内将中药葛花甲醇提取物的酸水解产物鸢尾黄素高效转化为二氢鸢尾黄素；当物质浓度在0.25-1.0毫摩尔/升时，产物二氢鸢尾黄素对DPPH自由基的体外清除能力极显著高于底物鸢尾黄素（p<0.01）和已报道的具有较高抗氧化活性的雌马酚（p<0.01）。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1 为本发明中葛花甲醇提取物（图中实线）和葛花甲醇提取物酸水解产物（图中虚线）的高效液相色谱图；
图2为葛花甲醇提取物酸水解产物的紫外吸收图谱；
图3为本发明实施例1中厌氧菌株JLC39转化底物鸢尾黄素的高效液相色谱图；
图4为鸢尾黄素和鸢尾黄素代谢产物的紫外吸收图谱；
图5 为本发明实施例1中鸢尾黄素代谢产物的质谱图（负离子模式质谱）；
图6 为本发明实施例1中厌氧菌株JLC39对底物鸢尾黄素的转化动态曲线；
图7为本发明实施例1中厌氧菌株JLC39对不同浓度底物鸢尾黄素转化能力比较；
图8 为本发明实施例1中不同浓度底物鸢尾黄素、鸢尾黄素代谢产物二氢鸢尾黄素以及雌马酚体外清除DPPH自由基能力比较。
具体实施方式
实施例1
本实施例中，采用鸢尾黄素粗品进行转化，鸢尾黄素粗品是从葛花甲醇粗提物酸水解产物经乙酸乙酯萃取获得。
1.菌株JLC39的分离培养
（1）鸡粪样的采集与培养
用已灭菌的棉签挑取新鲜粪便，放入1毫升新鲜BHI液体培养基中，置厌氧工作站内在37°C温度下培养24小时，作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；
（2）分离培养梭菌AUH-JLC39
①单一菌落式分离培养
用新鲜BHI液体培养基将事先在厌氧工作站内培养24小时的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10–1，10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7、10–8，再分别将100微升浓度分别为10–5、10–6、10–7、10–8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养48小时后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号；
②单菌落的混合培养及转化活性鉴定
将已编号的单菌落随机取10个为一组，将每组的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1毫升BHI液体培养基的同一试管内，再分别加入10毫摩尔/升鸢尾黄素纯品10微升，在厌氧工作站内培养2天，取100微升培养液并用1000微升乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成；
③特定功能微生物菌落的分离筛选
一旦某试管中培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管中的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 毫升BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入10毫摩尔/升的底物鸢尾黄素10微升，共同培养24小时后，取100微升培养液加入1000微升乙酸乙酯进行提取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出有转化活性的10个菌落的混合培养物中具有转化底物鸢尾黄素功能的单菌落；
2.菌株JLC39的纯化培养、菌种鉴定与保藏
（1）单菌落的纯化培养
将筛选出的单一功能微生物菌落在BHI固体培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，重复至少3次以上，确保长出的单菌落形态一致。将纯化后的单菌落接种到1毫升BHI液体培养基中，培养24小时取菌液100微升，加入到盛有500微升事先已灭菌的50％甘油水溶液的冻存管中，混匀后在其表面加2毫米厚事先已灭菌的液体石蜡，再将其保藏在-70 
的超低温冰箱中，对低温保藏的功能微生物菌株定期进行复壮培养和转化活性测定。
（2）对分离出的特定功能微生物菌株进行菌种鉴定
以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模板，以通用引物27F/1492R（27F:
