KR101948036B1 - 노제마병 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 포코니아 속 60 균주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 노제마병 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주(KACC93281P), 상기 포코니아 속 60 균주, 이의 배양액 또는 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 노제마병 방제용 조성물, 상기 조성물의 제조 방법 및 상기 포코니아 속 60 균주, 이의 배양액 또는 배양액의 추출물의 유효량을 노제마병 의심 꿀벌에 처리하는 단계를 포함하는 노제마병을 방제하는 방법에 관한 것이다.

Description

노제마병 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 포코니아 속 60 균주 및 이의 용도{Pochonia sp. 60 strain having antifungal activity against nosema disease pathogen and uses thereof}

본 발명은 노제마병 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 포코니아 속 60 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

현재 전 세계적으로 다양한 병원균과 기생충 및 이상기후에 의해 양봉산업은 봉군 감소현상에 직면해있고, 그 원인 중 하나로 미포자충류에 속하는 노제마(Nosema spp.)가 지적되고 있다. 미포자(Microspora)문(phylum)의 미포자충류(Microsporidia)에 속하는 노제마(Nosema spp.) 중 꿀벌을 숙주로 삼는 것으로, 노제마 아피스(Nosema apis)와 노제마 세라내(N. ceranae)가 있고, 1909년 동양종 꿀벌에서 젠더(Zander)에 의해 처음으로 보고되었으며, 추후 서양종 꿀벌에도 감염이 가능해지면서 전 세계적으로 퍼져나갔다. 노제마병은 포자가 꿀벌에게 유입되면 체내 중장으로부터 시작하여 주변 조직을 기생 감염하며 그들의 생활사를 이어나간다. 꿀벌이 노제마 포자를 섭식하면 포자는 숙주 내부에서 극성관(polar tube)을 방출하여 중장 상피세포의 세포막을 뚫고 극성관을 통해 포자원형질(sporoplasm)을 유입시킨다.

꿀벌 노제마병은 성충에 감염되어 만성적인 질병을 유도하며 비교적 증상은 경미하다. 하지만, 병원균의 밀도가 높아지면 벌통 내부의 생산성이 크게 저하되고 월동하는 과정에서 군집의 생존율이 급격히 낮아지는 영향과 꿀벌의 활동성이 떨어지고 먹이 섭식 과정에 영향을 주어 건강한 꿀벌에 비해 수명이 약 40% 감소한다. 국내에서는 60년대 후반 노제마 질병이 처음 보고되었으며, 현재 전국에서 80% 이상의 봉군이 노제마에 감염된 것으로 보고되고 있다. 노제마병을 방제하기 위한 연구는 활발히 진행되고 있으나 아직 부족한 상황이고, 현재 노제마 방제 약제로 사용되고 있는 것은 노제마 아피스(Nosema apis)와 노제마 세라내(N. ceranae)의 발병을 억제하는 푸마질린(fumagillin)이라는 항생제만이 유일한 방제대책으로 이용되고 있지만 미진한 효과로 인해 새로운 방제법 개발이 절실한 실정이다. 현재 푸마질린의 낮은 효력을 대체 보완하기 위해 천연물 유래의 물질을 이용한 노제마병 연구가 이루어지고 있으며, 그 중 식물의 천연 추출물인 티몰(thymol)과 레스베라트롤(resveratrol)이 노제마병 방제에 좋은 효과를 가지고 있다고 보고되어 있고, 세균 유래 천연 물질을 이용하여 노제마병을 방제하는 연구 또한 활발히 진행되고 있다.

