KR101695918B1 - 딸기 화분으로부터 분리한 곤충병원균 또는 딸기 진균병 병원균에 대해 항균활성을 갖는 스트렙토마이세스 바디우스 sp6c4 균주 및 이의 용도 - Google Patents

딸기 화분으로부터 분리한 곤충병원균 또는 딸기 진균병 병원균에 대해 항균활성을 갖는 스트렙토마이세스 바디우스 sp6c4 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 딸기 화분으로부터 분리한 곤충병원균에 대해 항균활성을 갖는 스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서는 딸기 화분으로부터 분리된 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주가 곤충병원균 및 딸기 진균병 병원균의 생장을 억제시키는 것을 확인하였다. 본 발명의 스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4 균주는 농약의 부작용으로 발생하는 환경 오염 및 잔류 농약으로 인한 인체 독성의 위험성이 없는 친환경적인 생물 농약으로 사용될 수 있으며, 미국부저병, 백묵병 및 딸기 꽃 곰팡이병에 대한 방제 효과가 뛰어나므로, 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

딸기 화분으로부터 분리한 곤충병원균 또는 딸기 진균병 병원균에 대해 항균활성을 갖는 스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4 균주 및 이의 용도{Streptomyces badius SP6C4 strain having antimicirobial activity against insect pathogen or strawberry fungal disease pathogen isolated from strawberry pollen and uses thereof}
본 발명은 딸기 화분으로부터 분리한 곤충병원균 또는 딸기 진균병 병원균에 대해 항균활성을 갖는 스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 곤충병원균 또는 딸기 진균병 병원균에 대해 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 곤충병 또는 딸기 진균병 방제용 조성물, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 곤충병 또는 딸기 진균병 방제용 조성물의 제조 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 곤충병원균 감염 지역, 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 곤충병 또는 딸기 진균병을 방제하는 방법에 관한 것이다.
꿀벌의 미국부저병(AFB : American foul brood)은 꿀벌의 질병 중 가장 전염성이 강하고 피해가 심한 질병이다. 국내에서도 1950년대 이래 전국에서 지속적으로 발생하고 있다. 감염된 유충은 500만개 이상의 숙주를 만들어 2차 전염원이 되며, 포자가 내열성 및 내화학성이 강해 같은 장소에서 매년 연속적으로 발생하기도 한다. 부저병의 원인 세균은 그람양성의 간균(2.5~5.0㎛×0.7~0.8㎛)인 패니바실러스 라바에(Paenibacillus larvae)이다. 편모에 의한 운동성이 있고, 내생포자를 만들기 때문에 열에 강하고 항생제에 저항성이 강하며, 건조상태에서 수십 년간 병원성을 보유한다. 포자가 유충의 입을 통하여 중장에서 발아하여 증식하며, 증식된 세균은 혈액을 통하여 온몸으로 퍼져 유충을 죽게 만들며, 부저병에 심각하게 감염되면 양봉장 전체가 삽시간에 전멸하는 경우도 있다. 꿀벌의 부저병에 대한 예방과 치료에 관해서는 많은 연구가 있었으나 아직 완전예방과 구제는 수립되어 있지 못하고 있다. 같은 양봉장 안에서는 벌통 간에 소비의 교환이 자주 있으므로 이 질병을 조기 진단하지 못할 경우, 소비의 교환이 되풀이되어 순식간에 전체 봉군에 병의 감염을 초래하게 되기 때문에, 선진국에서도 발병된 봉군은 소각하여 버리는 경우도 빈번하다.