5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R: 5′-GGTTACCTTGT TACGAC TT-3′）为引物对16S rDNA基因序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生工生物工程有限公司进行DNA测序，测序结果经BLAST比对与GenBank数据库其他菌株进行相似性分析，该单一功能微生物菌株的16S rDNA序列与梭菌菌株Clostridium sp. TM-40的相似性高达99%，将该功能微生物菌株初步确定为梭菌属菌株。将该功能微生物菌株菌株命名为AUH-JLC39，并将其16S rDNA序列上交NCBI基因库，得到该菌株注册号（Accession Number）KC523278。该菌株已于2013年1月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为 CGMCC No.7221。
3.菌株JLC39在葛花转化中的应用
（1）菌株JLC39的培养
将–70 
低温保存的鸡肠道分离菌株JLC39冻融后，按15%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37 
下培养24小时后试管中菌液呈絮状混浊。再以10%接种量将试管中已长混浊的菌株JLC39重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的塑料离心管中，继续在厌氧工作站内培养24小时作为种子液；
（2）底物鸢尾黄素与菌株JLC39共培养
在超净台内将上述事先培养好的菌株JLC39的种子液按15%接种量转接到盛有液体培养基的三角瓶内培养，同时加入40毫摩尔/升的鸢尾黄素, 使得培养基中鸢尾黄素浓度为0.8毫摩尔/升，在厌氧工作站内培养48小时，菌株JLC39可将底物鸢尾黄素转化为二氢鸢尾黄素。
（3）用HPLC检测底物鸢尾黄素被菌株JLC39的转化情况
从上述三角瓶中培养物100微升至1.5毫升EP管中，加1000微升乙酸乙酯进行萃取，静置离心后取出上层乙酸乙酯800微升，在离心浓缩仪中蒸干后加入80微升100%甲醇溶液，用HPLC检测底物鸢尾黄素被菌株JLC39的转化情况（见图3）。
（4）代谢产物的分离纯化与结构鉴定
经HPLC检测如果底物转化良好，用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，用干净三角瓶收集代谢产物峰。将收集的代谢产物峰蒸干后，在分析型高效液相色谱仪上测定其纯度，再分别测定代谢产物的紫外吸收谱、质谱、核磁共振氢谱和碳谱。结果表明，该代谢产物在292纳米处有一最大紫外吸收峰（见图4）。经阴离子质谱测定分析，得知该代谢产物分子量为302（见图5），这恰好与二氢鸢尾黄素分子式C16H14O6相吻合。除质谱外，为准确解析该代谢产物的化学结构，对纯化后的代谢产物的核磁共振氢谱（1H-NMR）和碳谱（13C-NMR）分别进行了测定。通过谱图解析，最终将该代谢产物准确鉴定为二氢鸢尾黄素。代谢产物的1H-NMR和13C-NMR结果如下：
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.23 (1H, s, 5-OH), δ 10.70 (1H, s, 7-OH), δ 9.40 (1H, s, 4 
-OH), δ 7.08 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2 ,6 
), δ 6.72 (2H, d, J=8.4 Hz, H-3 ,5 
), δ 5.98 (1H, s, H-8), δ 4.51 (2H, d, J=6.6 Hz, H-2), δ 4.00 (1H, t, J=6.6 Hz, H-3), δ 3.66 (3H, s, 6-OCH3)。
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 198.1 (C-4), δ 160.0 (C-4 
), δ 158.5 (C-7), δ 157.2 (C-9), δ 156.0 (C-5), δ 130.1 (C-2 
,6 
), δ 129.6 (C-6), δ 126.1(C-1 
), δ 115.8 (C-3 
,5 