한편, 한국공개특허 제2014-0017291호는 꿀벌 질병 노제마 아피스 치료용 조성물 및 그의 정제방법을 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2015-0144779호는 살충성 또는 농약성 2성분 혼합물을 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 노제마병 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 포코니아 속 60 균주 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 곤충병원성 곰팡이 배양액으로부터 추출물을 제조하여 항노제마 활성이 우수한 5개 균주를 선발하였으며, 상기 5개 균주 배양액의 추출물들을 노제마 세라내(Nosema ceranae)에 감염된 꿀벌에 각각 처리한 결과, 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주의 배양액 추출물에서 노제마 세라내의 포자 생산량이 감소되고, 꿀벌의 생존율이 현저히 증가되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 노제마병 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주(KACC93281P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주, 이의 배양액 또는 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 노제마병 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주를 배양하는 단계를 포함하는 노제마병 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주, 이의 배양액 또는 배양액의 추출물의 유효량을 노제마병 의심 꿀벌에 처리하는 단계를 포함하는 노제마병을 방제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 노제마병 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 포코니아 속 60 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 항노제마 활성이 높은 곤충병원성 곰팡이인 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주 배양액 추출물은 꿀벌 노제마병에 대해 치료효과가 현저히 우수하므로, 꿀벌 노제마병 방제에 있어 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 노제마 세라내(Nosema ceranae) 포자를 관찰한 현미경 사진이다.
도 2는 노제마 아피스(Nosema apis) 및 노제마 세라내(N. ceranae) 게놈 DNA를 대상으로 각각의 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과이다. M은 100bp의 DNA 래더 마커; 1은 노제마 세라내 특이적 프라이머; 2는 노제마 아피스 특이적 프라이머를 이용한 것이다.
도 3은 곤충병원성 곰팡이 배양액 추출물의 용해를 위해 사용한 용매인 DMSO(dimethyl sulfoxide) 및 아세톤이 노제마 세라내 포자 발아에 대해 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 4는 항노제마 활성을 보인 44개의 곤충병원성 곰팡이 균주 배양액 추출물들의 노제마 세라내(N. ceranae) 포자발아 억제활성을 측정한 결과이다. 회색바는 곤충병원성 곰팡이 균주 배양액 추출물의 정균 활성을, 검정바는 곤충병원성 곰팡이 균주 배양액 추출물의 살균 활성을 의미한다.
도 5는 곤충병원성 곰팡이 균주의 배양액 추출물의 용해를 위해 사용한 용매인 아세톤을 농도별(1, 2, 4 및 8%)로 꿀벌에 처리하였을 때, 꿀벌의 생존율을 측정한 결과이다.
도 6은 선발된 곤충병원성 곰팡이 균주 배양액 추출물의 독성을 확인하기 위해, 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60), 패실로마이세스 마르콴디이 364(Paecilomyces marquandii 364), 메타리지움 아니소플리애 296(Metarhizium anisopliae 296), 뷰베리아 브롱니아르티 183(Beauveria brongniartii 183) 및 뷰베리아 바씨아나 35 및 59(B. bassiana 35 및 59) 균주들의 배양액 추출물 1%(a) 및 10%(b)를 꿀벌에 처리하였을 때, 꿀벌의 생존율을 측정한 결과이다. control은 50% 수크로오스 용액을 공급한 대조군이다.
도 7은 선발된 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60), 패실로마이세스 마르콴디이 364(P. marquandii 364), 메타리지움 아니소플리애 296(M. anisopliae 296) 및 뷰베리아 바씨아나 35 및 59(B. bassiana 35 및 59) 균주들의 배양액 추출물(5%)을 노제마 세라내(N. ceranae) 감염 전에 꿀벌에 처리하였을 때, 꿀벌의 생존율(a) 및 포자 생산량(b)을 측정한 결과이다.
도 8은 선발된 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60), 패실로마이세스 마르콴디이 364(P. marquandii 364), 메타리지움 아니소플리애 296(M. anisopliae 296) 및 뷰베리아 바씨아나 35 및 59(B. bassiana 35 및 59) 균주들의 배양액 추출물(5%)을 노제마 세라내(N. ceranae) 감염 후에 꿀벌에 처리하였을 때, 꿀벌의 생존율(a) 및 포자 생산량(b)을 측정한 결과이다.
도 9는 선발된 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60), 패실로마이세스 마르콴디이 364(P. marquandii 364), 메타리지움 아니소플리애 296(M. anisopliae 296) 및 뷰베리아 바씨아나 35 및 59(B. bassiana 35 및 59) 균주들의 배양액 추출물(1%)을 노제마 세라내(N. ceranae) 감염 후에 꿀벌에 처리하였을 때, 꿀벌의 생존율(a) 및 포자 생산량(b)을 측정한 결과이다.

본 발명을 달성하기 위하여, 본 발명은 노제마병 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주를 제공한다.

상기 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주는 국내에서 분리된 19속 29종 342개의 곤충병원성 곰팡이 균주 중, 균주 배양액의 추출물이 노제마 세라내(Nosema ceranae)에 대해 포자발아 억제 효과가 우수하고, 노제마 세라내에 감염된 꿀벌의 생존율을 증가시키는 균주로 확인되어, 상기 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주를 2017년 08월 23일자로 농업생명공학연구원(KACC)에 기탁하였다(수탁번호: KACC93281P).

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 노제마병 병원균은 노제마 세라내(Nosema ceranae)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주, 이의 배양액 또는 상기 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 노제마병 방제용 조성물을 제공한다. 상기 방제용 조성물은 미생물 농약의 의미로 사용될 수 있다. 상기 방제는 바람직하게는 치료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 노제마병 방제용 조성물은 예를 들어, 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 노제마병 방제용 조성물은 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조 토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 노제마병 방제용 조성물은 유효성분으로서 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주를 단독으로, 또는 2종 이상의 다른 항진균, 항진균 또는 항바이러스성 물질 등과 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주를 배양하는 단계를 포함하는 노제마병 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.

상기 균주의 배양 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주, 이의 배양액 또는 상기 배양액의 추출물의 유효량을 노제마병 의심 꿀벌에 처리하는 단계를 포함하는 노제마병을 방제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 노제마병을 방제하는 방법은 노제마병에 감염된 꿀벌을 치료하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 '유효량'은 유익한 또는 원하는 결과를 일으키기에 충분한 양으로, 노제마병을 방제하기 위해 방제용 조성물을 물로 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 꿀벌에 살포할 수 있다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

재료 및 방법

1. 꿀벌( Apis mellifera )

본 발명에 이용된 꿀벌은 서양종 꿀벌(Apis mellifera)을 사육하여 실험에 이용하였고, 꿀벌을 채집하고 해부하여 노제마의 감염여부를 먼저 판단하였다. 꿀벌은 봉침통에 채집하여 화분떡과 50% 수크로오스(sucrose)를 공급하였으며, 30℃ 및 암조건의 인큐베이터에 보관하며 실내 사육하였다. 유봉(幼蜂)은 벌통으로부터 육아소비를 30℃의 인큐베이터로 옮겨 부화를 유도하였고, 우화(羽化)한 유봉은 12시간 마다 수거하여 사육하였다.