꿀벌의 백묵병(Chalk brood)은 벌통 내의 유충에 침입하여 유충을 미이라 형태로 만들고 이어 딱딱한 백묵 형태로 변화시켜 결국 꿀벌을 죽이는 병으로서 늦은 봄이나 초여름 사이에 벌통의 출입구나 바닥, 소방, 그리고 벌통 주변에서 백묵병에 감염된 벌들을 흔히 볼 수 있다. 이러한 꿀벌의 백묵병은 1913년에 독일의 마센(Massen)에 의하여 최초로 보고된 이래, 1957년에는 뉴질랜드에서, 1968년에는 미국 캘리포니아주에서 발병되어 거의 모든 주(state)로 병이 만연된 바 있으며, 캐나다에서는 1971년에 발병되었다고 한다. 또한 일본에서는 1974년 아끼다현 및 캐나다산의 수입 양봉에서, 1979년에는 기후현에서도 백묵병이 발견된 바 있으며, 이와 같은 백묵병은 전 세계로 확산된 꿀벌 질병 중 가장 피해가 큰 병 중의 하나로 밝혀졌다. 백묵병 원인균은 아스코스패라 아피스(Ascosphaera apis)로 명명되었으며, 꿀벌의 유충에만 감염되고, 특히 수벌의 유충에 감수성이 강하며, 백묵병 원인균의 포자낭은 환경에 대한 저항성이 강하여 병원성이 15년 동안이나 유지된다고 한다. 이러한 백묵병은 감염된 벌통의 오염된 화분 섭취, 감염된 벌통에서의 여왕벌의 리퀴닝(requeening), 여왕벌, 일벌 등의 이동과 감염된 벌통에서 건전한 벌통으로의 병의 전파 등의 다양한 방법에 의해 감염되는데, 우리나라에서는 1980년대 중반부터 급격히 만연되어 현재는 그 피해가 가장 큰 꿀벌의 질병으로서 벌꿀 생산에 많은 피해를 주고 있다. 현재까지 밝혀진 백묵병의 방제법으로는 감염 벌통을 소각하는 방법이 가장 확실한 것으로 알려져 있으나, 이 방법은 경제적인 손실이 너무 크기 때문에 이를 대체할 수 있는 방법으로서 약제를 이용한 방제법과 병원균의 전파 경로 탐색을 통한 오염원 제거 방법 등에 관한 연구가 최근 활발히 진행되고 있다.
또한, 식물병해에 의한 작물의 피해는 세계적으로 약 200조 원에 달할 만큼 경제적으로 매우 큰 손실을 주고 있다. 그 중에 딸기 꽃 곰팡이병은 일단 발생되면 바람이나 꿀벌 등에 의한 확산이 빨라 방제가 어렵고, 꽃의 수정을 방해해 기형과를 유발한다. 특히, 딸기 꽃 곰팡이병 원인균(Cladosporium cladosporioides)의 적온은 20-25℃이고 하우스 내 습도와 결로가 높은 경우나 일조가 부족한 환경에서 발생이 높은 경향을 보이며, 죽은 식물체, 토양, 유기물 등에서도 증식할 수 있다. 현재 딸기 꽃 곰팡이병의 방제 방법은 하우스 내 습도를 낮추고, 개화기 전에 딸기 흰가루병 또는 탄저병에 등록된 친환경 자제나 화분 발아에 영향이 적은 약제 등을 예방적으로 처리할 뿐이다. 따라서, 딸기 꽃 곰팡이병 원인균에 대한 직접적인 방제제가 필요하므로 잔류 독성과 환경오염의 문제가 없는 친환경 농약 개발에 관심이 집중되고 있다.
