CN102286080A

CN102286080A - 一种伊枯草菌素a的制备方法

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Publication number: CN102286080A
Application number: CN2010102022238A
Authority: CN
Inventors: 周金燕; 谭红; 陈芬; 钟娟; 杨杰; 李志东
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2010-06-18
Publication date: 2011-12-21

Abstract

本发明属于抗生素及表面活性剂生物化学工程技术领域，具体涉及一种微生物发酵产生的一种具有表面活性剂性质和抗菌活性的伊枯草菌素A(Iturin A)的分离提取方法。先用硫酸铝、聚氯化铝、聚硫酸铁、明矾、壳聚糖等絮凝剂处理发酵液，再从发酵液中浓缩和提取伊枯草菌素A。本发明具有工艺路线简单，成本经济，极大地提高了Iturin A在工业上和农业上推广应用的可能。

Description

一种伊枯草菌素A的制备方法

所属领域

本发明属于抗生素及表面活性剂生物化学工程技术领域，具体涉及一种微生物发酵产生的一种具有表面活性剂性质和抗菌活性的伊枯草菌素A(Iturin A)的分离提取方法。

背景技术

Iturin A是Delcambe和Devignat在1957年从土壤中分离到的一种Bacillussubtilis菌产生的一类具有表面活性剂性质和抗菌活性的同系物，其结构如下：

Iturin A是最早最著名的来源于微生物的生物表面活性剂之一。与普通表面活性剂相比，微生物表面活性剂具有降低表面张力，稳定乳化液和增加泡沫等作用外，还具备一些表面活性剂所不具备的无毒、生物降解性和更强的表面和界面活性、对热的稳定性、对离子强度的稳定性、破乳性、在极端pH下也有效等优点。微生物表面活性剂的这些特点尤其适用于石油工业和环境工程。如石油的降解、提高原油的采收率、重油污染土壤的生物修复等。另外来源于微生物表面活性剂作为天然添加剂，在食品工业、精细化工、化妆品、纺织制造业、除污剂以及农业方面都有广泛的应用。

此外，Iturin A可以抑制部分细菌，但是却表现出强烈的抑制真菌作用，许多研究结果表明它可以抑制绝大多数的真菌和酵母。Iturin A是一种具有广谱抗真菌活性的抗菌多肽，可广泛用于防治各种作物、蔬菜和瓜果的真菌病害[1]，具有稳定性好、抑菌持久、不易产生抗药性和对环境安全等优点，因此Iturin A是一种极具研究开发价值和应用前景的新型生物农药。

但是，微生物发酵生产Iturin A仍处于实验室阶段。要实现大规模工业化生产，不仅要提高微生物发酵生产Iturin A的效价，而且怎样从发酵液中简便、有效的提取Iturin A，也是一个需要解决的重要问题。因为发酵液中的成份极其复杂，除了含有目标产物IturinA外，还含有颗粒极小浓度很高的菌体、部分大分子蛋白及未耗尽的培养基等杂质。不论是对发酵液中Iturin A进行浓缩，制成高浓度的母液，还是将Iturin A提取出来，菌体分离是从发酵液中提取Iturin A不可缺少的单元操作，直接影响IturinA提取的收率和质量，特别是对精制工序起着十分重要的作用。这是因为用传统的过滤除菌法效率低，而且劳动强度大，甚至出现过滤分离时，由于菌体直径小，且易与蛋白质、糖类等形成粘状滤饼阻塞过滤器，使过滤操作无法进行的情况。而使用离心的方法去除菌体与蛋白，尽管也能达到所需效果，但设备价格昂贵、操作运行复杂、投资大、能耗高、工厂生产成本高。

由于发酵液的絮凝过程简单，絮凝后固液分离的效果又往往比较好，因此发酵液的分离常常采用絮凝方法。例如，本杰明.R.克努森等发明的真菌胞外产物絮凝法(CN1902321A)，专利CN1916179A涉及的磁聚物絮凝预处理L-乳酸发酵液方法等。所报道和公开的絮凝方法主要涉及真菌发酵液的分离，细菌发酵液的絮凝方法较少，涉及的iturin的提取制备仅仅是直接与菌体混合提取(JP277873，CN1685056A，CN101143896A，CN1237346A)。此外，由于不同的发酵液的理化性质差异较大，要达到最佳的分离效果需要找到一种有效的絮凝剂和絮凝参数，尤其是分离具有生物活性的化合物。

发明内容

本发明人通过诱变获得一株高产Iturin A的高产菌株枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ZK-H6菌种，其已于2009年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.2897，并且成功进行了5升、50升和1000升发酵罐的发酵实验。本发明目的在于提出一种采用絮凝剂预处理Iturin A发酵液，从发酵液中浓缩和提取Iturin A的方法。