2. 노제마 세라내( Nosema ceranae )

노제마 세라내(Nosema ceranae)는 농촌진흥청 잠사양봉소재과의 봄철 봉군으로부터 노제마병에 감염된 서양종 꿀벌을 공급받아 포자를 분리하였다. 노제마 세라내의 실내 계대배양은 감염된 꿀벌로부터 분리한 포자를 1×10⁷ 포자/ml의 농도로 50% 수크로오스와 혼합하여 30마리의 꿀벌에 경구접종 하였고, 30℃ 및 암조건에서 감염을 유도하였다. 포자는 접종 후 10일째에 감염이 의심되는 꿀벌로부터 중장을 적출하여 노제마 세라내의 포자를 분리하고 실험에 이용하였다.

3. 노제마의 동정

노제마 포자를 액체질소를 이용하여 동결 및 마쇄하는 과정을 3회 반복한 후, I-게놈 DNA 추출 미니 키트(Intron, 한국)를 이용하여 제시되어있는 방법에 따라 게놈 DNA를 추출하여 PCR 주형(template)로 사용하였다. 노제마 아피스(Nosema apis)와 노제마 세라내(N. ceranae)를 구별하기 위하여, 하기 표 1에 개시한 바와 같이 각각의 특이적인 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. PCR은 AccuPower PCR 프리믹스(250mM dNTPs, 10mM Tris-HCl(pH 9.0), 30mM KCl, 1.5mM MgCl 및 1 unit of Taq DNA polymerase; Bioneer Co., 한국)에 1㎕의 DNA 주형과 10pmol의 프라이머를 넣고 총 부피 20㎕로 맞추어 95℃에서 2분의 초기변성(initial denaturation) 1회 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분의 조건으로 35회 반복반응을 수행하고 72℃에서 10분간 처리로 반응을 종료하였다. 증폭되어진 PCR 산물은 1.0% 아가로오스 겔에 전기영동하여 균주의 동정을 실시하였다.

본 발명에 사용한 프라이머

프라이머	서열번호	프라이머 염기서열(5'-3')
Mnceranae-F	1	CGTTAAAGTGTAGATAAGATGTT
Mnapis-F	2	GCATGTCTTTGACGTACTATG
Muniv-R	3	GACTTAGTAGCCGTCTCTC

4. 노제마 포자의 분리 및 정제

감염된 꿀벌로부터 적출한 중장을 200㎕의 증류수와 3mm의 비드(bead)가 들어있는 1.5㎖의 마이크튜브에 넣고 Bullet Blender® 호모게나이저(Scientific Instrument Services, Inc., 미국)로 균질화시켜 중장 상피세포 내의 노제마 포자를 분리하였다. 분리된 포자현탁액 내의 큰 세포 조각들을 제거하기 위해, 100㎛ 및 40㎛의 필터를 차례대로 이용하였고, 여과된 포자현탁액은 5㎖씩 90%, 75%, 50% 및 25% 농도로 제작된 퍼콜(Percoll, Sigma-Aldrich; St. Louis, 미국)을 이용하여 50㎖의 코니칼 튜브에 쿠션을 만들고 상층에 현탁액을 조심스럽게 분주한 뒤 15,000×g로 30분간 원심분리하였다. 90% 퍼콜 층에 존재하는 포자를 취하고 증류수로 정제과정을 거쳐 순수분리된 포자를 실험에 이용하였다.

5. 노제마 포자의 발아 활성 검정

순수 분리된 포자를 1.5㎖의 마이크로튜브에 5×10⁵ 포자/㎖의 농도가 되도록 희석하고, 12-웰 세포반응 슬라이드글라스(Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, 독일)에 20㎕씩 점적(1×10⁴포자/웰)한 후, 표면의 수분이 완벽히 마를 때까지 약 2시간 동안 약 25℃의 상온에서 건조시켰다. 세포반응 슬라이드글라스의 수분이 마른 후, 0.1M의 수크로오스 용액을 1.5㎕씩 첨가하고 커버글라스로 덮은 다음, 6시간 동안 약 25℃의 상온에서 건조시켰다. 건조된 프레파라트는 위상차 현미경을 이용하여 포자의 발아 여부를 관찰하였다.

6. 곤충병원성 곰팡이( entomopathogenic fungi) 배양액 추출물

(1) 배양액 제작

국내 토양에서 분리된 19속 29종 342개의 곤충병원성 곰팡이 배양액을 제작하기 위해, 14일간 PDA(potato dextrose agar, pH 5.6) 배지에서 자란 곰팡이의 균총의 가장자리를 6mm로 자른 뒤, 1㎖의 PDB 배지가 들어있는 2㎖의 원심분리 튜브에 접종하고 25℃ 및 150rpm으로 암조건에서 10일간 배양하였다. 배양이 완료되면 13,000rpm에서 5분간 원심분리하여 균체와 배양액을 분리하였다.

