KR101773825B1

KR101773825B1 - 이투린을 생산하는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101773825B1
Application number: KR1020150178940A
Authority: KR
Inventors: 김진철; 김기현; 유난희
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2017-09-01
Also published as: KR20170071061A; WO2017105050A1

Abstract

본 발명은 이투린을 생산하는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주와 이로부터 분리한 활성물질인 이투린(iturin)은 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 다양한 식물병 원인균에 대해 우수한 방제활성을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 식물병 방제에 대한 생물농약으로 화학농약을 대신할 수 있고, 환경오염으로 인한 문제점을 방지할 수 있는 획기적인 생물적 방제제로 제공될 수 있다.

Description

이투린을 생산하는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도{Composition for controlling plant disease comprising Bacillus amyloliquefaciens strain producing iturin as effective component and uses thereof}

본 발명은 이투린을 생산하는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

붉은곰팡이병(fusarium blight, 유성생식세대: Gibberella zeae, 무성생식세대: Fusarium graminearum)은 밀, 보리, 옥수수, 벼 등에 일정 주기를 두고 대발생하여 전 세계적으로 많은 피해를 초래하여 왔으며, 특히 지난 몇 년간 미국 및 캐나다를 중심으로 대발생하여 세계 곡물 가격을 급등시키는 결과를 초래하였다. 붉은곰팡이병은 곡물의 생산량 감소를 초래할 뿐만 아니라 감염된 부위에서 인축에 유해한 트리코테센(trichothecene), 제아라레논(zearalenone) 등의 곰팡이독소를 잔류시킴으로써 농산품의 품질을 저하시키며, 특히 트리코테센(trichothecene)의 일종인 디옥시니발레놀(deoxynivalenol, DON)은 면역력 저하, 소화관 장애를 유발하는 등 심각한 중독증을 야기한다. 특히, 국내의 밀 재배단지에서의 붉은곰팡이(fusarium) 오염률과 트리코테센(trichothecenes) 검출치 간에 상당한 정도의 상관관계가 있는 것으로 보아 붉은곰팡이병에 의한 곰팡이 독소의 오염은 국민 건강에 상당한 위협이 되고 있다.

화학적 방제에 의한 붉은곰팡이 독소 오염 예방은 살균제 처리 시기가 매우 중요한데, 밀의 경우 이삭으로부터 꽃밥이 처음으로 나오는 시기에 살포해야 하며, 보리의 경우 이삭이 나오는 시기에 살포해야 한다. 메트코나졸(metconazole), 프로피코나졸(propiconazole), 테부코나졸+프로티오나졸(tebuconazole+prothionazole), 테부코나졸(tebuconazole) 등의 DMI(Demethylation Inhibitor) 계열의 살균제가 가장 효과가 우수하나, 국소적 침투 이행능과 일부 약제의 경우 잔류문제 때문에 수확 전 30일 이전까지만 사용이 가능하다는 문제점으로 인하여 포장에서의 방제가는 50% 이하로 약효가 우수하지 못한 단점이 있다.

또한, 농약 중 다수를 차지하는 합성농약의 오남용으로 인해 토양, 수질 및 농산물 오염, 독성, 생태계 교란, 저항성 균주들의 출현 등 여러 가지 문제점이 제기되고 있다. 이에 최근에는 OECD 국가를 중심으로 합성농약의 사용량을 40% 이상 절감하고자 하고 있으며, 또한 웰빙에 대한 관심 증가와 함께 선진국을 중심으로 유기농산물에 대한 수요가 급증하고 있는 상황이다.

한편, 한국등록특허 제0825652호에는 신규 바실러스 서브틸리스 DBB 1501 균주 및 이를 이용한 식물병의 방제방법에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제0380625호에는 식물병원균 방제에 유용한 무독성 살균제 조성물에 대해 개시하고 있다. 하지만 본 발명의 이투린을 생산하는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도에 대해서는 아직 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 다양한 식물병 원인균에 대해 항진균 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주를 분자계통학적으로 동정하였으며, 상기 균주로부터 활성물질을 분리하였다. 상기 균주의 배양 상층액의 부탄올 추출물의 항진균 활성을 확인한 결과, 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)의 포자 발아에 대하여 억제 활성을 보였으며, LC-ESI-MS/MS 분석을 통해 상기 활성물질이 이투린(iturin)임을 동정하였다. 또한 기존 선행특허에서 상기 이투린을 생산하면서 높은 항진균 활성을 보인다고 알려진 바실러스 속 균주들과의 항진균 활성을 비교한 결과, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주가 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 및 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides)에 대해 가장 우수한 항진균 활성을 보였으며, 온실뿐만 아니라 포장 조건에서도 맥류 붉은곰팡이병에 대해 뛰어난 방제효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 식물병 원인균에 대하여 항진균 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주와 이로부터 분리한 활성물질인 이투린(iturin)은 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 다양한 식물병 원인균에 대해 우수한 방제활성을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 식물병 방제에 대한 생물농약으로 화학농약을 대신할 수 있고, 환경오염으로 인한 문제점을 방지할 수 있는 획기적인 생물적 방제제로 제공될 수 있다.