한편, 한국공개특허 제2011-0092177호에는 미국부저병의 원인균에 대한 항균활성을 가지는 락토바실러스 폴란타룸 YML 001, 상기 미생물을 함유하는 항균성 미생물제제 및 상기 미생물을 이용한 방제방법에 대해 개시되어 있고, 한국등록특허 제1311192호에는 꿀벌의 전염성 예방 및 치료 조성물의 제조방법 및 이 방법에 의한 꿀벌용 영양조성물에 대해 개시되어 있으나, 본 발명의 딸기 화분으로부터 분리한 곤충병원균 또는 딸기 진균병 병원균에 대해 항균활성을 갖는 스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4 균주 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명의 딸기 화분으로부터 분리된 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주는 미국부저병 원인균(Paenibacillus larvae) 및 백묵병 원인균(Ascosphaera apis)의 생장을 억제하는 효과를 보였으며, 딸기 꽃 곰팡이병 원인균(Cladosporium cladosporioides)에 대해서도 항균 활성을 보였다. 이를 통해, 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주의 곤충병 및 딸기 진균병에 대한 방제 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 곤충병원균 또는 딸기 진균병 병원균에 대해 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 곤충병 또는 딸기 진균병 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주를 배양하는 단계를 포함하는 곤충병 또는 딸기 진균병 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 곤충병원균 감염 지역, 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 곤충병 또는 딸기 진균병을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 딸기 화분으로부터 분리된 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주가 곤충병원균 및 딸기 진균병 병원균의 생장을 억제시키는 것을 확인하였다. 본 발명의 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주는 농약의 부작용으로 발생하는 환경 오염 및 잔류 농약으로 인한 인체 독성의 위험성이 없는 친환경적인 생물 농약으로 사용될 수 있으며, 미국부저병, 백묵병 및 딸기 꽃 곰팡이병에 대한 방제 효과가 있으므로, 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 딸기 화분으로부터 분리한 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주를 PDA 평판배지에 계대배양하여 순수배양 균주임을 확인한 결과이다.
도 2는 딸기 화분으로부터 메타게놈(metagenome)을 분석한 결과이다.
도 3은 딸기 화분으로부터 분리한 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주의 16S rRNA 염기서열을 나타낸 결과이다.
도 4는 딸기 화분으로부터 분리한 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주의 곤충병원균에 대해 항균 활성을 나타낸 결과이다. A는 백묵병 원인균(Ascosphaera apis), B는 미국부저병 원인균(Paenibacillus larvae)에 대해 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 딸기 화분으로부터 분리한 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주의 딸기 꽃 곰팡이병 원인균(Cladosporium cladosporioides)에 대해 항균 활성을 나타낸 결과이다.
도 6은 16S rRNA 염기서열에 기초한 딸기 화분으로부터 분리한 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주의 유연관계를 분석한 결과이다.
도 7은 딸기 꽃에서 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주의 생존능력을 분석한 결과이다. 처리 1은 스트렙토마이세스 바디우스 SP6B4 균주를 처리한 실험군; 처리 2는 스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4 균주를 처리한 실험군; 처리 3은 스트렙토마이세스 바디우스 SP12C7 균주를 처리한 실험군을 나타낸 것이다.
본 발명을 달성하기 위하여, 본 발명은 곤충병원균 또는 딸기 진균병 병원균에 대해 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주를 제공한다.
상기 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주는 딸기 화분에서 분리하였으며, 곤충병원균인 백묵병 원인균(Ascosphaera apis) 및 미국부저병 원인균(Paenibacillus larvae)과 딸기 진균병 병원균인 딸기 꽃 곰팡이병 원인균(Cladosporium cladosporioides)에 대해 항균활성이 뛰어난 균주로 선발되었다. 상기 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2015년 06월 03일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCCM11703P).
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 곤충병원균은 미국부저병 원인균 또는 백묵병 원인균일 수 있으며, 바람직하게는 패니바실러스 라바에(Paenibacilus larvae) 또는 아스코스패라 아피스(Ascoshaera apis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 딸기 진균병 병원균은 딸기 꽃 곰팡이병 원인균일 수 있으며, 바람직하게는 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 곤충병 또는 딸기 진균병 방제용 조성물을 제공한다. 상기 곤충병 또는 딸기 진균병 방제용 조성물은 미생물 농약의 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 곤충병 또는 딸기 진균병 방제용 조성물은 예를 들어, 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 곤충병 또는 딸기 진균병 방제용 조성물은 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조 토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 곤충병 또는 딸기 진균병 방제용 조성물은 관수용, 엽면 살포용, 종자 소독용 또는 농기구 소독용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 곤충병 또는 딸기 진균병 방제용 조성물은 유효성분으로서 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주를 단독으로, 또는 2종 이상의 다른 항진균, 항균 또는 항바이러스성 물질 등과 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 곤충병 또는 딸기 진균병 방제용 조성물은 작물체 흡수 및 효과를 증진시키기 위하여 확산제 및 침투제, 또는 계면활성제와도 혼용이 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 곤충병원균 감염 지역, 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 곤충병 또는 딸기 진균병을 방제하는 방법을 제공한다.