본 발명에서 분리한 곤충병원성 곰팡이 목록

Fungal isolates	No. of isolates
Acremonium sp.	1
Aspergillus spp.	8
Beauveria bassian	110
Beauveria brongniartii	8
Beauveria cf. bassiana	8
Bionectria spp.	7
Chaunopycnis spp.	23
Clonostachys rosea	1
Fusarium spp.	2
Isaria farinosa	12
Isaria fumosorosea	6
Isaria spp.	22
Lecanicillium spp.	8
Metarhizium anisopliae var. anisopliae	65
Metarhizium anisopliae var. lepidiotum	1
Metarhizium flavoviride var. pemphigum	16
Mucorales	1
Myrothecium spp.	5
Paecilomyces carneus	3
Paecilomyces lilacinus	3
Paecilomyces marquandii	5
Paraconiothyrium spp.	2
Phialocephala spp.	1
Pochonia spp.	17
Simplicillium sp.	1
Tolypocladium spp.	3
Verticillium spp.	3
total	342

(2) 배양액 추출물 준비

곤충병원성 곰팡이 배양액에서 소수성 물질을 분리하기 위해, 에틸아세테이트(ethyl acetate) 분획법을 이용하였다. 배양액과 동량의 에틸아세테이트를 첨가한 후 20분간 볼텍싱(vortexing)하고, 4,000rpm으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 취하였다. 그 후 에틸아세테이트는 기체 질소를 이용하여 증발시키고, 남은 추출물은 30% DMSO(dimethyl sulfoxide)에 배양액 원액의 농도로 용해시킨 후, 다음 실험에 이용하였다. 제작된 배양 추출물은 사용하기 전까지 -76℃의 냉동고에 보관하였다.

(3) 정량 배양 추출물 준비

PDA 배지에서 14일간 배양된 곤충병원성 곰팡이로부터 수확된 포자를 0.02% 트윈-80을 이용하여 포자현탁액을 만들고, 혈구계산판(hemocytometer)을 이용하여 계수한 후 실험에 이용하였다. 포자현탁액은 실험에 사용 시까지 4℃의 냉장고에 보관하였고, 그 기간은 3일을 넘기지 않았다. 수거된 포자현탁액을 9×10⁵ 포자/㎖의 농도로 맞추어 주고 250㎖의 삼각 플라스크에서 30㎖의 PDB 배지에 50㎕ 첨가하여 25℃ 및 150rpm으로 암조건에서 10일간 배양하였다. 배양이 완료된 배양액은 50㎖의 코니칼 튜브로 옮긴 뒤 10,000×g으로 20분간 원심분리하여 균체와 배양액을 분리하였다. 분리된 배양액에 동량의 에틸아세테이트를 첨가한 후 20분간 볼텍싱하고, 4,000rpm으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 취하였다. 에틸아세테이트는 기체 질소를 이용하여 증발시키고 남은 추출물은 2% 아세톤에 배양액 원액의 농도로 용해시킨 후 다음 실험에 이용하였다. 배양액과 배양액 추출물은 사용하기 전까지 -76℃의 냉동고에 보관하였다.

7. 항노제마 활성 검정

항노제마 활성 검정은 순수 분리된 포자로부터 첫 번째 건조과정까지 발아활성 검정의 방법과 동일하게 진행하였다. 이후 완벽히 마른 포자 위에 곤충병원성 곰팡이 배양액 추출물과 0.2M의 수크로오스 용액을 1:1 비율로 배합하여 1.5㎕ 첨가 후 커버글라스를 덮고 6시간 동안 약 25℃의 상온에서 건조시켰다. 포자에 처리된 최종 농도로 배양액 추출물은 0.5X이며, 수크로오스 수용액은 0.1M이 되었다. 건조된 프레파라트는 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 포자에 대한 추출물의 살균(bacteriocidal) 및 정균(bacteriostatic) 효과를 확인하기 위해, 추출물이 제거된 후에도 포자의 발아 여부를 확인하였고, 추출물 제거 후 포자가 발아하는 처리군은 정균작용, 발아하지 않는 처리군은 살균작용으로 판단하였다. 정균 및 살균작용은 1.5㎖의 마이크로튜브에 5×10⁵ 포자/㎖의 포자를 각 분주하고 400×g으로 5분간 원심분리후 상층액을 제거하였다. 그 뒤 가라앉은 포자에 배양액 추출물을 넣어주고 볼텍싱한 후, 2시간 동안 상온에서 진탕 배양하였다. 정균(발아억제) 활성 기작은 배양액 추출물 처리된 현탁액을 그대로 세포반응 슬라이드글라스에 20㎕씩 분주하고 완벽하게 건조시킨 후, 0.1M의 수크로오스를 첨가하여 발아율을 측정하였고, 살균 활성 기작은 배양액 추출물 처리하고 2시간 후 400×g으로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거한 뒤 동량의 증류수를 가하는 세척과정을 2회 반복하여 모든 배양액 추출물을 제거한 현탁액을 위와 동일한 과정을 진행한 후 발아율을 측정하였다.

8. 꿀벌에 대한 안전성 평가

꿀벌은 사육하고 있는 양봉장에서 채집하여 실험에 이용하였다. 한 케이지당 20마리씩 꿀벌을 채집하였고 50% 수크로오스와 화분떡(Bee bread)을 공급하며 24시간 동안 케이지에 적응시킨 후 실험에 이용하였으며, 케이지는 1회용으로 제작하였다. 배양액 추출물에 대한 안전성 평가를 위해, 추출물이 혼합되어 있는 50% 수크로오스를 꿀벌에게 1회 섭식시켰고, 비교를 위한 대조군에는 처리된 용매와 동일한 농도가 포함된 50% 수크로오스를 1회 섭식시켰다. 꿀벌의 생존율은 추출물 처리 후 14일까지 24시간 간격으로 관찰하며 기록하였고, 약 25℃의 상온 및 암조건에서 보관하였으며, 실험은 각 처리군마다 3회 반복 수행하였다.

