CN113373093B

CN113373093B - 链霉菌hl-66、其发酵产物、菌剂及用途

Info

Publication number: CN113373093B
Application number: CN202110797798.7A
Authority: CN
Inventors: 韩立荣; 孙宇波; 吴皓; 唐诗琪; 谷丽花; 田向荣
Original assignee: Weinan Dongwang Nonghua Biotechnology Co ltd; Northwest A&F University
Current assignee: Weinan Dongwang Nonghua Biotechnology Co ltd; Northwest A&F University
Priority date: 2021-07-14
Filing date: 2021-07-14
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2041-07-14
Also published as: CN113373093A

Abstract

本发明涉及微生物及植物免疫诱抗剂技术领域，具体涉及链霉菌HL‑66、其发酵产物、菌剂及用途。本发明的链霉菌HL‑66于2021年6月08日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22674，本发明的链霉菌HL‑66能够代谢链霉多聚糖A，其具有广谱的抗病毒和抑菌活性，且能够激发植物自身对多种真菌及病毒病害的抗病性，在防治农业病害方面具有广阔的应用前景。

Description

链霉菌HL-66、其发酵产物、菌剂及用途

技术领域

本发明涉及微生物及植物免疫诱抗剂技术领域，具体涉及链霉菌HL-66、其发酵产物、菌剂及用途。

背景技术

诱导植物免疫抗性是近年来兴起的一种绿色植物保护防控手段。该方法的根本在于利用植物自身分子免疫系统，达到病害的防控目标，这是一种不同于传统农药防治的、对生态和环境友好的植物保护方法。诱导子作为植物诱导抗性的主要因子，具有增强植物广谱抗病能力，同时还具有提高植物抗逆和促进植物生长的功能。利用诱导子诱导植物免疫抗性进行生物防治，可从源头上减少化学农药的使用量，尤其符合当今食品安全和农业可持续发展的要求。

然而，目前的植物免疫诱抗剂对不同植物具有选择性，适用范围较小。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题，为此，本发明的目的之一，提供一株链霉菌HL-66，该菌株保藏编号为：CGMCC No.22674。

本发明的目的之二，提供所述链霉菌HL-66的发酵产物，所述发酵产物为链霉多聚糖A，制备方法包括以下步骤：

S1、将所述链霉菌HL-66的孢子接种于种子培养基，25-26℃培养3-5天，既得菌种；将菌种按接种量3％-9％接种于发酵培养基中发酵，28-30℃下培养5-6天，收集发酵液；

S2、发酵液经固液分离获得上清液，上清液浓缩冻干，将冻干物加入水溶解，沸水提取3-5小时，过滤除杂，浓缩，加入4-20倍体积的无水乙醇，搅拌、沉淀过夜、抽滤，得到沉淀物；

S3、将沉淀物重新用水溶解，加入Sevag试剂，震荡、静置、离心、除蛋白，流水透析得粗多糖；

S4、使用DEAE Sepharose Fast Flow对粗多糖进行极性分离，调整流速为5mL/min，蒸馏水平衡2h；上清液上样，通过全自动凝胶纯化系统进行纯化，结合示差检测器在线检测收集160-190min组分，得到链霉多聚糖A。

更进一步的，每升的种子培养基中含有：酵母提取物3-5g，葡萄糖3-5g，K₂HPO₄ 3-5g，KH₂PO₄ 0.4-0.6g，NaCl 0.9-1.1g，微量盐溶液1-1.2mL，pH7.5。

更进一步的，每升的发酵培养基中含有：葡萄糖20-22g，微量盐溶液5-6mL，pH7.2-7.6。

更进一步的，每升的微量盐溶液中含有：CuCl₂ 0.0004-0.0005g，FeSO₄ 0.0004-0.0005g，ZnCl₂ 0.0004-0.0005g，MnCl₂·4H₂O 0.0004-0.0005g，CaCl₂ 0.0004-0.0005g。

本发明的目的之三，提供以所述链霉菌HL-66的发酵产物为有效成分的菌剂。

本发明的目的之四，提供所述菌剂在制备提高植物自身抗病性的产品中的用途。

进一步的，真菌病害包括：番茄灰霉病、黄瓜枯萎病、马铃薯晚疫病、油菜菌核病、苹果腐烂病、烟草赤星病和烟草黑胫病；病毒病害包括：烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、番茄黄化曲叶病毒病和小麦黄矮病毒病。