상기 곤충병 또는 딸기 진균병을 방제하는 방법으로는 상기 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주 및 이의 배양액의 유효량을 이용한 방제용 조성물을 곤충병원균 감염지역인 감염 벌통이나 봉군에 살포하거나, 또는 식물이나 토양에 분무 및 살포 또는 식물을 상기 방제용 조성물에 침지하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 '유효량'은 유익한 또는 원하는 결과를 일으키기에 충분한 양으로, 곤충병 또는 딸기 진균병을 방제하기 위해 방제용 조성물을 물로 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 식물체 및 경작지에 살포할 수 있다. 본 발명의 수화제 또는 액상 수화제를 물에 희석하는 경우 수화제 또는 액상 수화제의 농도는 유효성분이 생물학적으로 유효한 범위가 될 수 있도록 105 내지 1010cfu/㎖으로, 바람직하게는 108cfu/㎖ 내외로, 더욱 바람직하게는 106cfu/㎖으로 조절할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주를 배양하는 단계를 포함하는 곤충병 또는 딸기 진균병 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
상기 균주의 배양 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 스트렙토마이세스 바디우스 ( Streptomyces badius ) SP6C4 균주의 분리
양봉 벌에 발생되는 백묵병 원인균 및 미국부저병 원인균에 대해 항균 활성을 지닌 균주를 찾기 위하여, 경남 진주시 수곡면 딸기 재배지의 포장에서 딸기 화분(strawberry pollen)을 확보하였다. 확보된 화분 과립 1g을 PBS 버퍼 20㎖에 녹인 후, 초음파 분산기(ultrasonic homogenizer)에 시료(화분 과립 1g + PBS 버퍼 20㎖)를 넣고 10분간 진행하였다. 시료 희석을 위하여 시료 1㎖를 멸균수 9㎖에 첨가하여 1/10배씩 8번 반복하여, 101부터 109까지 시료를 희석하였다. 각각의 희석된 시료 100㎕를 ISP2(효모 추출물 4g, 맥아 추출물 10g, 글루코스 4g 및 아가 20g, pH 7.3) 및 TSA(Tryptic soy agar) 배지에 희석도말법을 이용하여 미생물을 분리하였다(도 1).
실시예 2. 딸기 화분으로부터 메타게놈 ( Metagenome ) 분석
딸기 화분으로부터 메타게놈(metagenome)을 분석하기 위하여, 화분 과립 1g을 PBS 버퍼 20㎖에 녹인 다음, 시료(화분 과립 1g + PBS 버퍼 20㎖) 3㎖을 원심분리하여 획득한 펠릿(pellet)을 CTAB(Cetyl trimethyl ammonium bromide) 기법을 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 파이로시퀀싱(Pyrosequencing)을 수행하기 위해, 추출한 게놈 DNA를 -20℃에 보관하였다. 세균의 16S rRNA 부분을 증폭하고, Macrogen사(한국)에서 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 분석을 실시하였다. 모든 염기서열은 Silva rRNA database(http://www.arb-silva.de/)를 이용하여 동정하였다. 그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이, 딸기 화분으로부터 메타게놈(metagenome) 분석을 통하여 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)이 포함된 악티노박테리아(Actinobacteria) 문(phylum)의 세균이 존재하는 것을 확인하였다.
실시예 3. 스트렙토마이세스 바디우스 ( Streptomyces badius ) SP6C4 균주의 동정
분리된 미생물의 분자 생물학적 동정을 실시하고자 게놈 DNA를 분리하여 16S rRNA 염기서열(서열번호 1)을 분석하였다. 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주의 게놈 DNA를 CTAB(Cetyl trimethyl ammonium bromide) 기법을 이용하여 추출하였다. 시퀀싱 분석에는 16S rRNA의 V1 내지 V3 영역을 타켓으로 하는 하기 표 1의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 16S rRNA 염기서열은 NCBI의 BLAST 검색을 통하여 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius)로 동정되었다. 또한, 상기 균주를 스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4(Strawberry pollen 6C4) 균주로 명명하였다.