9. 꿀벌에 대한 노제마 발병억제 평가

발병억제 평가에 사용한 유봉은 우화한지 24시간 이전의 유봉을 각 케이지에 25마리씩 넣고 50% 수크로오스와 화분떡을 공급하며 케이지 내부에서 24시간 동안 적응시킨 후 다음 실험에 이용하였다. 곰팡이 배양액 추출물의 처리 전과 후의 효과를 비교하기 위해 추출물을 노제마 섭식 전, 후로 나누어 처리하였고, 비교를 위한 대조군은 처리군의 용매와 동일한 농도의 용매가 포함된 50% 수크로오스를 처리하였다. 노제마 포자는 원심분리 후 50% 수크로오스에 부유시켜 최종농도 1×10⁶ 포자/㎖로 현탁액을 1㎖씩 투여하여 꿀벌에 경구감염을 유도하였다. 발병억제 평가를 위한 생존율은 14일간 매일 관찰하며 기록하였고, 포자의 증식은 감염 후 14일째 되는 날의 꿀벌 5마리를 임의로 선정하여 중장으로부터 포자를 분리하고 혈구계산판(hemocytometer)를 이용해 계수하여 발병억제 정도를 평가하였다. 실험은 각 처리군마다 3회 반복하여 수행하였다.

실시예 1. 노제마 세라내( N. ceranae )의 분리 및 동정

꿀벌의 대표적인 노제마병은 노제마 아피스(N. apis)와 노제마 세라내(N. ceranae)에 의해 발병되며, 본 발명에 이용된 국내에서 분리된 노제마의 동정을 위하여 형태학적 동정 및 분자생물학적 동정을 실시하였다. 형태학적 동정은 노제마 포자의 위상차 현미경 관찰을 통해 이루어졌다. 노제마 포자 30개를 임의로 선택하여 길이를 측정한 결과, 장축 평균 4.7㎛, 단축 평균 2.2㎛였다(도 1). 기보고(Fries et al., 2013, Journal of Apicultural Research, 52(1), 1-28)에 따르면, 노제마 아피스의 길이는 6×3㎛이고, 노제마 세라내의 길이는 4.7×2.7㎛로, 본 발명에서 이용한 포자는 노제마 세라내로 추정되었다. 더욱 정확한 동정을 위하여, 노제마 게놈 DNA를 대상으로 노제마 아피스 및 노제마 세라내에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR을 실시하였다. 그 결과, 노제마 세라내에 특이적인 Mnceranae-F 프라이머에 대해서만 PCR 산물이 확인됨으로써 본 발명의 노제마는 노제마 세라내(N. ceranae)로 최종 동정되었다(도 2).

실시예 2. 곤충병원성 곰팡이 배양액 추출물의 항노제마 활성

곤충병원성 곰팡이로부터 항노제마 활성을 검정하기 위하여, 국내에서 분리된 19속 29종의 342개 균주의 배양액을 에틸아세테이트(ethyl acetate) 분획법으로 추출하고 포자발아 활성 검정을 실시하였다. 상기 곰팡이 배양액 추출물의 항노제마 활성 검정에 앞서 추출물의 용해를 위해 이용된 용매인 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 아세톤의 노제마 포자 발아에 대해 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 최대 농도인 25% DMSO 또는 20% 아세톤을 처리하여도 용매 무처리 대조군과 유사한 포자발아 활성을 나타내는 것이 관찰되어, DMSO 또는 아세톤 용매가 노제마의 포자발아에는 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.

(1) 항노제마 활성 균주 선발

본 발명에서 분리한 342개의 곤충병원성 곰팡이 배양액으로부터 제조한 추출물의 항노제마 활성 검정을 위해, 포자 발아억제 양상을 확인하였다. 그 결과, 분리한 342개의 곤충병원성 곰팡이 배양액 추출물은 0%에서부터 최대 96.5%까지 다양한 항노제마 활성을 보였으며, 항노제마 활성 정도에 따라 분류한 결과, 하기 표 3에 개시한 바와 같이, 20개 균주에서 90% 이상의 항노제마 활성을 나타내었으며, 69개 균주에서 80%~90%의 항노제마 활성을 보였다. 전체 균주대비 26% 이상의 균주가 80% 이상의 높은 항노제마 활성을 보임으로써 곤충병원성 곰팡이 배양액 추출물의 항노제마 활성이 매우 높음을 확인할 수 있었다.

곤충병원성 곰팡이 분리 균주들의 포자발아 억제 활성 빈도

극성관(polar tube) 발아 분석결과
억제활성(%)	90∼100%	80∼90%	70∼80%	60∼70%	60% 이하
분리균주 수	20(5.8%)	69(20.2%)	82(24.0%)	43(12.6%)	128(37.4%)

또한, 곤충병원성 곰팡이 균주별로 항노제마 활성을 확인한 결과, 하기 표 4에 개시한 바와 같이 총 10속 16종의 곤충병원성 곰팡이 추출물에서 항노제마 활성을 나타내었으며, 곤충병원성 곰팡이 균주들 중에 뷰베리아 바씨아나(Beauveria bassiana)는 110개 균주 중 43.6%인 48개 균주로 가장 많았으며, 90% 이상의 항노제마 활성을 보이는 균주 중에는 7개의 뷰베리아 바씨아나 균주가 포함되었다(표 3). 이사리아 파리소나(Isaria farisona)는 12개 균주 중 41.6%인 5개 균주가 항노제마 활성을 보였으며, 메타리지움 속(Metarhizium spp.)은 65개 균주 중 23%인 15개 균주에서 항노제마 활성이 확인되었다. 이러한 결과들을 바탕으로 곤충병원성 곰팡이들 중 80% 이상의 항노제마 활성을 보이는 89개의 균주를 대상으로 하기 정량실험을 실시하였다.

