CN101481669B - 一种淡紫灰链霉菌及其活性产物的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物农药技术领域，公开了一种淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae)xjy，该菌株已于2007年8月16日保藏在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CCMCC No.2130。还公开了该菌株的分离与鉴定方法、xjy菌株的抗菌活性物质的制备方法、活性物质的分析结构鉴定及xjy菌株代谢活性物质对蕃茄叶霉病、黄瓜白粉病、辣椒疫病的防治试验和对植株长势的促生试验。xjy菌株分泌的抗菌活性物质主要为核苷类抗生素，具有效果持久、不会产生药害等特点，对蔬菜病害具有显著的防治效果和一定的促生作用。

Description

一种淡紫灰链霉菌及其活性产物的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种新的淡紫灰链霉菌及其活性产物的制备方法和应用。

背景技术

由于化学农药的长期使用，使植物病害存在对杀菌剂的适应性变异，在某些杀菌剂的长期选择压力下，可以产生明显的抗药性，从而导致化学防治的失败。生产中应综合地考虑不同杀菌剂的应用策略，以充分发挥各种杀菌剂的作用，尽量避免抗药性的产生。自Waksman和Henrici于1943年建立链霉菌属以来，链霉菌已成为放线菌中数量最多而且产生抗生素种类也最多的一个属，约有1000多个种和变种。

农用抗生素作为生物农药中的重要类群，较其它生物农药具有更高效、快速、安全等优点，且均在农作物病虫害防治工作中发挥着重要作用。但是，目前我国生物农药的市场占有率仅有2～3％，其潜力远没有得到充分的开发和应用。

发明内容

本发明的目的旨在探寻生物农药的新来源，利用土壤微生物资源而开发一种可以用于植物真菌病害防治的广谱、高效、可产业化生产的淡紫灰链霉菌及活性产物的制备方法。

实现上述本发明目的的具体技术方案如下：

一种淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)xjy，(以下简称为xjy菌株)，于2007年8月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2130，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

本发明的xjy菌株是从中国新疆棉田土壤的51株土壤放线菌中筛选出6株对番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)有抑制活性，其中菌株xjy的抑制效果最好。测定xjy菌株抗菌谱发现其无菌发酵滤液对23种常见植物病原真菌和6种细菌均有不同程度的抑制效果，且xjy菌株具有良好的传代抑菌稳定性，可产生β-1，3-葡聚糖酶和蛋白质酶。xjy菌株具有以下特征：①高氏一号培养基上气生菌丝淡紫灰，日久成灰色，基内菌丝浅黄色，无可溶性色素产生；②孢子丝呈宽大顶端螺旋形，带有长柄，孢子柱形，表面光滑，常在气丝上形成长孢子链；③生理生化反应表现为：能使明胶液化，牛奶凝固，淀粉水解，产生硫化氢；并且可以在纤维素上生长，但不分解滤纸；可以利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、淀粉、肌醇、鼠李糖和山梨糖。④16S rDNA序列分析结果在GeneBank中进行最大同源性比较，发现16S rDNA测序结果与淡紫灰链霉菌16S rDNA序列同源性达到99.6％。

通过对xjy菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁组分分析和16S rDNA同源性序列分析，确定其为淡紫灰链霉菌。

本发明还有一个目的是提供xjy菌株的无菌上清液，由下列方法制备而成：首先将种子培养基(每升含5g蛋白胨，3g酵母膏，2g葡萄糖，1g牛肉膏，pH7.0，装液量40mL/250mL)在28℃、80r/min振荡培养2d制成种子液；然后加10％种子液在发酵培养基中(含大豆粉2％、葡萄糖2％、NaCl 0.8％、CaCO₃ 0.2％、(NH₄)₂SO₄ 0.32％，pH7.0，装液量40mL/250mL)在28℃、180r/mim摇瓶培养6d，发酵液经13000rpm离心2次，每次20min，即得无菌上清液。