도 1은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주의 16s rRNA(a), gryA(Gyrase subunit A)(b) 및 recA(recA protein)(c) 유전자의 염기서열 분석을 통해 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주 처리에 따른 식물 병원균인 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)(A), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)(B) 및 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides)(C)의 생장 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주로부터 분리된 항진균 활성물질에 대한 양이온 모드의 ESI-MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주로부터 분리된 항진균 활성물질의 ESI-MS 분석시 나온 1057.9m/z 이온 피크(A) 및 1043.9m/z 이온 피크(B)에 대한 MS/MS 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주로부터 분리된 항진균 활성물질인 이투린(iturin)의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 6은 온실 조건에서 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주 배양액의 5배 희석액 처리에 따른 맥류 붉은곰팡이병의 발병 억제 정도를 나타낸 것이다. Untreated control은 비처리 음성 대조군이며, 알무리(almouri)는 양성 대조군이다.
도 7은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주 배양액의 부탄올 추출물과 기존 선행특허에서 이투린을 생산하면서 높은 항진균 활성을 보인다고 알려진 바실러스 리퀘니포미스 N1(Bacillus liqueniformis N1) 및 바실러스 속(Bacillus sp.) CMB32 균주의 각각 배양액의 부탄올 추출물 처리에 따른 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)의 포자 발아에 대한 억제 활성을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주 배양액의 부탄올 추출물과 기존 선행특허에서 이투린을 생산하면서 높은 항진균 활성을 보인다고 알려진 바실러스 리퀘니포미스 N1(Bacillus liqueniformis N1) 및 바실러스 속(Bacillus sp.) CMB32 균주의 각각 배양액의 부탄올 추출물 처리에 따른 푸사리움 베르티실리오이데스(F. verticillioides)의 포자 발아에 대한 억제 활성을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주의 배양액 부탄올 추출물과 기존 선행특허에서 이투린을 생산하면서 높은 항진균 활성을 보인다고 알려진 바실러스 리퀘니포미스 N1(Bacillus liqueniformis N1) 및 바실러스 속(Bacillus sp.) CMB32 균주의 각각 배양액의 부탄올 추출물 처리에 따른 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)의 포자 발아에 대한 억제 활성을 나타낸 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물병 원인균에 대하여 항진균 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주를 제공한다.

상기 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주는 맥류 붉은곰팡이병 원인균인 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 토마토 시들음병 원인균인 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 및 옥수수 이삭썩음병 원인균인 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides)에 대해 항진균 활성이 뛰어난 균주로 선발되었다. 상기 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주를 한국생명공학연구원에 2015년 11월 25일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC12952BP).

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주는 하기 화학식 1로 표시되는 이투린(iturin)을 생산하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 식물병 원인균은 푸사리움(Fusarium) 속 식물 병원균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 식물병은 맥류 붉은곰팡이병, 토마토 시들음병 또는 옥수수 이삭썩음병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 맥류 붉은곰팡이병 원인균은 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)이고, 토마토 시들음병 원인균은 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)이며, 옥수수 이삭썩음병 원인균은 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물에서, 상기 식물병은 맥류 붉은곰팡이병, 토마토 시들음병 또는 옥수수 이삭썩음병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물에서, 상기 맥류 붉은곰팡이병 원인균은 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)이고, 토마토 시들음병 원인균은 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)이며, 옥수수 이삭썩음병 원인균은 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 예를 들어, 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물은 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조 토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물은 관수용, 엽면 살포용, 종자 소독용 또는 농기구 소독용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물은 작물체 흡수 및 효과를 증진시키기 위하여 확산제 및 침투제, 또는 계면활성제와도 혼용이 가능하다.