곤충병원성 곰팡이 분리 균주별 항노제마 활성

균류(Fungus)	분리균주 수	항노제마 활성을 보인 균주 수
All isolates	342	89 (26%)*
Acremonium sp.	1	0 (0%)
Aspergillus spp.	8	1 (12.5%)
Beauveria bassiana	110	48 (43.6%)
Beauveria brongniartii	8	1 (12.5%)
Beauveria cf. bassiana	8	1 (12.5%)
Bionectria spp.	7	0 (0%)
Chaunopycnis spp.	23	1 (4.3%)
Clonostachys rosea	1	0 (0%)
Fusarium spp.	2	0 (0%)
Isaria farinosa	12	5 (41.6%)
Isaria fumosorosea	6	1 (16.6%)
Isaria spp.	22	5 (22.7%)
Lecanicillium spp.	8	1 (12.5%)
Metarhizium anisopliae var.anisopliae	65	15 (23%)
Metarhizium anisopliae var. lepidiotum	1	0 (0%)
Metarhizium flavoviride var. pemphigum	16	3 (18.7%)
Mucorales	1	0 (0%)
Myrothecium spp.	5	0 (0%)
Paecilomyces carneus	3	0 (0%)
Paecilomyces lilacinus	3	1 (33.3%)
Paecilomyces marquandii	5	1 (20%)
Paraconiothyrium spp.	2	1 (50%)
Phialocephala spp.	1	0 (0%)
Pochonia spp.	17	3 (17.6%)
Simplicillium sp.	1	1 (100%)
Tolypocladium spp.	3	0 (0%)
Verticillium spp.	3	0 (0%)

(2) 항노제마 활성의 정량 평가

상기 선발된 89개의 곤충병원성 곰팡이 배양액 추출물을 100%, 10% 및 1% 농도로 증류수에 희석하여 항노제마 활성을 확인하였다. 그 결과, 선발된 89개의 균주들 중에 49%인 44개의 균주는 추출물 원액(100%)에서 높은 활성을 가지면서 1%의 농도에서도 항노제마 활성이 80% 이상으로 높게 나타났으며, 농도에 따른 활성 감소는 원액(100%)과 1%의 농도에서 활성차이가 20%를 넘지 않았다. 나머지 51%의 45개 균주는 추출액의 농도에 따라 그 활성이 크게 감소하는 경향을 보였다. 추출액의 농도 감소에도 높은 활성 또는 유사한 활성을 보인 44개의 균주들은 뷰베리아 바씨아나(B. bassiana)가 24개 균주(54.5%)로 가장 많았으며, 메타리지움 아니소플리애(Metarhizium anisopliae)가 6개 균주, 이사리아 파리소나(Isaria farisona)가 4개 균주인 것을 확인하였다(표 5).

현재까지 천연 추출물을 이용하여 노제마병을 방제하는 대부분의 선행 연구들은 추출물의 농도가 적어짐에 따라 발병 억제 활성도 비례하여 낮아지는 양상을 보였다. 본 발명의 곤충병원성 곰팡이 배양액 추출물의 처리농도 감소에도 유사한 활성을 보인 결과에 대해서는 본 발명의 곤충병원성 곰팡이 배양액 추출물 내에 항노제마 활성 물질이 높은 농도로 존재하거나 물질의 활성이 매우 높기 때문으로 판단된다.

곤충병원성 곰팡이 배양액 추출물의 모든 처리 농도(100%, 10% 및 1%)에서 유사한 항노제마 활성을 나타낸 44개의 곤충병원성 곰팡이 분리 균주 목록

분리 균주	분리 균주 수(%)
Aspergillus versicolor	1 (2.2)
Beauveria bassiana	24 (54.5)
Beauveria brongniartii	1 (2.2)
Chaunopycnis sp.	1 (2.2)
Isaira sp.	1 (2.2)
Isaria farinosa	4 (8.8)
Isaria fumosorosea	1 (2.2)
Lecanicillium sp.	1 (2.2)
Metarhizium anisopliae var. anisopliae	6 (13.6)
Paecilomyces lilacinus	1 (2.2)
Paecilomyces marquandii	1 (2.2)
Pochonia sp.	2 (4.4)

(3) 활성기작 평가

곤충병원성 곰팡이 배양액 추출물의 항노제마 활성 기작을 확인하기 위하여, 처리한 곤충병원성 곰팡이 배양액 추출물의 제거 유무 조건에서 노제마 포자 발아 여부를 검정하였다. 그 결과, 우수한 포자발아 억제율(%)을 나타낸 곰팡이 균주는 메타리지움 아니소플리애 296(Metarhizium anisopliae 296), 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60), 뷰베리아 브롱니아티 183(Beauveria brongniartii 183), 뷰베리아 바씨아나 35, 161 및 59(B. bassiana 35, 161 및 59)로 3속 4종이었으며, 포자발아 억제율을 가진 균주 중 포코니아 속 60 균주의 경우, 이의 배양액 추출물을 제거하여도 84.4%로 가장 높은 포자발아 억제율을 보였으며, 뷰베리아 바씨아나 35는 81.6%, 뷰베리아 브롱니아티 183은 79.7%, 뷰베리아 바씨아나 59는 75.3%, 메타리지움 아니소플리애 296은 65.8%, 뷰베리아 바씨아나 161은 62%로 포자발아 억제율을 나타내었다(도 4).