본 발명에 사용된 프라이머
프라이머 이름 서열번호 정방향(5'-3')
프라이머 염기서열		 프라이머 이름 서열번호 역방향(5'-3')
프라이머 염기서열
27F 2 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 1492R 3 GGYTACCTTGTTACGACTT
실시예 4. 스트렙토마이세스 바디우스 ( Streptomyces badius ) SP6C4 균주의 곤충병원균에 대한 길항력 확인
상기 실시예 1 및 3에서 분리 및 동정한 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주의 곤충병원균에 대한 항균 활성을 확인하기 위하여, 곤충병원균인 백묵병 원인균(Ascosphaera apis) 및 미국부저병 원인균(Paenibacillus larvae)을 이용하였다. 항균 활성을 검증하기 위하여 PDA(감자 텍스트로스 10 g, 펩톤 10g, 아가 20g) 평판 배지에서 스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4 균주와 백묵병 원인균(Ascosphaera apis) 및 미국부저병 원인균(Paenibacillus larvae)을 각각 대치배양하였다. 이때, 각종 병원균의 생육 온도인 28℃로 배양한 후, 저지대(Inhibition zone)를 관찰하였다. 그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 본 발명의 스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4 균주는 대상 병원균에 대하여 강력한 항균 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 5. 스트렙토마이세스 바디우스 ( Streptomyces badius ) SP6C4 균주의 딸기 꽃 곰팡이병 원인균에 대한 길항력 확인
상기 실시예 1 및 3에서 분리 및 동정한 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주의 딸기 꽃 곰팡이병 원인균에 대한 항균 활성을 확인하기 위하여, PDA(감자 텍스트로스 10 g, 펩톤 10g, 아가 20g) 평판 배지에서 스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4 균주와 딸기 꽃 곰팡이병 원인균(Cladosporium cladosporioides)을 대치배양하였다. 이때, 저온성 균의 특성에 따라 20℃에서 배양한 후, 저지대(Inhibition zone)를 관찰하였다. 그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이 본 발명의 스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4 균주는 딸기 꽃 곰팡이병 원인균에 대하여 강력한 항균 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 6. 스트렙토마이세스 바디우스 ( Streptomyces badius ) SP6C4 균주의 유연관계 분석
상기 실시예 3의 결과를 바탕으로 NCBI에 등록되어있는 스트렙토마이세스 속 (Strpetomyces sp.)에 속하는 균주들의 16s RNA 염기서열의 유사성을 이용하여 유연관계를 분석하였다. 유연관계 분석에는 Mega 6 프로그램을 이용하였다. 그 결과, 도 6에 개시된 바와 같이 스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4 균주는 스트렙토마이세스 바디우스 strain CB00830과 99%의 유연관계를 보이는 것으로 확인되었다.
실시예 7. 스트렙토마이세스 바디우스 ( Streptomyces badius ) SP6C4 균주의 딸기 꽃에서의 생존능력 검증
스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4 균주의 딸기 꽃에서의 생존능력을 검증하기 위하여 실험실 내에서 실험을 실시하였다. 딸기 포장으로부터 꽃을 채집하여 줄기 부분을 오아시스에 고정시킨 다음, 혼합액(0.1% 메틸 셀룰로오스, 균주배양액 108cfu/㎖, 멸균수 10㎖)의 접종농도를 106cfu/㎖으로 조정하여 딸기 꽃에 분주법(Spray) 및 침지법(dipping)으로 접종하였다. 그 다음, 접종 5일 차에 꽃을 1X PBS 버퍼에 넣고 5분간 초음파 처리한 후 멸균수에 101부터 109(cfu/㎖)까지 희석한 다음, 104부터 106(cfu/㎖)까지 각각 희석도말법을 통해 CFU를 측정하였다.
그 결과, 도 7에 개시된 바와 같이 분주법(Spray)에서는 스트렙토마이세스 바디우스 SP6C4 균주(처리 2)를 처리하였을 때, 딸기 꽃에서의 생존률이 가장 높았으며, 침지법(dipping)에서는 스트렙토마이세스 속 SP12C7 균주(처리 3)를 처리하였을 때, 딸기 꽃에서의 생존률이 가장 높았다.