本发明的附加方面和优点将在具体实施部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

保藏说明：

菌种名称：链霉菌；

拉丁名：Streptomyces sp.；

菌株编号：HL-66；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2021年6月08日；

保藏编号：CGMCC No.22674。

附图说明

图1为链霉菌HL-66的16S rDNA基因序列的系统进化发育进化树。

图2为链霉多聚糖A红外图谱分析。

图3为链霉多聚糖A氢谱分析。

图4为链霉多聚糖A碳谱分析。

图5为链霉多聚糖A的分子式。

图6为链霉多聚糖A处理不同植物叶片后叶片发生超敏反应的表型图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：链霉菌HL-66的鉴定

本实施例的链霉菌HL-66分离于陕西秦岭高山草甸土(海拔1100米)。以下根据16SrDNA基因序列在微生物种属中的保守性，对链霉菌HL-66进行鉴定。提取链霉菌HL-66的基因组，PCR扩增其16SrDNA基因并进行测序，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。系统发育进化树如图1所示。

结果表明，该菌属于链霉菌属的一种，据此将该菌命名为链霉菌(Streptomycessp.)HL-66。

实施例2：链霉多聚糖A的分离、制备及结构鉴定

1、链霉多聚糖A的分离、制备

(1)将链霉菌HL-66的孢子接种于种子培养基，25℃培养3-5天，既得菌种；将菌种按接种量3％-9％接种于发酵培养基中发酵，30℃下培养5天，收集发酵液。

每升的种子培养基中含有：酵母提取物4g，葡萄糖4g，K₂HPO₄ 4g，KH₂PO₄ 0.5g，NaCl 1g，微量盐溶液1mL，余量为无菌水，pH7.5。

每升的发酵培养基中含有：葡萄糖20g，微量盐溶液5mL，余量为无菌水，pH7.4。

每升的微量盐溶液中含有：CuCl₂ 0.0005g，FeSO₄ 0.0004-0.0005g，ZnCl₂0.0005g，MnCl₂·4H₂O 0.0005g，CaCl₂ 0.0005g，余量为无菌水。

(2)发酵液经固液分离获得上清液，上清液浓缩冻干，将冻干物加入水溶解，沸水提取4小时，过滤除杂，浓缩，加入10倍体积的无水乙醇，搅拌、沉淀过夜、抽滤，得到沉淀物。

(3)将沉淀物重新用水溶解，加入Sevag试剂，震荡、静置、离心、除蛋白，1000D透析袋，流水透析得粗多糖。

(4)用蒸馏水溶解粗多糖，加热，斡旋，12000rpm离心，取上清液上样。调整流速为15ml/min的蒸馏水进行洗脱。四组溶剂洗脱：三倍柱体积的水、0.2M NaCl、0.5M NaCl、1.0MNaCl洗脱。苯酚硫酸法进行追踪检测。酶标仪490nm进行检测。绘制散点图。根据峰形，分别收集，浓缩，3500Da透析袋透析，冷冻干燥。得到待纯化多糖组分，分别命名为：-W,-0.2M,-0.5M,-1.0M，并计算得率分别为53.6％，18.85％，2.1％，3.5％。

称取适量待纯化多糖，适量蒸馏水溶解，12000rpm离心10min，上清液上样，通过全自动凝胶纯化系统(BRT-GS)进行纯化，结合示差检测器(RI-502SHODEX)在线检测收集，收集对称峰。只收集第一个峰的对称部分即160-190min，作为组分A、第一个峰的对称部分200-220min为B组分。得到凝胶柱分离纯化过的多糖W-A、W-B，经给活性验证W-A具有活性，后续对W-A进行鉴定。

2、链霉多聚糖A的结构鉴定

通过HPGPC测定多糖W-A分子量和纯度。得到lgMp-RT(峰位分子量)，lgMw-RT(重均分子量)，lgMn-RT(数均分子量)校正曲线。根据标准品曲线，得出计算公式进而计算出每个样品的分子量大小。取16种单糖标准品配成标准母液溶液。取各单糖标准溶液精密配置浓度标准品作为混标。根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比。