将能够产生Iturin A及其同系物的细菌在一级液体培养基中培养，作为种子液；将在上述第一级液体培养基中培养好的种子液接种到第二级液体培养基中培养，第二级液体培养基接种第一级种子液后在一定温度下培养一段时间，例如，在26℃-37℃发酵培养4-30小时。

发酵结束后，收集芽孢杆菌属细菌发酵液，加入50％-500％发酵液体积的水稀释，通过稀释有效降低发酵液的粘稠度，增加悬浮粒子之间的距离。为了达到絮凝剂与菌体及其它胶状体有效接触，改善絮凝效果，提高后面工序的过滤速率，同时考虑到降低后面提取与浓缩的工作量，较佳的加水量为100％-300％发酵液体积。稀释后加入絮凝剂，絮凝剂采用无机盐类和高分子聚合物类化合物，可以是阳离子、阴离子和非离子型絮凝剂。如硫酸锌、硫酸铵、硫酸铝、聚氯化铝、聚硫酸铁、聚氯化铝、尿素、明矾、明胶、海藻酸钠、阴离子聚丙烯酰胺、阳离子聚丙烯酰胺、聚乙二醇、壳聚糖，优选硫酸铝、聚氯化铝、聚硫酸铁、明矾、壳聚糖，絮凝剂用量在100mg/L-5000mg/L发酵液。优选硫酸铝、聚氯化铝、聚硫酸铁、明矾，用量为100mg/L-900mg/L发酵液。

根据絮凝剂的种类不同，要用盐酸溶液或氢氧化钠溶液对发酵液的pH调整在5-9的范围内。在絮凝的过程中，温度对絮凝剂的性质和作用等都有很大的影响，直接影响絮凝作用效果。此外，合适的搅拌时间，有利于加速絮凝过程，提高絮凝效果。搅拌时间过长，使能够沉淀的大胶体或微粒絮体搅碎，变成不能沉淀的小胶体或微粒絮体，降低絮凝效果。因此，发酵液的温度控制在20℃-50℃的范围内，搅拌时间控制在0.5分钟-10分钟。

本发明的具体实施方案是，采用已知的产生Iturin A及其同系物的芽孢杆菌属菌种，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、液化淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)菌株及上述菌株的遗传改良菌。将在上述第一级液体培养基中培养好的种子液接种到第二级液体培养基中培养，第二级液体培养基接种第一级种子液后在一定的温度下培养一段时间，例如，在26℃-37℃发酵培养4-30小时。收集发酵液，用100％-300％发酵液体积的水稀释，根据所使用絮凝剂的类型，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液对稀释后发酵液的pH值调至一定的范围(pH5-9)，稀释发酵液的温度控制在30℃-40℃的范围内，按照每升稀释发酵液加入500mg-900mg絮凝剂的量加入聚氯化铝或聚硫酸铁絮凝剂，搅拌时间为0.5分钟-2分钟，然后沉降1小时。

经过絮凝和沉降的发酵液，由于絮凝剂的作用，其中的细菌菌体、不溶性培养基、不溶性蛋白质、胶体和其它不溶性固形物，形成的较大的胶团、聚集颗粒等，可采用滤纸、滤布过滤去除，也可以通过离心方法或陶瓷膜微滤的方法去除。得到的过滤或离心清液，可采用超滤膜进一步去除剩余的一些大分子物质，然后用纳滤膜进行纳滤浓缩或直接减压浓缩，得到高浓度的Iturin A产品。

产品中Iturin A的浓度大小采用反相高压液相色谱分析方法，以sigma公司Iturin A标准品为标准进行分析测定。

本发明创新之处是：

1.提出一种采用絮凝剂预处理Iturin A发酵液，从发酵液中浓缩和提取Iturin A的方法，提出了一条适合规模化发酵生产Iturin A的工艺路线。

2.絮凝剂与细菌菌体、不溶大分子和其它不溶性固形物形成较密实的、体积较大的胶团、聚集颗粒的过程，不影响Iturin A的生物活性。

3.发酵液的后处理过程中，可以将形成的胶团、聚集颗粒与发酵液快速分离，能提高处理效率。

4.该工艺路线简单，成本经济，极大地提高了Iturin A在工业上和农业上推广应用的可能。

用具有能产Iturin A的芽孢杆菌属菌株发酵得发酵液，采用絮凝效果好，不影响Iturin A生物活性的絮凝剂进行絮凝处理，通过离心或过滤的方法去除形成的胶团、颗粒聚集物等，也可以采用陶瓷膜微滤的方法去除。得到的过滤或离心清液，用有机膜超滤进一步去除剩余的一些可溶性大分子物质，然后用纳滤膜进行纳滤浓缩或直接减压浓缩，然后添加稳定剂，得到高浓度的Iturin A产品。