따라서, 본 발명은 곤충병 및 식물병 방제를 위해 사용되는 미생물의 항균능력을 나타내는 밀도인 105(cfu/㎖)을 유지하고 있었으므로, 미생물제제로서의 개발 가능성이 확인되었다. 또한, 약제살포방법과 유사한 분주법(Spray)에서 높은 생존률을 보임으로써, 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주의 상품개발가치성이 높은 것으로 사료된다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11703P 20150603
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Streptomyces badius SP6C4 strain having antimicirobial activity against insect pathogen or strawberry fungal disease pathogen isolated from strawberry pollen and uses thereof <130> PN15121 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1208 <212> DNA <213> Streptomyces badius <400> 1 gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcttaa cacatgcaag tcgaacgatg aagcccttcg 60 gggtggatta gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggcaa tctgcccttc actctgggac 120 aagccctgga aacggggtct aataccggat aacactctgt cccgcatggg acggggttga 180 aagctccggc ggtgaaggat gagcccgcgg cctatcagct tgttggtggg gtaatggcct 240 accaaggcga cgacgggtag ccggcctgag agggcgaccg gccacactgg gactgagaca 300 cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gaaagcctga 360 tgcagcgacg ccgcgtgagg gatgacggcc ttcgggttgt aaacctcttt cagcagggaa 420 gaagcgaaag tgacggtacc tgcagaagaa gcgccggcta actacgtgcc agcagccgcg 480 gtaatacgta gggcgcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagagct cgtaggcggc 540 ttgtcacgtc ggatgtgaaa gcccggggct taaccccggg tctgcattcg atacgggcta 600 gctagagtgt ggtaggggag atcggaattc ctggtgtagc ggtgaaatgc gcagatatca 660 ggaggaacac cggtggcgaa ggcggatctc tgggccatta ctgacgctga ggagcgaaag 720 cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacgt tgggaactag 780 gtgttggcga cattccacgt cgtcggtgcc gcagctaacg cattaagttc cccgcctggg 840 gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcagcggag 900 catgtggctt aattcgacgc aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacat ataccggaaa 960 gcatcagaga tggtgccccc cttgtggtcg gtatacaggt ggtgcatggc tgtcgtcagc 1020 tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtt ctgtgttgcc 1080 agcatgccct tcggggtgat ggggactcac aggagactgc cggggtcaac tcggaggaag 1140 gtggggacga cgtcagtcat catgcccctt atgtcttggg ctgcacacgt gctacaatgg 1200 ccggtaca 1208 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggytaccttg ttacgactt 19

Claims (11)

  1. 패니바실러스 라바에(Paenibacillus larvae), 아스코스패라 아피스(Ascosphaera apis) 또는 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides)에 대해 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주(기탁번호: KCCM11703P).
  2. 삭제
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  7. 제1항에 따른 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 패니바실러스 라바에(Paenibacillus larvae) 또는 아스코스패라 아피스(Ascosphaera apis)에 의한 곤충병 또는 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides)에 의한 딸기 진균병 방제용 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 따른 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주를 배양하는 단계를 포함하는 패니바실러스 라바에(Paenibacillus larvae) 또는 아스코스패라 아피스(Ascosphaera apis)에 의한 곤충병 또는 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides)에 의한 딸기 진균병 방제용 조성물의 제조 방법.
  11. 제1항에 따른 스트렙토마이세스 바디우스(Streptomyces badius) SP6C4 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 패니바실러스 라바에(Paenibacillus larvae) 또는 아스코스패라 아피스(Ascosphaera apis) 감염 지역, 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 패니바실러스 라바에(Paenibacillus larvae) 또는 아스코스패라 아피스(Ascosphaera apis)에 의한 곤충병 또는 클라도스포리움 클라도스포리오이데스(Cladosporium cladosporioides)에 의한 딸기 진균병을 방제하는 방법.
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