상기 식물병을 방제하는 방법으로는 상기 식물병 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 분무 또는 살포하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 식물병을 방제하는 방법에서, 상기 식물병은 맥류 붉은곰팡이병, 토마토 시들음병 또는 옥수수 이삭썩음병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 식물병을 방제하는 방법에서, 상기 맥류 붉은곰팡이병 원인균은 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)이고, 토마토 시들음병 원인균은 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)이며, 옥수수 이삭썩음병 원인균은 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 ( Bacillus amyloliquefaciens ) JCK -12 균주의 분자생물학적 동정 및 계통학적 분류

본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주는 16s rRNA, gyrA(Gyrase subunit A) 및 recA(rec A protein) 유전자의 염기서열 분석을 통해 분자생물학적으로 동정하였으며, 계통도 분석을 실시하였다. 상기 균주를 TSB(Tryptic soy broth, 구입처: Becton and Dickinson사) 액체배지에 접종한 다음, 30℃에서 1일간 150rpm으로 진탕배양하였다. ELPIS-Biotech의 DOKDO-프렙 박테리아 게놈 DNA 정제 키트를 이용해서 프로토콜에 따라서 균주의 gDNA(genomic DNA)를 추출하였다. 균주의 추출된 gDNA, 인트론 바이오테크놀로지(iNtRON Biotechnology)의 PCR-프리믹스(Polymerase chain reaction-premix) 및 균주의 16s rRNA, gyrA 및 recA 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 혼합한 후 PCR을 통해 상기 16s rRNA, gyrA 및 recA 유전자를 증폭하였다.

PCR에 사용된 프라이머 세트는 16s rRNA의 경우, 9F(서열번호 1, 5'-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3')/1512R(서열번호 2, 5'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3')이며, gyrA의 경우, gyrA-F(서열번호 3, 5'-CAG TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT-3')/gyrA-R(서열번호 4, 5'-CAA GGT AAT GCT CCA GGC ATT GCT-3')이었다. 그리고 recA의 경우, recA-F(서열번호 5, 5'-GAT CGT CAR GCA GSC YTW GAT-3')/recA-R(서열번호 6, 5'-TTW CCR ACC ATA ACS CCR AC-3')이 사용되었다. PCR은 95℃에서 5분을 시작으로 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분을 30번 반복한 후, 72℃에서 7분, 12℃에서 증폭을 끝냈다. 증폭된 상기 16s rRNA, gyrA 및 recA 유전자의 PCR 산물은 제노텍(대전, 대한민국)에 염기서열 분석을 의뢰하여 균주의 16s rRNA(서열번호 7), gyrA(서열번호 8) 및 recA(서열번호 9) 유전자의 염기서열을 얻었다. 16s rRNA, gyrA 및 recA 유전자의 염기서열은 NCBI의 Blast 검색을 이용하여 GenBank database의 염기서열을 비교하였다. 또한 16s rRNA, gyrA 및 recA의 유전자 염기서열에 기초하여 BioEdit Sequence Alignment Editor로 염기서열을 정렬하고, 메가 프로그램 버젼 6.0을 사용하여 boot-strap trials set 1,000 조건에서 NJ(neighbour-joining) 알고리즘을 바탕으로 분자계통학적으로 분석하였다. 그 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 JCK-12 균주는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 동정되었으며, 상기 균주를 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12로 명명하였고, 한국생명공학연구원에 2015년 11월 25일자로 기탁하였다(기탁번호:KCTC12952BP).

실시예 2. 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 ( Bacillus amyloliquefaciens ) JCK -12 균주 처리에 따른 푸사리움 ( Fusarium ) 속 식물 병원균의 균사 생장 저해 활성 측정

본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주가 식물 병원균의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위해, 3종의 푸사리움(Fusarium) 속 식물 병원균을 대상으로 생장 저해 활성을 측정하였다. 구체적으로, 왕성하게 자라고 있는 배양체로부터 얻은 하기 표 1에 기재된 3종의 푸사리움(Fusarium) 속 식물 병원균의 균사조각을 PDA 배지 중앙에 접종하였다. 이후, 상기 접종 부위로부터 약 2.5cm 정도 떨어진 부위에 멸균한 페이퍼 디스크(paper disc)를 올리고, 배양한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주를 접종한 다음 25℃에서 배양하였다. 식물 병원균이 가장자리까지 생장할 때 JCK-12 균주에 의한 식물 병원균의 균사 생장저해 정도를 측정하였다.

그 결과, 하기 표 1 및 도 2에 개시한 바와 같이, 본 발명의 JCK-12 균주는 푸사리움(Fusarium) 속 식물 병원균인 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 및 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides)의 생장을 강하게 저해하는 것으로 나타났다.