), δ 102.3 (C-10),δ 95.2 (C-8), δ 71.4 (C-2), δ 60.4 (6-OCH3), δ 49.8 (C-3)。（5）菌株JLC39对底物鸢尾黄素的转化动态
为了解菌株JLC39转化底物鸢尾黄素的速度，以便确定最佳转化时间，对菌株JLC39转化底物鸢尾黄素的转化动态进行了测定，具体方法如下：
将事先培养好的种子液（培养方法同上所述）按10%接种量接种到盛有100毫升BHI液体培养基（培养基初始pH调为5.5-6.0）的250毫升三角瓶内培养，同时加入60 毫摩尔/升的鸢尾黄素粗品1毫升，在厌氧工作站内培养6小时、12小时、24小时、48小时和72小时后分别取培养物100微升，用1000微升的乙酸乙酯萃取，取萃取液800微升，萃取液蒸干后加入80微升100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物被转化情况，根据不同培养时间底物和产物浓度绘制菌株转化动态（见图6）。由图6可知，底物加入6小时后即有39.5%的底物鸢尾黄素被转化；底物与菌共培养12小时后有81.8%的底物鸢尾黄素被转化；底物与菌共培养48小时产物二氢鸢尾黄素稍有上升，但第72小时产物二氢鸢尾黄素则有所降低。
4.菌株JLC39对不同浓度底物鸢尾黄素最大转化能力测定
将菌株JLC39分别与不同浓度的鸢尾黄素在厌氧工作站内共同培养60小时，然后用等体积乙酸乙酯对培养物进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物鸢尾黄素被转化情况。结果表明，当底物鸢尾黄素浓度为0.4毫摩尔/升和0.6毫摩尔/升时，生成的产物二氢鸢尾黄素的平均浓度分别为0.3076毫摩尔/升和0.4522毫摩尔/升，转化率为100%，当底物浓度为0.8毫摩尔/升和1.0毫摩尔/升时，生成的产物二氢鸢尾黄素的平均浓度分别为0.6061毫摩尔/升和0.7432毫摩尔/升，菌株JLC39对鸢尾黄素的平均转化率分别为94.2%和90.5%；当所加入的底物浓度为1.2毫摩尔/升和1.4毫摩尔/升时，生成的产物二氢鸢尾黄素的平均浓度分别为0.6187毫摩尔/升和0.4275毫摩尔/升，菌株JLC39对底物鸢尾黄素的平均转化率分别为为67.1%和37.3%（见图7）。
5.代谢产物二氢鸢尾黄素与底物鸢尾黄素及雌马酚对DPPH自由基体外清除能力比较
分别将底物鸢尾黄素纯品、产物二氢鸢尾黄素纯品和雌马酚纯品分别配制为10毫摩尔/升的母液，然后依次稀释为以下浓度：0.25毫摩尔/升、0.5毫摩尔/升、1.0毫摩尔/升，对比测定不同浓度下底物、产物和雌马酚对DPPH自由基的体外清除能力。结果表明，当浓度为0.25毫摩尔/升、0.5毫摩尔/升、1.0毫摩尔/升时，产物二氢鸢尾黄素对DPPH自由基的清除能力均极显著高于其母本化合物鸢尾黄素（p<0.01），同时也均极显著高于高活性植物雌激素雌马酚（p<0.01）（见图8）。
实施例2
本实施例采用鸢尾黄素粗品进行转化，鸢尾黄素粗品是从葛花甲醇粗提物酸水解产物经乙酸乙酯萃取获得；菌株JLC39的分离方法同实施例1。
（1）菌株AUH-JLC39的培养
将–70 
低温保存的鸡肠道分离菌株JLC39冻融后，按10%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37 
下培养20小时后试管中菌液呈絮状混浊。再以13%接种量将试管中已长混浊的菌株JLC39重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的塑料离心管中，继续在厌氧工作站内培养20小时作为种子液；
（2）底物鸢尾黄素与菌株AUH-JLC39共培养与代谢产物的分离纯化
在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株JLC39的种子液按10%接种量转接到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入50毫摩尔/升的鸢尾黄素粗品2 毫升（鸢尾黄素浓度根据鸢尾黄素粗品中鸢尾黄素峰面积值及鸢尾黄素纯品的标准曲线进行计算）, 在厌氧工作站内培养60小时。用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，测得产物二氢鸢尾黄素的浓度为0.7478毫摩尔/升, 转化率为91.9%。
实施例3
本实施例采用鸢尾黄素纯品进行转化，鸢尾黄素纯品是从葛花甲醇粗提物酸水解产物经高效液相分离制备获得；菌株JLC39的分离方法同实施例1。