本发明还有一个目的是提供xjy菌株的抗菌活性物质，具有以下化学式C₁₄H₁₉O₇N₃和(I)表示的化学结构式：

本发明人通过对菌株xjy发酵后的无菌上清液的稳定性测定发现，菌株xjy产生的活性物质具有较好的热稳定性、酸碱稳定性和光照紫外稳定性，为碱性水溶性物质。将xjy菌株的发酵无菌上清液用草酸调pH值至2沉淀过夜，抽滤后用等体积的丙酮在50℃水浴中保温1h，过滤浓缩除去丙酮后将pH调至7，过滤得到预处理抗菌活性物质；无菌发酵滤液通过预处理、活性碳吸附法、离子交换法、树脂吸附法、硅胶柱层析法分离得到活性物质的粗品；经凝胶柱和反相柱层析提纯得到活性物质的纯品；活性物质纯品的理化特性测定发现纯品溶于水，不溶于一般有机溶剂，在α-奈酚反应试验、茚三酮反应试验和品红反应试验中呈阳性，熔点为200～204℃，比旋光度为[α]D＝+22.3°。通过紫外吸收光谱、红外吸收光谱、质谱和核磁共振谱的测定和分析，最后推出纯品的分子量为341，分子式为C₁₄H₁₉O₇N₃和化学结构式。

本发明的xjy菌株的抗菌活性物质成分的分析通过活性物质的预处理、粗品的分离和纯品的提取等技术获得，从红外光谱的分析得出纯品应该含有，-COOH、-NH₂、＞C＝C＜、CH₂、-CH₃、-C＝O、C-O-C、COOR和糖肽类结构基团。从¹³C核磁共振碳谱、¹H核磁共振氢谱和二维图谱的分析得出，分子中应含有14个碳原子，分子中含有一个羰基碳原子、己糖五个碳原子、碳原子上连接氨基和碳原子上连接氧的共振峰，经鉴定为核苷类抗生素。

本发明还有一个目的是提供淡紫灰链霉菌xjy菌株在防治番茄叶霉病、黄瓜白粉病和辣椒疫病病害中应用。

本发明还有一个目的是提供淡紫灰链霉菌xjy菌株的无菌上清液在防治番茄叶霉病、黄瓜白粉病和辣椒疫病病害中应用。

防治番茄叶霉病、黄瓜白粉病和辣椒疫病病害中应用。

本发明还有一个目的是提供淡紫灰链霉菌xjy的抗菌活性物质(I)在促进番茄和辣椒生长中的应用。

本发明的优点及效果：具有稳定的天然原料来源，菌种来源于土壤，筛选方法简单；发酵过程中所用原料主要有大豆粉和葡萄糖，成本较低；抗菌活性物质制备简单，操作方便，产品质量稳定，对光、热、酸碱均有良好的稳定性。本物质对农作物无药害，绿色环保，防治蔬菜病害效果较好。