본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 처리에 따른 3종의 푸사리움(Fusarium) 속 식물 병원균의 균사 저해 활성 측정 결과

식물병 이름	병원균 학명	저지대의 길이(mm)
맥류 붉은곰팡이병	푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum)	8.5
토마토 시들음병	푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)	8
옥수수 이삭썩음병	푸사리움 베르티실리오이데스 (Fusarium verticillioides)	9.5

실시예 3. 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 ( Bacillus amyloliquefaciens ) JCK -12 균주 처리에 따른 푸사리움 그라미네아룸( F. graminearum )의 포자 발아 저해 활성 측정

본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주의 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)에 대한 포자 발아 억제 활성을 측정하였다. JCK-12 균주를 TSB 액체배지에 접종한 다음, 30℃에서 3일간 150rpm으로 진탕배양하였다. 배양액을 8000×g로 20분간 원심분리한 다음 상층액(이하 '시료'라 함)을 취하였다. 항균 활성성분의 열에 대한 안정성을 조사하기 위해, 121℃에서 20분간 열처리한 시료와 열처리하지 않은 시료를 2.5, 1.25, 2.5, 5 및 10%의 농도로 푸사리움 그라미네아룸 포자에 처리하였다. 본 실시예에 사용한 푸사리움 그라미네아룸 포자는 PDA 배지에서 배양된 푸사리움 그라미네아룸을 잘라 멸균된 CMC(Carboxymethylcellulose) 액체배지에 넣고 25℃에서 200rpm수준으로 5일간 진탕배양하여 얻었으며, PDB 배지로 희석하여 10⁴포자/㎖으로 포자의 농도를 맞추고, 96-웰 플레이트의 각 웰에 180㎕의 포자 현탁액(10⁴포자/㎖)을 가한 다음 여기에 20㎕의 시료를 분주하여 시료를 10%의 농도로 처리하였다. 그리고 10%의 농도로 처리한 웰에서 100㎕를 취하여 다음 웰에 분주하고 100㎕의 포자 현탁액(10⁴포자/㎖)을 섞어 5%의 농도로 제조하였다. 2.5% 및 1.25%도 상기 동일한 방법으로 희석하였다. 양성 대조군으로는 캡탄(captan)을 0.63, 0.31, 0.16 및 0.08㎍/㎖(용매: 메탄올) 수준으로 처리하였고, 음성 대조군으로는 1%(v/v) 메탄올을 처리하였다. 25℃에서 24시간 후에 포자 발아 정도를 측정하였으며, 각 웰에서 포자가 발아하여 균사가 생장한 정도에 따라 활성도를 0, 1, 2, 3 및 4로 표기하였다. 3 반복으로 실험을 수행하였다. 그 결과, 표 2에 개시된 바와 같이 JCK-12 균주의 배양 상층액은 푸사리움 그라미네아룸의 포자 발아에 대하여 강력한 항진균 활성을 보였으며, 100% 포자 발아 억제농도는 열처리하지 않은 배양 상층액의 경우, 2.5%였으며, 열처리한 배양 상층액도 거의 동일한 항진균 활성을 나타내었다. 이러한 결과를 통해 항진균 활성 물질이 열에 대하여 매우 안정하다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 처리에 따른 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)의 포자 발아 억제 활성 측정 결과

시료	열처리	포자 발아 억제 활성도
시료	열처리	10%	5%	2.5%	1.25%
JCK-12 배양 상층액	×	4	4	4	2
JCK-12 배양 상층액	O	4	4	3	0
캡탄(captan)	×	0.63㎍/㎖	0.31㎍/㎖	0.16㎍/㎖	0.08㎍/㎖
캡탄(captan)	×	4	4	2	2
무처리	×	0

*활성도의 숫자가 커질수록 포자 발아 억제 활성이 큰 것을 뜻함(0: 무처리구 대비 75~100% 포자 발아 억제, 1: 무처리구 대비 50~75% 포자 발아 억제, 2: 무처리구 대비 25~50% 포자 발아 억제, 3: 무처리구 대비 0.1~25% 포자 발아 억제, 4: 무처리구 대비 0% 포자 발아 생장)

실시예 4. 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 ( Bacillus amyloliquefaciens ) JCK -12 균주 배양 상층액 의 부탄올 추출물의 항균 활성

본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주가 생산하는 항진균 활성 물질을 분리하기 위해, 배양 상층액을 부탄올로 분획 추출하였다. 부탄올층을 감압농축하여 얻은 부탄올 추출물을 메탄올로 용해한 다음, 상기 실시예 3에서와 같이 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)의 포자 발아 억제 활성을 측정하였다. 그 결과, 하기 표 3에 개시된 바와 같이 부탄올 추출물을 처리하였을 때, 푸사리움 그라미네아룸의 포자 발아를 농도의존적으로 저해하는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 JCK-12 균주 배양 상층액의 부탄올 추출물 처리에 따른 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)의 포자 발아 억제 활성 측정 결과