（1）菌株AUH-JLC39的培养
将–70 
低温保存的鸡肠道分离菌株JLC39冻融后，按13%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37 
下培养22小时后试管中菌液呈絮状混浊。再以12%接种量将试管中已长混浊的菌株JLC39重新转接到盛有新鲜BHI液体培养基的塑料离心管中，继续在厌氧工作站内培养18小时作为种子液；
（2）底物鸢尾黄素与菌株AUH-JLC39共培养与代谢产物的分离纯化
在厌氧工作站内将上述事先培养好的菌株JLC39的种子液按13%接种量转接到盛有100毫升液体培养基的250毫升三角瓶内培养，同时加入60毫摩尔/升的鸢尾黄素纯品1.25 毫升（鸢尾黄素浓度根据鸢尾黄素纯品中鸢尾黄素峰面积值及鸢尾黄素纯品的标准曲线进行计算）, 在厌氧工作站内培养56小时。用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后在旋转蒸发仪上蒸干，然后加入100%甲醇溶液，过孔径为0.45微米的有机膜后用制备柱在HPLC上进行分离制备，测得二氢鸢尾黄素的浓度为0.5618毫摩尔/升，转化率为93.9%。
（3）菌株JLC39对不同浓度底物鸢尾黄素纯品最大转化能力测定
将鸢尾黄素纯品配成40毫摩尔/升母液备用。将菌株JLC39分别与不同浓度的鸢尾黄素纯品在厌氧工作站内共同培养60小时，然后用等体积乙酸乙酯对培养物进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇溶液，并用HPLC检测底物鸢尾黄素纯品被转化情况。结果表明，当底物鸢尾黄素浓度低于0.4毫摩尔/升时，菌株JLC39能将加入到培养基中的底物鸢尾黄素全部转化为产物二氢鸢尾黄素当所加入底物浓度为0.6毫摩尔/升和0.8毫摩尔/升时，生成的产物二氢鸢尾黄素的平均浓度分别为0.4706毫摩尔/升和0.5973毫摩尔/升，菌株JLC39对鸢尾黄素纯品的平均转化率分别为96.7%和 92.6%；当所加入的底物浓度为1.0毫摩尔/升时，转化率急剧下降，生成的产物二氢鸢尾黄素的浓度为0.4276毫摩尔/升，菌株JLC39对底物鸢尾黄素纯品平均转化率分别为55.9%。
Claims (2)
1.一种梭菌（Clostridium sp.）AUH-JLC39，保藏号为CGMCC No.7221。
2.如权利要求１所述的梭菌AUH-JLC39在鸢尾黄素转化中的应用，其特征在于包括下述步骤：
（1）菌株AUH-JLC39的培养
将低温冷冻保存的梭菌AUH-JLC39融化并按10-15%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37°C下培养20-24小时；再以10-15%接种量将试管中的菌株AUH-JLC39重新转接到盛有新鲜BHI液体的培养基中，继续在厌氧工作站内培养18-24小时作为种子液；
（2）底物鸢尾黄素与菌株AUH-JLC39共培养与代谢产物的分离纯化
①底物鸢尾黄素与菌株AUH-JLC39共培养
将菌株AUH-JLC39的种子液按10-15%接种量转接到液体培养基中培养，根据三角瓶中培养基体积加入浓度为40-60毫摩尔/升鸢尾黄素母液，使得鸢尾黄素在培养基中的浓度为0.8-1.0毫摩尔/升，然后在厌氧工作站内培养48-60小时，即可将底物鸢尾黄素高效转化为二氢鸢尾黄素；
②代谢产物的分离纯化
用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离制备二氢鸢尾黄素。
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Application publication date: 20130612 Assignee: SHENYANG MEIHUA AGRICULTURE Co.,Ltd. Assignor: AGRICULTURAL University OF HEBEI Contract record no.: X2023980051110 Denomination of invention: Clostridium AUH-JLC39 and its application in the transformation of irisin Granted publication date: 20140416 License type: Common License Record date: 20231208 |