상기 균주를 선발하는 과정에서 상기 뷰베리아 바씨아나 35, 161 및 59 균주들은 같은 속종에 포함되어 있으므로, 분석하는 물질의 다양성을 고려하여 3개의 균주 중 포자발아 억제율이 제일 낮았던 뷰베리아 바씨아나 161 균주를 제외시켰으며, 이 다음으로 우수한 포자발아 억제율을 나타낸 패실로마이세스 마르콴디이 364 균주를 포함하여 메타리지움 아니소플리애 296, 뷰베리아 브롱니아티 183, 뷰베리아 바씨아나 35 및 59 및 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주를 노제마 포자발아 억제 활성을 가지는 곤충병원성 곰팡이 균주로 선발하여 꿀벌에 대한 노제마 발병 억제 효과 실험을 진행하였다.

실시예 3. 꿀벌에 대한 노제마 발병 억제 효과

(1) 꿀벌에 대한 안전성 검정

① 용매의 안전성 검정

정량 배양액 추출물의 생물검정에 앞서 추출물의 용해를 위해 이용된 용매인 아세톤에 대한 꿀벌의 안전성 검정을 실시하였다. 아세톤을 1%, 2%, 4% 및 8%로 제조하여 50% 수크로오스에 배합한 후, 꿀벌에 1회 투여하였고 14일까지 관찰하였다. 그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 1% 및 2%의 아세톤이 첨가된 처리군에서는 무처리군(contorl)와 유사한 꿀벌 생존율을 보였으나, 4%의 아세톤이 첨가된 처리군에서는 아세톤 투여 4일 후부터 생존율이 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 최종 생존율은 무처리군과 5%의 차이를 보였다. 8%의 농도에서도 4일 후부터 생존율이 감소하였고 최종적으로 30%의 생존율 차이를 보였다. 이러한 결과를 통해, 2%의 아세톤이 첨가되어도 꿀벌에 영향을 미치지 않았으며, 실제로 배양액 추출물의 안전성 검정 및 발병억제 검정에서 첨가되는 아세톤의 농도는 최대 0.2%이므로, 검정에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

② 배양액 추출물의 안전성 검정

상기 선발된 6개의 균주들을 대상으로 꿀벌에 대한 안정성 여부를 확인하기 위해, 선발된 패실로마이세스 마르콴디이 364(Paecilomyces marquandii 364), 메타리지움 아니소플리애 296(Metarhizium anisopliae 296), 뷰베리아 브롱니아티 183(Beauveria brongniartii 183), 뷰베리아 바씨아나 35 및 59(B. bassiana 35 및 59) 및 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주들의 배양액 추출물(이하 '시료'라 함)을 1% 및 10%의 농도로 꿀벌에 급여하였으며, 처리한 시료가 모두 소비되면 50% 수크로오스를 계속 급여하였다. 그 결과, 도 6a에 개시한 바와 같이 1%의 시료를 처리하였을 때, 대조군에 대비하여 꿀벌의 생존율 변화에 큰 영향이 없었으나, 뷰베리아 브롱니아티 183 균주의 배양액 추출물을 처리한 군에서는 9일째부터 생존율이 감소하기 시작하여 14일째에는 대조군에 대비하여 22%의 낮은 생존율을 나타내었다.

또한, 10%의 시료를 처리하였을 때에는, 뷰베리아 바씨아나 59와 뷰베리아 브롱니아티 183 균주의 배양액 추출물을 처리한 군에서 꿀벌의 생존율이 현저히 감소되었으며, 14일째에 대조군에 대비하여 각각 18%와 37%의 낮은 생존율을 보였다(도 6b). 상기 실험에서, 뷰베리아 브롱니아티 183(Beauveria brongniartii 183) 균주는 1% 및 10%의 배양액 추출물 모두에서 꿀벌의 생존율에 영향을 주어 하기 실험에서 제외시켰다.