시료	포자 발아 억제 활성도
시료	200㎍/㎖	100㎍/㎖	50㎍/㎖	25㎍/㎖
JCK-12 부탄올 추출물	4	4	4	2
캡탄(captan)	0.63㎍/㎖	0.31㎍/㎖	0.16㎍/㎖	0.08㎍/㎖
캡탄(captan)	4	4	2	2
무처리	0

실시예 5. 항균활성 물질의 분리 및 동정

본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주가 생산하는 항균활성 물질을 분리하기 위해, 상기 균주를 TSB 액체배지에 접종한 다음, 30℃에서 3일간 150rpm으로 진탕배양하였다. 상기 배양액을 8,000×g에서 20분간 원심분리하여 배양 상층액(4ℓ)을 획득한 다음, 이를 부탄올(2.8ℓ)로 2회씩 분획하였다. 얻어진 부탄올층을 감압농축하여 10g의 부탄올 추출물을 얻었다. 상기 부탄올 추출물을 실리카겔 컬럼에 가한 다음 클로로포름:메탄올:물:아세트산(14:6:1:0.1) 용매로 용출하였다. 이 중 상기 실시예 3에서와 같이 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)에 대한 포자 발아 억제 활성을 나타내는 분획을 모아 감압농축하여 2.72g의 용출물을 수득하였다. 실리카겔 컬럼을 통하여 획득한 각 분획을 10mg/㎖ 수준으로 메탄올로 용해하여 96-웰 플레이트에서 푸사리움 그라미네아룸 포자현탁액(10⁴포자/㎖)에 1%씩 분주한 후 25℃에서 24시간 배양하면서 포자 발아 억제 활성을 확인하였으며, 무처리구의 경우 메탄올을 처리하였다. 상기 용출물을 C18 역상 컬럼에 가하였으며, 컬럼은 물로 용출을 시작하여 메탄올 함량을 증가시키면서 최종적으로 100% 메탄올로 용출하였다. 활성분획(148.3mg)만을 취하여 감압농축하고 나서, 다시 세파덱스(Sephadex) LH-20 컬럼에 가한 다음 100% 메탄올로 용출하였다. 활성분획만을 모아서 감압농축하여 최종적으로 분취 TLC를 사용하여 활성분획을 분리하였다. 시료를 메탄올로 용해한 다음 분취 TLC(Kiesel gel 60GF 254, 0.5 mm film thickness, E. Merck)에 가하여 클로로포름:메탄올:물:아세트산(14:6:1:0.1, v/v)을 이용하여 전개한 후 활성이 있는 부위의 TLC의 실리카겔을 긁은 다음 메탄올로 용출하였다. 이와 같은 과정을 통하여 TLC에서 단일 스폿(spot)을 보이는 물질(25.2mg)을 분리하였다.

분리한 물질의 구조 결정을 위하여 LC-ESI-MS/MS 분석을 실시하였다. 기기는 API2000 triple quadrupole LC-MS/MS 질량분석기(AB Sciex Instruments, CA, USA)를 사용하였고, ESI(electrospray ionization) 양이온 모드(positive ion mode)로 분석하였다. 분리한 물질에 대하여, ESI-MS 분석 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 [M+1]⁺이온 피크가 약 1,044 및 1,058에서 나타났으며, 이 중 주요 피크인 1,044 및 1,058 피크에 대하여 MS/MS 데이터를 얻었다. 그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 Pro-Asn-Ser-AA-Asn-Tyr-Asn-Gln으로 구성되어 있는 것으로 나타났으며, 이투린(iturin) A2 및 A3(또는 A5)로 동정되었다(도 5).

실시예 6. 온실 조건에서 바실러스 아밀로리퀘파시엔스( Bacillus amyloliquefaciens ) JCK -12 균주 처리에 따른 맥류 붉은곰팡이병의 방제 효과

온실 조건에서 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주를 처리하였을 때, 맥류 붉은곰팡이병에 대한 방제 효과를 확인하기 위해, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주의 배양액을 대상 식물인 밀의 이삭에 분무처리하고, 2시간 경과 후 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)을 접종하여 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주의 방제 효과를 조사하였다. 구체적으로, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주를 멸균한 TSB 액체배지에 접종한 다음, 30℃에서 3일간 150rpm으로 진탕배양하였다. 배양액을 증류수로 5배 및 20배로 희석한 희석액을 대상 식물인 밀(품종: 은파밀)의 이삭에 분무 처리하고 실온에서 2시간 동안 방치한 뒤, 맥류 붉은곰팡이병의 원인균인 푸사리움 그라미네아룸의 포자 현탁액(2×10⁵포자/㎖)을 분무 접종한 후 비닐을 포트 전체에 씌워 3일간 습도를 유지하였으며, 이삭에서 꽃이 필 때 시료를 처리하였다. 양성 대조군으로서 합성 농약인 알무리(2,000배 희석, 신젠타)를 처리하였고, 음성 대조군으로는 Tween 20(500㎍/㎖)을 처리하였으며, 접종 2주 후 발병률을 조사하였다. 10개의 밀 이삭을 기본으로 3 반복으로 처리하였다.