附图说明

图1本发明xjy菌株的抗菌活性物质对几种植物病原菌的抑制作用图。

图2本发明xjy菌株的形态图。

图3本发明xjy菌株的抗菌活性物质热稳定性结果图。

图4本发明xjy菌株的抗菌活性物质在极性大孔树脂上的洗脱液层析图。

图5本发明xjy菌株的抗菌活性物质在凝胶柱上的洗脱图。

图6本发明xjy菌株的抗菌活性物质纯品的红外光谱图。

图7本发明xjy菌株的抗菌活性物质纯品的¹³C-NMR图。

图8本发明xjy菌株的抗菌活性物质纯品的¹H-¹H COSY图。

图9本发明xjy菌株的抗菌活性物质纯品的HSQC图。

图10本发明xjy菌株的抗菌活性物质纯品的结构图。

图11本发明xjy菌株的抗菌活性物质对黄瓜白粉病的温室防治图。

图12本发明xjy菌株的抗菌活性物质对辣椒疫病的温室防治图。

图13是本发明xjy菌株的抗菌活性物质对番茄叶霉病菌的田间防治作用图。

图14本发明xjy菌株的抗菌活性物质辣椒植株长势的促生作用图。

具体实施方式

下面用实例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例一：菌株xjy的筛选和鉴定

通过皿内抑菌试验，从51株土壤放线菌中筛选出6株对番茄叶霉病菌(Fulviafulva)有抑制活性，其中菌株xjy的抑制效果最好。测定菌株xjy抗菌谱发现其无菌发酵滤液对23种常见植物病原真菌和6种细菌均有不同程度的抑制效果(图1，A：番茄叶霉病菌B：小麦纹枯病菌C：猕猴桃干枯病菌D：梨腐烂病菌。)，且菌株xjy具有良好的传代抑菌稳定性，可产生β-1，3-葡聚糖酶和蛋白质酶；通过对菌株xjy的形态特征(图2A：孢子；B：菌丝)、培养特征、生理生化特征、细胞壁组分分析和16S rDNA同源性序列分析，确定菌株xjy为淡紫灰链霉菌。

实施例二：菌株xjy抗菌活性物质的制备方法

首先在种子培养基(每升含5g蛋白胨，3g酵母膏，2g葡萄糖，1g牛肉膏，pH7.0，装液量40mL/250mL)上28℃、80r/min振荡培养2d制成种子液；然后加10％种子液在发酵培养基中(每升含大豆粉2％、葡萄糖2％、NaCl 0.8％、CaCO₃0.2％、(NH₄)₂SO₄0.32％，pH7.0，装液量40mL/250mL)在28℃、180r/mim摇瓶培养6d，发酵液经13000rpm离心2次，每次20min，即得无菌上清液。

实施例三：菌株xjy产生的活性物质的性质和结构分析

通过对菌株xjy发酵后的无菌上清液的稳定测定发现，菌株xjy产生的活性物质具有较好的热稳定性(图3，①A：50℃30min；①B：50℃60min；①C：50℃90min；①D：50℃120min；①E：50℃150min；①F：无菌上清液；②A：100℃30min；②B：100℃60min；C：100℃90min；D：100℃120min；E：100℃150min；F：无菌上清液)、酸碱稳定性和光照紫外稳定性，为碱性水溶性物质；将xjy菌株的发酵无菌上清液用草酸调pH值至2沉淀过夜，抽滤后用等体积的丙酮在50℃水浴中保温1h，过滤浓缩除去丙酮后将pH调至7，过滤得到预处理抗菌活性物质；预处理发酵液上样于活性碳柱，用50％的丙酮进行洗脱，收集有生物活性的试管合并，旋转蒸发浓缩至小体积；然后上样于732阳离子交换树脂中，用0.2mol/L的氨水进行洗脱，收集有生物活性的试管合并，旋转蒸发浓缩至小体积备用；用732树脂浓缩液作为样品上样于极性树脂，先用无水乙醇进行洗脱弃去，再用无离子水进行洗脱，收集水流出液浓缩得浓缩液用作弱极性树脂的上样样品，同时采用薄层层析法进行各种洗脱液的层析检测，展层剂为氯仿∶乙醇∶水∶正丁醇(8∶12∶2∶16)，结果表明先用无水乙醇进行洗脱可以除去大量杂质(图4，A：上样液；B：无水乙醇洗脱液；C：水洗脱液)；将极性柱的水洗浓缩液上样于弱极性树脂中，然后用20％的乙醇进行洗脱，收集流出的洗脱液浓缩后上样于硅胶柱，先用醋酸∶丙酮∶甲醇∶正丁醇∶氯仿(1∶4∶12∶16∶8)进行洗脱，然后用水洗脱，将水洗液干燥得到粗品；用过硅胶柱的浓缩液上样于Amersham公司的Superdex peptide 10/300GL凝胶柱，用超纯水进行洗脱，在波长为280nm下检测吸收值，将各峰的收集管合并冷冻干燥，发现洗脱的8个峰的颜色由褐色变为黄色，颜色逐渐变浅，并且洗脱第8峰为活性峰(图5，A-H：8个洗脱峰)。用过凝胶柱的浓缩液上样于Amersham公司的Resource RPC型反相柱，用0％A～100％A进行梯度洗脱，A为含1％甲酸的水溶液，B为甲醇∶乙腈(4∶1)，在波长280nm下检测吸收值，结果分4段合并干燥检测活性，干燥后的样品颜色逐渐变深，经检测发现只有1号峰有活性，将活性收集液合并浓缩再次上样，用乙腈∶水∶甲醇(4∶96∶24)进行洗脱，洗脱后只有两个洗脱峰，其中1洗脱峰有活性，合并浓缩干燥得近白色纯品；活性物质纯品的理化特性测定发现纯品溶于水，不溶于一般有机溶剂，在α-奈酚反应试验、茚三酮反应试验和品红反应试验中呈阳性，熔点为200～204℃，比旋光度为[α]D＝+22.3°。通过紫外吸收光谱(图6)、红外吸收光谱、质谱和核磁共振谱(图7-9)的测定和分析，最后推出纯品的分子量为341，分子式为C₁₄H₁₉O₇N₃和化学结构式(图10)；