根据多聚糖A红外光谱(图2)，吸收带在3600-3200cm-1是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。具体如下：3380cm-1是O-H的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2925cm-1处有一个吸收峰，归属于C-H伸缩振动。在1639cm-1处有一个吸收峰，可能归属于结晶水。在1419cm-1处和1145cm-1处有吸收峰，归属于C-O伸缩振动。在1361cm-1处有吸收峰，可能归属于C＝O对称伸缩振动。在1020cm-1处有一个吸收峰，可能归属于O-H变角振动。在925cm-1处有一个吸收峰，可能归属于吡喃环非对称环伸缩振动。在850cm-1处有一个吸收峰，可能归属于吡喃环α-端基差向异构的C-H变角振动。氢谱信号(图3)主要集中在3.0-5.5ppm之间。δ3.2-4.0ppm为糖环质子信号，主要端基质子峰δ5.31、5.26、4.89的信号峰集中分布在4.3-5.5ppm区域内。碳谱分析在13C NMR(201MHz,D2O)：核磁碳谱信号主要集中在60-120ppm之间(图4)。通过观察碳谱，可以看到主要异头碳信号峰δ101.33、101.01、99.88、99.27异头碳区域主要在δ93-105之间。根据单糖组成结果，说明该多糖主要为葡聚糖。

Dept135图谱分析，δ68.95、62.3、61.89ppm峰为倒峰，表明为C6的化学位移。通过HSQC图谱，可以观察到异头碳信号为δ101.01，HSQC图谱中对应的异头氢信号是δ5.31，通过HH-COSY，H1-2的信号为5.31/3.55；H2-3的信号为3.55/3.88；H3-4的信号为3.88/3.57；H4-5的信号为3.57/3.76H5-6的信号为3.76/3.787我们可以推断出H1-H6a分别为δ5.31、3.55、3.88、3.57、3.76、3.78。HSQC得知H6b为3.75ppm。对应的C1-6分别为101.01、72.91、74.75、78.31、72.53、61.89。因此，该信号应归属于糖苷键→4)-α-Glcp-(1→。

HMBC图谱中，根据核磁一维二维图谱，我们对多糖的糖苷键信号进行归属；糖苷键→4)-α-D-Glcp-(1→的异头氢与其自身的C4有相关信号峰；另外异头碳与其自身的H4有相关信号峰；表明存在→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→的链接方式。→4)-α-D-Glcp-(1→的异头氢分别与糖苷键→4,6)-α-D-Glcp-(1→的C4有相关峰，表明存在糖苷键→4)-α-D-Glcp-(1→4,6)-α-D-Glcp-(1→。此外，NOESY图谱中α-D-Glcp-(1→的异头氢分别与糖苷键→4,6)-α-D-Glcp-(1→的H6有相关峰，表明存在糖苷键α-D-Glcp-(1→4,6)-α-D-Glcp-(1→。

综上所述，链霉多聚糖A结构特征包括：分子量约为14941Da；多糖部分由2种单糖组成，分别是葡萄糖和半乳糖醛酸氨基葡萄糖和半乳糖(0.994:0.006)；主要糖苷键结构方式为：主链连接方式为→4)-α-D-Glcp-(1→的糖苷键，而端基α-D-Glcp-(1→通过→4,6)-α-D-Glcp-(1→的O-6键连接在主链上；高温处理对其二级结构影响不大，其结构较为新颖(图5)。

实施例3：链霉多聚糖A对油菜菌核病的室内药效测定

采用离体叶片法测定链霉多聚糖A对油菜菌核病的防效。在盆栽油菜上选择相同叶位、长势一致的叶片，从叶柄1-2cm剪下，用湿润的脱脂棉包裹叶柄，备用。将链霉多聚糖A用质量分数0.05％的吐温-80水溶液配制成所需浓度的药液，对油菜叶片均匀喷雾。保护作用测定在多聚糖A处理24h后接种病原菌，治疗作用测定在多聚糖A处理前24h接种病原菌。处理后盖上塑料薄膜保湿，25℃恒温黑暗培养12h，之后光照黑暗12h交替进行。以5％氨基寡糖素(200μg/mL)和清水分别作为阳性和阴性对照。3d后视空白对照发病情况调查结果，十字交叉法测量病斑直径，并计算防效，结果如表1所示。

表1链霉多聚糖A对油菜菌核病的室内药效

结果表明，不同供试浓度下，链霉多聚糖A对油菜菌核病菌有一定的保护作用和治疗作用，其效果均优于200μg/mL的对照药剂。

实施例4：链霉多聚糖A对烟草花叶病毒的治疗作用

选择两周左右、长势一致的4-5叶期的心叶烟进行抗病毒活性测定。先每叶接种20μL浓度为10μg/mL的TMV，1d后再全株喷施一定浓度的链霉多聚糖A。接种病毒1d后喷施无菌水作为空白对照。以5％氨基寡糖素(200μg/mL)为阳性对照药剂。温室培养3d后统计枯斑数，计算防效，结果如表2所示。