그 결과, 하기 표 4 및 도 6에 개시된 바와 같이 JCK-12 균주 배양액의 5배 희석액의 경우, 맥류 붉은곰팡이병에 대하여 42.63%의 방제활성을 보였고, 배양액의 20배 희석액의 경우, 5배 희석액보다 방제가는 낮지만 23.25%의 방제활성을 나타내었다. 이러한 결과를 통해, 합성 항진균 약제인 알무리 보다는 방제효과가 낮게 나타났지만, 42.63%의 방제효과를 보임에 따라 본 발명의 JCK-12 균주 배양액이 맥류 붉은곰팡이병 방제에 효과적임을 확인할 수 있었다.

온실 조건에서 JCK-12 균주 배양액의 맥류 붉은곰팡이병에 대한 방제 효과

처리구	희석배수	발병률(%)	방제가(%)
JCK-12 배양액	20배	52.3	23.25
JCK-12 배양액	5배	37.3	42.63
알무리	2,000배	28.2	84.50
무처리구	-	65.5	-

실시예 7. 포장 조건에서 바실러스 아밀로리퀘파시엔스( Bacillus amyloliquefaciens ) JCK -12 균주 처리에 따른 맥류 붉은곰팡이병의 방제 효과

포장 조건에서 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주를 처리하였을 때, 맥류 붉은곰팡이병에 대한 방제 효과를 확인하기 위해, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주의 배양액을 대상 식물인 밀의 이삭에 분무처리하고, 2시간 경과 후 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum)을 접종하여 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주의 방제 효과를 조사하였다. 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주를 TSB 액체배지에 접종한 다음, 30℃에서 3일간 150rpm으로 진탕배양하였다. 배양액을 증류수로 5배 및 20배로 희석한 희석액을 대상 식물인 밀의 이삭에 분무 처리하고 2시간 뒤, 맥류 붉은곰팡이병의 원인균인 푸사리움 그라미네아룸의 포자 현탁액(2×10⁵포자/㎖)을 분무 접종한 후 비닐을 이삭 전체에 씌워 2일간 습도를 유지하였다. 1차 접종 1주 후에 시료를 2차 처리하고, 1차 접종 2주 후에 발병률을 조사하였다. 양성 대조군으로서 알무리(2,000배 희석, 신젠타)를 처리하였고, 음성 대조군으로는 Tween 20(500㎍/㎖)을 처리하였다. 맥류 붉은곰팡이병에 대한 방제 효과는 하기 표 5에 개시된 바와 같이 포장 조건에서 맥류 붉은곰팡이병에 대한 JCK-12 균주 배양액은 투여량 의존적 반응(dose-dependent response)을 보이면서 높은 방제 효과를 나타내었다. 따라서 추후 최적 배양조건 및 최적 제제 공정을 개발할 경우, 포장에서도 우수한 방제효과를 보이는 제품을 개발할 수 있을 것으로 판단된다.

포장 조건에서 JCK-12 균주 배양액의 맥류 붉은곰팡이병에 대한 방제 효과

처리구	희석배수	발병률(%)	방제가(%)
JCK-12 배양액	20배	18ab*	43.75
JCK-12 배양액	5배	14ab	56.25
알무리	2,000배	4a	87.5
무처리구	-	32b	-

*서로 다른 영어 소문자는 통계적으로 유의적인 차이가 있음을 나타냄(Duncan test, P≤0.05).