具体实施方式

下面结合实施例对发明作进一步描述：

实施例1：

用250mL三角瓶3个，每瓶装100mL培养基A(葡萄糖2.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.5％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的能够产生Iturin A及其同系物的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZK-1菌种，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时，作为种子液。用1000mL三角瓶10个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖2.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.5％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，将菌种液按5％-10％的接种量接种，置于30℃温度下，摇瓶培养72小时-120小时，发酵PH6-8。

发酵结束后，取2.0L发酵液加入发酵液体积200％的水进行稀释，用15％的盐酸溶液调pH至6.0-9.0，按稀释发酵液的0.05％比例加入3000mg聚氯化铝絮凝剂，搅拌2分钟后静置1小时。用滤纸对絮凝后的发酵液进行过滤，除去胶团、颗粒聚集物等固形物。絮凝效果用过滤清液稀释50倍，用752型分光光度计以蒸馏水做空白于600nm处测OD值，絮凝前发酵液作为空白对照，计算絮凝率(FR)。FR＝(OD₁-OD₂)/OD₁×100％(OD₁：絮凝前发酵液600nm的OD值，OD₂：絮凝后发酵液600nm的OD值)。

过滤液用超滤膜进行超滤，除去一些可溶性的大分子化合物和剩余的固形物，用BUCHI真空旋转蒸发器对得到的超滤清液减压浓缩至0.2L。

采用高效液相色谱法检测Iturin A，所用条件：色谱柱C18 10.7φ×250mm；流动相为45％乙腈∶水∶10mM醋酸铵；流速1mL/min；检测波长280nm，以sigma公司Iturin A标准品为标准进行分析测定。经检测Iturin A的损失小于10％。

实施例2：

用250mL三角瓶3个，每瓶装100mL培养基A(葡萄糖2.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.5％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的能够产生Iturin A及其同系物的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZK-1菌种，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-10％的接种量接种于内装3L灭菌培养基B(培养基B：淀粉2.0％，乳糖1.0％，蔗糖1.0％，甘油0.5％，葡萄糖1.0％，蛋白胨1.0％，花生粉5.0％，黄豆粉水解液2.0％，生物氮素3.0％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.5％，硫酸铁0.5％)的5L发酵罐中。在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵72小时-120小时，发酵控制在PH 6-8。

发酵结束后，取2.0L发酵液加入发酵液体积100％的水进行稀释，用15％的盐酸溶液调p H至6.0-9.0，按稀释发酵液的0.05％比例加入2000mg聚氯化铝絮凝剂，搅拌2分钟后静置1小时。絮凝后的发酵液以6000rpm的速率离心20分钟，除去胶团、颗粒聚集物等固形物。絮凝效果用离心清液稀释50倍，用752型分光光度计以蒸馏水做空白于600nm处测OD值，絮凝前发酵液作为空白对照，计算絮凝率(FR)。FR＝(OD₁-OD₂)/OD₁×100％(OD₁：絮凝前发酵液600nm的OD值，OD₂：絮凝后发酵液600nm的OD值)。

实施例3：

用250mL三角瓶3个，每瓶装100mL培养基A(葡萄糖2.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.5％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的能够产生Iturin A及其同系物的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZK-1菌种，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时，作为种子液。用1000mL三角瓶10个，每瓶装300mL培养基A(葡萄糖2.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.5％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后将菌种液按5％-10％的接种量接种，置于30℃温度下，摇瓶培养72小时-120小时，发酵PH 6-8。

发酵结束后，取2.0L发酵液加入发酵液体积200％的水进行稀释，用15％的盐酸溶液调pH至6.0-9.0，按稀释发酵液的0.08％比例加入4800mg聚硫酸铁絮凝剂，搅拌1分钟后静置1小时。用滤纸对絮凝后的发酵液进行过滤，除去胶团、颗粒聚集物等固形物。絮凝效果用过滤清液稀释50倍，用752型分光光度计以蒸馏水做空白于600nm处测OD值，絮凝前发酵液作为空白对照，计算絮凝率(FR)。FR＝(OD₁-OD₂)/OD₁×100％(OD₁：絮凝前发酵液600nm的OD值，OD2：絮凝后发酵液600nm的OD值)。