(2) 꿀벌에 대한 노제마 세라내 발병억제 검정

① 노제마 세라내 감염 전 추출물 투여

상기 선발된 5개의 균주들을 대상으로 곤충병원성 곰팡이 배양액 추출물의 안전성을 확인한 결과, 1% 농도에서는 안전성이 확인되었으며, 10% 농도에서는 약한 독성이 관찰되었다. 꿀벌에서 노제마 발병억제 효과의 극대화를 위하여, 5%의 배양액 추출물을 꿀벌에 처리하고 발병억제효과를 검정하였다. 발병억제 효과의 검정은 노제마 세라내 감염 전에 추출물을 처리하거나 노제마 세라내 감염 후에 추출물을 처리하는 2가지 방법으로 진행하여 예방 및 치료 효과를 각각 비교 검정하였다. 예방 효과로 노제마 세라내 감염 전에 배양액 추출물을 처리한 결과, 도 7a에 개시한 바와 같이 패실로마이세스 마르콴디이 364(P. marquandii 364) 균주 배양액 추출물만이 노제마 세라내만을 처리한 음성 대조군(nosema only)에 대비하여 꿀벌의 생존율을 10% 상승시키는 효과를 보인 반면, 나머지 균주의 배양액 추출물은 오히려 꿀벌의 생존율을 감소시켰다. 또한, 포자생산 억제를 확인한 결과, 뷰베리아 바씨아나 59 균주의 배양액 추출물은 79%, 메타리지움 아니소플리애 296는 65%, 포코니아 속 60은 32%, 패실로마이세스 마르콴디이 364는 21%로 포자생산 억제 효과를 보였다(도 7b).

노제마 세라내를 감염하지 않은 무처리 대조군(no inoculated) 대비 곰팡이 배양액 추출물 처리군의 감소된 생존율은 추출물의 독성에 의한 영향으로 추정되며, 그와 관련된 꿀벌의 생력 약화가 노제마 포자의 생산량 저하에도 영향을 미친 것으로 여겨진다. 꿀벌의 생존율이 높았던 패실로마이세스 마르콴디이 364에 비해 더 낮은 포자 생산량을 보인 뷰베리아 바씨아나 59, 메타리지움 아니소플리애 296 및 포코니아 속 60의 경우, 추출물의 독성이 영향을 보인 것으로 여겨진다. 추출물의 안전성 평가 결과에서 10% 농도 처리시 약한 독성을 보였으며, 비록 5%로 더 낮춘 농도의 추출물을 처리하였지만, 노제마 감염에는 추출물의 약한 독성이 꿀벌의 노제마에 대한 감수성을 증대시켜 결국 꿀벌의 생존율을 감소시킨 결과로 판단된다.

② 노제마 세라내 감염 후 추출물 투여

노제마 세라내 감염 후에 상기 선발된 5개의 균주 배양액 추출물을 처리한 결과, 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주 및 패실로마이세스 마르콴디이 364(P. marquandii 364)의 경우, 노제마 세라내를 감염한 대조군(nosema only) 대비 각각 약 10%와 4%의 꿀벌 생존율의 상승효과를 보였으나, 나머지 균주 배양액 추출물은 생존율이 오히려 감소하였다(도 8a). 또한, 포자 생산량의 경우에는 모든 처리군에서 노제마 세라내를 감염한 대조군(nosema only) 대비 포자 생산량이 감소된 것을 확인하였다(도 8b). 상기 음성 대조군(nosema only) 대비 생존율의 감소와 함께 포자 생산량의 감소를 보인 메타리지움 아니소플리애 296, 뷰베리아 바씨아나 35와 59 균주의 결과는 앞서 결과와 유사하게 추출물의 독성이 영향을 준 것으로 판단된다.

또한, 곤충병원성 곰팡이 배양액 추출물의 효과의 극대화를 위하여, 꿀벌에 대한 독성을 배제하기 위해 안전성 검정에서 꿀벌에 영향을 주지 않는 농도인 1%의 추출물을 투여하여 노제마의 발병억제 검정을 진행하였으며, 추출물의 처리 시기는 앞선 실험의 결과에서 더 효과적인 발병억제 활성을 보였던 노제마 세라내 감염 후 추출물 처리 조건으로 실험을 진행하였다. 그 결과, 도 9a에 개시한 바와 같이 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주의 배양액 추출물 처리군은 노제마 세라내에 감염되지 않은 무처리군(control)보다 더 높은 생존율을 보였고, 패실로마이세스 마르콴디이 364(P. marquandii 364) 균주의 배양액 추출물 처리군은 무처리군과 비슷한 생존율을 보였으며 다른 균주들의 배양액 추출물 처리군은 무처리군보다 생존율이 감소하였다. 또한, 포자생산 억제 활성을 확인한 결과, 5%의 추출물을 투여하였을 때(도 7b)와 비교하여 포코니아 속 60 및 패실로마이세스 마르콴디이 364 균주 배양액의 추출물 처리군이 높은 포자 생산 억제 활성을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다(도 9b).

농업생명공학연구원 KACC93281P 20170823

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pochonia sp. 60 strain having antifungal activity against nosema disease pathogen and uses thereof <130> PN17333 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cgttaaagtg tagataagat gtt 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcatgtcttt gacgtactat g 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gacttagtag ccgtctctc 19

Claims (6)

1. 노제마병 병원균에 대해 항진균 활성을 가지는 기탁번호가 KACC93281P인 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 노제마병 병원균은 노제마 세라내(Nosema ceranae)인 것을 특징으로 하는 균주.
4. 제1항 또는 제3항에 따른 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주, 이의 배양액 또는 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 노제마병 방제용 조성물.
5. 제1항 또는 제3항에 따른 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주를 배양하는 단계를 포함하는 노제마병 방제용 조성물의 제조 방법.
6. 제1항 또는 제3항에 따른 포코니아 속 60(Pochonia sp. 60) 균주, 이의 배양액 또는 배양액의 추출물의 유효량을 노제마병 의심 꿀벌에 처리하는 단계를 포함하는 노제마병을 방제하는 방법.

Images