실시예 8. 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스( Bacillus amyloliquefaciens ) JCK -12 균주와 이투린(iturin)을 생산하는 바실러스 ( Bacillus ) 속 균주들과의 항진균 활성 비교

본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주와 기존 선행특허에서 이투린(iturin)을 생산하면서 높은 항진균 활성을 보인다고 알려진 바실러스(Bacillus) 속 균주들을 동일한 조건에서 배양한 후 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 및 푸사리움 베르티실리오이데스(F. verticillioides)에 대한 항진균 활성을 비교하였다. 비교 대상 균주로는 바실러스 리퀘니포미스 N1(Bacillus liqueniformis N1, KCTC 10319BP)(대한민국 특허 10-0537782, 바실러스 리케니포미스를 포함하는 진균 방제용 미생물제제 및 이를 이용한 생물학적 방제법) 균주 및 바실러스 속 CMB32(Bacillus sp. CMB32, KCTC 10940BP)(대한민국 특허 10-0819941, 신규한 바실러스속 CMB32 균주 및 이를 이용한 항균활성이 있는 미생물 제제) 균주를 사용하였다. 상기 3종의 바실러스 속 균주를 TSB 배지에 접종하여 30℃에서 1일간 정치배양한 후 단일 콜로니를 떼어 멸균한 TSB 액체배지에 접종한 다음, 30℃에서 150rpm으로 3일간 진탕배양하였으며, 균주당 3 반복으로 실시하였다. 배양액을 8000×g로 20분간 원심분리하여 상층액을 취한 후 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 및 푸사리움 베르티실리오이데스(F. verticillioides)의 포자 발아 저해 활성을 조사하였다. 또한, 상기 3종의 균주 배양 상층액을 동량의 부탄올로 2회 추출한 후 감압농축하였으며, 배양 상층액 10㎖당 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주는 34.4±0.71mg, 바실러스 리퀘니포미스 N1는 32.2±3.3mg 및 바실러스 속 CMB32 균주는 33.9±0.76mg으로, 이들 추출물을 30mg/㎖ 수준으로 메탄올과 멸균수 혼합용액으로 용해한 다음, 300㎍/㎖, 150㎍/㎖, 62.5㎍/㎖ 및 31.3㎍/㎖ 수준으로 처리하여 푸사리움 그라미네아룸(F. graminearum), 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 및 푸사리움 베르티실리오이데스(F. verticillioides)의 포자 발아에 대한 저해 활성을 조사하였다.

그 결과, 도 7에 개시된 바와 같이 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 JCK-12 균주 배양 상층액의 부탄올 추출물은 푸사리움 그라미네아룸 포자 발아에 대하여 포자 발아 완전억제 농도인 최소저해농도(MIC, Minimum Inhibition Concentration)가 75㎍/㎖으로 매우 강한 항진균 활성을 보였다. 이에 비하여 바실러스 속 CMB32 균주의 경우, MIC가 300㎍/㎖ 수준으로 본 발명의 JCK-12 균주에 비하여 4배 낮은 활성을 보였고, 바실러스 리케니포미스 N1 균주의 경우, 시험한 농도에서 MIC를 보이지 않을 정도로 푸사리움 그라미네아룸 포자 발아에 대한 활성이 매우 낮은 것으로 나타났다. 이와 같이 본 발명의 JCK-12 균주는 기존 상기 선행특허 균주인 바실러스 속 CMB32 및 바실러스 리케니포미스 N1 균주들보다 푸사리움 그라미네아룸의 포자 발아에 대한 저해 활성이 매우 우수한 것으로 나타났다.

또한, 상기 3종의 바실러스 균주들의 부탄올 추출물을 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 및 푸사리움 베르티실리오이데스(F. verticillioides)의 포자 발아에 대한 저해 활성을 비교하였다. 그 결과, 도 8에 개시된 바와 같이 푸사리움 베르티실리오이데스의 포자 발아에 대한 저해 활성은 푸사리움 그라미네아룸의 포자 발아에 대한 저해 활성과 마찬가지로 본 발명의 JCK-12 균주의 부탄올 추출물이 가장 강한 포자 발아 저해 활성을 보였다. 또한, 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시의 포자 발아에 대한 저해 활성도 본 발명의 JCK-12 균주가 월등히 강한 것으로 나타났다(도 9).