过滤液用超滤膜进行超滤，除去一些可溶性的大分子化合物和剩余的固形物，用BUCHI真空旋转蒸发器对得到的超滤清液减压浓缩至0.1L。

实施例4：

用250mL三角瓶5个，每瓶装100mL培养基A(葡萄糖2.0％，蛋白胨3.0％，牛肉膏0.5％，硫酸镁0.35％，磷酸二氢钾0.3％)，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的能够产生Iturin A及其同系物的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ZK-1菌种，置于30℃温度下，摇瓶培养18小时。将培养好的菌种液按5％-10％的接种量接种于内装3L灭菌培养基B(培养基B：淀粉2.0％，乳糖1.0％，蔗糖1.0％，甘油0.5％，葡萄糖1.0％，蛋白胨1.0％，花生粉5.0％，黄豆粉水解液2.0％，生物氮素3.0％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.5％，硫酸铁0.5％)的5L发酵罐中。在28℃-30℃温度下，通气搅拌发酵72小时-120小时，发酵控制在PH 6-8。

发酵结束后，取2.0L发酵液加入发酵液体积100％的水进行稀释，用15％的盐酸溶液调pH至5.0-10.0，按稀释发酵液的0.08％比例加入2400mg聚硫酸铁絮凝剂，搅拌1分钟后静置1小时。絮凝后的发酵液以6000rpm的速率离心20分钟，，除去胶团、颗粒聚集物等固形物。絮凝效果用过滤清液稀释50倍，用752型分光光度计以蒸馏水做空白于600nm处测OD值，絮凝前发酵液作为空白对照，计算絮凝率(FR)。FR＝(OD₁-OD₂)/OD₁×100％(OD₁：絮凝前发酵液600nm的OD值，OD₂：絮凝后发酵液600nm的OD值)。

实施例5：

将植物病原菌疫霉菌C1、棉苗立枯病菌、水稻纹枯病菌、禾谷镰刀菌、辣椒炭疽病菌、灰霉菌和棉花枯萎病菌分别涂布于含PDA培养基的9cm平板上，正置1小时后加入牛津杯(10×8×6mm)，再将浓缩的iturin A产品稀释20倍后，每个牛津杯中滴加250ul，适宜温度培养4天，测量iturin A产品的抗菌抑菌活性。

下表是实验结果，iturin A产品对供测试的病原菌均有抑制作用，对疫霉菌C1的抑制作用最强，对棉花枯萎病菌的抑制作用较小。

指示菌株	抑菌圈直径*(mm)
		疫霉菌C1(Phytophthora sp.)	24.3
棉苗立枯病菌(Rhizoctonia solani KChn)	22.2
		水稻纹枯病菌(Thanatephorus cucumerisDonk)	20.2
禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum schw.)	17.8
		辣椒炭疽病菌(Colletotrichum gossypii Southw)	16.8
灰霉菌(Botrytis cinerea)	14.2
		棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum)	12.6

Claims

1.一种伊枯草菌素A的制备方法，其特征是：先用絮凝剂处理发酵液，再从发酵液中浓缩和提取伊枯草菌素A。

2.一种伊枯草菌素A的制备方法，其特征是：将依枯草菌素A的产生菌定向培养，得到发酵液，稀释发酵液后，调整pH值和温度，加入絮凝剂，搅拌絮凝，沉降，过滤或离心，超滤，浓缩，获得伊枯草菌素A。

3.根据权利要求2所述的一种伊枯草菌素A的制备方法，其特征是：所述的产生菌选自芽孢杆菌属。

4.根据权利要求2所述的一种伊枯草菌素A的制备方法，其特征是：发酵液的稀释是用水稀释，稀释倍数是50％-500％发酵液体积，最佳为100％-300％。

5.根据权利要求1或2所述的一种伊枯草菌素A的制备方法，其特征是：所述的絮凝剂为硫酸锌、硫酸铵、硫酸铝、聚氯化铝、聚硫酸铁、聚氯化铝、尿素、明矾、明胶、海藻酸钠、阴离子聚丙烯酰胺、阳离子聚丙烯酰胺、聚乙二醇、壳聚糖，优选硫酸铝、聚氯化铝、聚硫酸铁、明矾、壳聚糖。

6.根据权利要求5所述的一种伊枯草菌素A的制备方法，其特征是：絮凝剂的添加量为每升稀释发酵液中加入100mg-5000mg絮凝剂。

7.根据权利要求1或2所述的一种伊枯草菌素A的制备方法，其特征是：所述的絮凝剂为硫酸铝、聚氯化铝、聚硫酸铁、明矾，用量为100mg/L-900mg/L稀释发酵液。

8.根据权利要求6所述的一种伊枯草菌素A的制备方法，其特征是：絮凝剂配制成水溶液后加入稀释发酵液。

9.根据权利要求7所述的一种伊枯草菌素A的制备方法，其特征是：絮凝剂配制成水溶液后加入稀释发酵液。

10.根据权利要求2所述的一种伊枯草菌素A的制备方法，其特征是：调整稀释发酵液的pH值为5-9，温度为20℃-50℃，搅拌时间为0.5-10分钟。