实施例四：菌株xjy活性物质对番茄叶霉病、黄瓜白粉病和辣椒疫病的盆栽防治试验

采用温室活体接种方法，处理采用提前喷药后接种病原菌、同时喷药接种病原菌和接种病原菌后喷药3种处理方式，通过预试验浓度的摸索确定防治试验采用的合适浓度，以清水、黄豆粉营养液(即发酵培养基)为喷药对照，同时设空白对照(不做任何处理)，试验重复3次，防治试验发现，菌株xjy产生的活性物质对番茄叶霉病(表1)、黄瓜白粉病(图11，A：接菌后喷清水对照；B：接种前喷无菌上清液10倍稀释液的防治效果)和辣椒疫病(图12，A：接菌后喷清水对照；B：接种前喷无菌上清液10倍稀释液的防治效果)均有较好的防治效果，但对不同病害的防治效果有所差异。不同稀释度的无菌发酵滤液防治效果测定表明，随稀释度的增加防治效果有所降低；不同施用时间测定表明，提前施药的防治效果优于接种后施药处理和同时施药处理的防治效果；粗品和多菌灵对番茄叶霉病的防治效果、粗品和甲霜灵对黄瓜白粉病的防治效果比较发现，相同浓度下粗品的防治效果优于两种农药，具有较好的效果；

表1无菌滤液对番茄叶霉病的温室防治效果

实施例五：菌株xjy活性产物对番茄叶霉病的田间预防和防治试验

采用田间自然发病调查番茄叶霉病的预防和防治试验，发现菌株xjy的无菌培养滤液对番茄叶霉病有较好的预防和防治效果(图13，A：对照(第一小区)；B：发病后喷三次无菌上清液5倍稀释液的防治效果(第一小区)；C：对照(第三小区)；D：发病后喷三次无菌上清液5倍稀释液的防治效果(第三小区)。)。同等浓度下，随喷药次数的减少预防和防治效果有所降低；同等喷药次数下，随稀释度的增加预防和防治效果也有所降低(表2)；

表2培养滤液对番茄叶霉病的田间防治效果

实施例六：菌株xjy活性物质对番茄和辣椒的促进作用

通过灌根处理番茄苗和辣椒苗，以清水和黄豆粉营养液(即发酵培养基)灌根为对照，试验重复3次。结果发现，无菌培养滤液不仅对番茄植株的长势和根的生长有促进(表3)，而且对辣椒植株的长势也有促进作用，且随培养滤液浓度的增加效果增加(图14)。

表3培养滤液对番茄植株长势的影响

Claims (2)

1.一株淡紫灰链霉菌，其分类命名为链霉菌(Streptomyces lavendulae)xjy，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年8月16日，登记入册编号为CCMCC No.2130。

2.权利要求1所述的淡紫灰链霉菌xjy菌株在防治番茄叶霉病、黄瓜白粉病和辣椒疫病病害中应用。

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