表2链霉多聚糖A对烟草花叶病毒的治疗作用

试验结果表明：链霉多聚糖A对烟草花叶病毒有较好的治疗效果，在浓度为200、100、50μg/mL时，治疗效果分别为83.33％、68.79％、48.18％；100μg/mL的链霉多聚糖A对烟草花叶病毒的防效与200μg/mL的对照药剂相当。

实例5：链霉多聚糖A对苹果腐烂病的室内药效测定

用离体枝条法测定链霉多聚糖A对苹果腐烂病的离体防效。选取无病粗老枝，将其截成15cm长的小段，用5％NaClO进行表面消毒，备用。在枝条中部切小口(切到木质部即可)，测定药剂保护作用时，用移液枪吸取10μL药剂于切口处，之后涂抹10μL菌液，16℃保湿培养；测定药剂治疗作用时，用移液枪吸取10μL菌液于切口处，3d后涂抹不同浓度供试药剂，16℃保湿培养。隔14d检查结果，计算病情指数，结果如表3所示。

表3链霉多聚糖A对苹果腐烂的室内药效

试验结果表明，链霉多聚糖A对苹果腐烂病有一定的保护和治疗效果作用，其保护和治疗效果均高于200μg/mL的对照药剂。

实施例6：链霉多聚糖A能够诱导不同植物的超敏反应

植物的一个最为显著的抗病反应就是在病原物侵染处诱发局部的细胞死亡，被称为“超敏反应”。超敏反应可以将病原物限制在侵染部位，防止其进一步扩散。有关超敏反应与植物抗真菌病害、病毒病和线虫病的相关报道已有很多。本试验，通过链霉多聚糖A处理不同植物叶片，发现100μg/mL的链霉多聚糖A能够诱发番茄、豇豆、烟草、上海青小白菜、南瓜和核桃等多种植物叶片产生超敏反应(图6)。以此进一步证明链霉多聚糖A对不同病害的防控主要机制是诱发了植物自身的抗病性，并且对不同植物不具有选择性，具有巨大开发应用潜力。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 西北农林科技大学,渭南东旺农华生物科技有限公司

<>

<120> 链霉菌HL-66、其发酵产物、菌剂及用途

<>

<160> 1

<>

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<>

<210> 1

<211> 1243

<212> DNA

<213> 链霉菌（Streptomyces sp.）HL-66

<>

<400> 1

aacgctctct attgatcaca ttttacgctg cattcactca tatacatatt cgtgtggggg 60<>

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Claims

1.链霉菌（Streptomyces sp.）HL-66，其特征在于，该链霉菌保藏编号为：CGMCC No.22674。

2.权利要求1所述链霉菌HL-66的发酵产物，其特征在于，所述发酵产物为链霉多聚糖A，其制备方法包括以下步骤：

S1、将所述链霉菌HL-66的孢子接种于种子培养基，25-26℃培养3-5天，既得菌种；将菌种按接种量3%-9%接种于发酵培养基中发酵，28-30℃下培养5-6天，收集发酵液；

3.根据权利要求2所述链霉菌HL-66的发酵产物，其特征在于，每升的种子培养基中含有：酵母提取物3-5g，葡萄糖3-5g，K₂HPO₄ 3-5g，KH₂PO₄ 0.4-0.6 g，NaCl 0.9-1.1g，微量盐溶液1-1.2mL，pH7.5。

4.根据权利要求3所述链霉菌HL-66的发酵产物，其特征在于，每升的发酵培养基中含有：葡萄糖20-22g，微量盐溶液5-6mL，pH7.2-7.6。

5.根据权利要求4所述链霉菌HL-66的发酵产物，其特征在于，每升的微量盐溶液中含有：CuCl₂0.0004-0.0005g ，FeSO₄ 0.0004-0.0005g，ZnCl₂ 0.0004-0.0005g，MnCl₂·4H₂O0.0004-0.0005g，CaCl₂ 0.0004-0.0005g。

6.以权利要求5所述链霉菌HL-66的发酵产物为有效成分的菌剂。

7.权利要求6所述菌剂在制备提高植物自身抗病性的产品中的用途。

8.根据权利要求7所述菌剂在制备提高植物自身抗病性的产品中的用途，其特征在于，所述抗病是指抗真菌病害和抗病毒性病害，真菌病害包括：番茄灰霉病、黄瓜枯萎病、马铃薯晚疫病、油菜菌核病、苹果腐烂病、烟草赤星病和烟草黑胫病；病毒病害包括：烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、番茄黄化曲叶病毒病和小麦黄矮病毒病。