한국생명공학연구원

KCTC12952BP

20151125

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for controlling plant disease comprising Bacillus amyloliquefaciens strain producing iturin as effective component and uses thereof <130> PN15398 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gagtttgatc ctggctcag 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acggctacct tgttacgact t 21 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cagtcaggaa atgcgtacgt cctt 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 caaggtaatg ctccaggcat tgct 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gatcgtcarg cagscytwga t 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttwccracca taacsccrac 20 <210> 7 <211> 1417 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 7 caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg 60 ctccctgatg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg 120 gataactccg ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtc tgaaccgcat ggttcagaca 180 taaaaggtgg cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga 240 ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg 300 ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga 360 cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg 420 ttgttaggga agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga 480 aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg 540 gaattattgg gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg 600 ctcaaccggg gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat 660 tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc 720 tctggtctgt aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 780 tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc 840 tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag 900 gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960 aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg 1020 cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080 ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga 1140 ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1200 ctgggctaca cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc 1260 caatcccaca aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg 1320 gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380 accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaa 1417 <210> 8 <211> 1025 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 8 cagtcaggaa atgcgtacgt ccttcctgga ctatgcaatg agcgttatcg tatcccgggc 60 gcttccggat gtgcgtgacg gtctgaagcc ggttcacaga cggattttgt acgcaatgaa 120 tgatttaggc atgaccagtg acaaaccata taaaaaatct gcccgtatcg tcggtgaagt 180 tatcggtaag taccacccgc acggtgactc agcggtttac gaatcaatgg tcagaatggc 240 gcaggatttt aactaccgct acatgcttgt tgacggacac ggcaacttcg gttcggttga 300 cggcgactca gcggccgcga tgcgttacac agaagcgaga atgtcaaaaa tcgcaatgga 360 aattctgcgt gacattacga aagacacgat tgactatcaa gataactatg acggttcaga 420 aagagaacct gccgtcatgc cttcgagatt tccgaatctg ctcgtaaacg gagttgccgg 480 tattgcggtc ggaatggcga caaatattcc tccgcatcag cttggggaag tcattgaagg 540 cgtgcttgcc gtaagtgaga atcctgagat tacaaaccag gagctgatgg aatacatccc 600 gggcccggat tttccgactg caggtcagat tttgggccgg agcggcatcc gcaaggcata 660 tgaatccgga cggggatcaa tcacaatccg ggctaaggct gaaatcgaag agacatcatc 720 gggaaaagaa agaattattg tcacagaact tccttatcag gtgaacaaag cgagattaat 780 tgaaaaaatc gcagatcttg tccgggacaa aaaaatcgaa ggaattaccg atctgcgtga 840 cgaatccgac cgtaacggaa tgagaatcgt cattgagatc cgccgtgacg ccaatgctca 900 cgtcattttg aataaccttt acaaacaaac ggccctgcag acgtctttcg gaatcaacct 960 gctggcgctc gttgacggac agccgaaggt actaagcctg aagcaatgcc tggagcatta 1020 ccttg 1025 <210> 9 <211> 602 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 9 gatcgtcagg caggctttga tatggctctt aagcaaatag aaaaacaatt cggcaaaggt 60 tccatcatga agctcggaga aaaaacggat acaagaattt caacggtgcc aagcggttcc 120 cttgcacttg ataccgctct cggaataggc ggatacccgc gcggacggat tattgaagta 180 tacggacctg aaagctcagg taaaacgact gtagcgcttc acgcaatcgc tgaggttcag 240 gaaaaaggcg gacaggcagc atttattgat gctgagcatg ctcttgatcc tgtttacgcg 300 caaaagctcg gtgtcaatat cgaagagctt ctgctttctc agccggatac gggagagcag 360 gcgctagaga ttgctgaagc gctggtgcga agcggcgctg ttgacatcgt agtcgttgac 420 tctgttgcgg cgcttgttcc aaaagctgaa attgaaggtg acatgggtga ttcacacgtc 480 ggtttacagg cgcgtctcat gtctcaggcg ctccgtaagc tttccggcgc catcaataaa 540 tctaaaacaa tcgcaatctt tattaaccag attcgtgaaa aagtcggcgt tatggtcggt 600 aa 602

Claims

맥류 붉은곰팡이병, 토마토 시들음병 또는 옥수수 이삭썩음병 원인균에 대하여 항진균 활성을 가지며, 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 이투린(iturin)을 생산하는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) JCK-12 균주(KCTC 12952BP).
[화학식 Ⅰ]
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제1항에 있어서, 상기 맥류 붉은곰팡이병 원인균은 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)이고, 토마토 시들음병 원인균은 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)이며, 옥수수 이삭썩음병 원인균은 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides)인 것을 특징으로 하는 균주.
제1항 또는 제5항의 균주, 이의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 함유하는 맥류 붉은곰팡이병, 토마토 시들음병 또는 옥수수 이삭썩음병 방제용 조성물.
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제6항에 있어서, 상기 맥류 붉은곰팡이병 원인균은 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)이고, 토마토 시들음병 원인균은 푸사리움 옥시스포룸 에프. 에스피. 리코퍼시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)이며, 옥수수 이삭썩음병 원인균은 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항의 맥류 붉은곰팡이병, 토마토 시들음병 또는 옥수수 이삭썩음병 방제용 조성물의 유효량을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 맥류 붉은곰팡이병, 토마토 시들음병 또는 옥수수 이삭썩음병을 방제하는 방법.
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