CN109294959A - 一种从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法，属于微生物后处理技术领域。本发明首先将芽孢杆菌发酵液pH值调整至合适范围，然后加入天然安全无毒絮凝剂和促凝剂溶液，充分搅拌使絮凝剂与发酵液中细胞结合并絮凝成团，静置一段时间后移去上层清液，回收下层富含细菌的絮团沉积液。通过这种絮凝沉积方法，可使芽孢杆菌发酵液浓缩至原体积1/5～1/9，细菌回收率达90％以上，最高可达97％。本发明通过往发酵液中添加絮凝剂方式使发酵液中芽孢杆菌细胞絮凝成团并快速沉降浓缩，可从发酵液中快速回收高浓度菌体，该方法可减少传统喷雾干燥工艺蒸发量，可大大减少设备投资，节省后处理时间，降低生产成本。

Description

一种从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法
技术领域
本发明属于微生物后处理技术领域，具体涉及一种从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法。
背景技术
芽孢杆菌属是大的(4～10μm)，革兰氏阳性，严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。芽孢杆菌具有丰富的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、脱氢酶、脱羧酶、氧化酶等，能强烈的分解碳系污染物，分解蛋白质和复杂多糖，对水溶性有机物分解也有重要的作用。目前在工农业上应用较多的芽孢杆菌有：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌等。枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研诸领域。
目前生产芽孢杆菌发酵方式有固态发酵和液态发酵两种方式，由于固态发酵芽孢杆菌容易污染杂菌，产品质量不稳定，而液态发酵易扩大生产规模，生产过程中液体输送方便，易于机械化操作，是非常适合工业化大规模生产的发酵工艺。微生态制剂的剂型主要有两类，固体剂型和液体剂型，其中，液体剂型存在活菌数下降快、贮藏期短、携带运输不便、容易污染等缺点。固体剂型则以其活菌数高、便于携带、实用性强、使用方便、保质期长等优点已成为微生态制剂领域应用较广的剂型。固体剂型的加工工艺很多，主要有热力干燥法(如喷雾干燥，沸腾干燥等)、真空冷冻干燥法和固定化细胞技术等。目前，通过液体发酵生产芽孢杆菌多采用喷雾干燥方式进行干燥。采用喷雾干燥法直接处理发酵液，存在设备投入成本高、能耗大、耗时长等缺点。发酵液在喷雾干燥前若能对发酵液中细胞进行浓缩预处理，则可大大减少待干燥细胞液处理量，即可降低设备投资成本，降低能耗和节省后处理时间。
絮凝技术由于具有低成本、操作简单、能提高固液分离速度等一系列特点，逐渐成为微生物产品分离研究的热点。壳聚糖和海藻酸钠都属于天然高分子聚合物，具有无毒、无害、无副作用及良好的生物相容性且可生物降解等特点，也常被用作为益生菌微型胶囊化的壁材。壳聚糖能够吸附发酵液中的胶体颗粒并引起桥架作用，形成较大的絮团。壳聚糖对一些细菌发酵液具有很好的絮凝效果，能使菌体细胞絮凝成团。海藻酸钠也是一种典型的多糖絮凝剂，由于其成本低、无毒副作用、脱水性能好，已广泛被用于水处理行业。
发明内容
为了克服现有芽孢杆菌发酵液中后处理工艺的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法。
本发明旨在提供一种通过絮凝沉积方式从芽孢杆菌发酵液中快速浓缩细胞方法，摒弃芽孢杆菌工业生产过程中直接喷雾干燥、离心或过滤等工艺流程，可大大减少设备投资，减少菌体回收环节处理时间，降低生产成本。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法，是通过往芽孢杆菌发酵液添加絮凝剂和促凝剂使细胞快速絮凝成团沉积；
包括如下步骤：
首先用酸性溶液调节芽孢杆菌发酵液pH值至5.0～7.0，再往调整好pH值的芽孢杆菌发酵液中加入20ml/L～60ml/L壳聚糖溶液，采用较快速度搅拌2～3min，搅拌转速120～150rpm，使壳聚糖与发酵液充分混合均匀，之后加入10ml/L～40ml/L海藻酸钠溶液，缓慢搅拌，使菌体与壳聚糖絮凝成团，静置沉降包含菌体的絮团，收集底层富含芽孢杆菌菌体浓缩液。
所述的壳聚糖为脱乙酰度不低于85％的产品。
所述的壳聚糖溶液的浓度为1％～2％，优选为1.5％。
所述的海藻酸钠溶液的浓度为0.5％～2.0％，优选为1.0％。
所述的酸性溶液液可是浓HCl溶液，也可是硫酸溶液。
优选的，用酸性溶液调节芽孢杆菌发酵液pH值至6.0～7.0，更优选为6.0～6.5。
所述的芽孢杆菌为芽孢杆菌属下的各个种及其亚种，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)等。
优选的，所述的壳聚糖添溶液的添加量为40ml/L，所述的海藻酸钠溶液的添加量为20ml/L。
所述的壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液添加顺序为先添加壳聚糖溶液与发酵液充分搅拌混合均匀生成絮状小颗粒，之后再加入海藻酸钠溶液缓慢搅拌形成块状絮团，搅拌转速以50～60rpm为宜。
所述的缓慢搅拌的时间为2～5min，优选为2min。
所述的静置的时间为15～30min，优选15min。
优选的，所述的收集底层富含芽孢杆菌菌体浓缩液，是待包裹细菌的絮团沉降后，直接从上层移去清液，回收下层的菌体溶液，作进一步处理；或者从底层放出菌体悬浊液，将悬浊液再静置沉淀10～30min(优选为10min)后吸走上层清液，收集下层沉积菌体。
具体包括如下步骤：
(1)配制絮凝剂和促凝剂
所述的絮凝剂为壳聚糖溶液，所述的壳聚糖溶液配制方法如下：称取一定质量的壳聚糖，用1％的乙酸溶液溶解，115℃灭菌20min。壳聚糖溶液浓度为1％～2％为宜，优选浓度为1.5％。
所述的促凝剂为海藻酸钠溶液，所述的海藻酸钠溶液配制方法如下：称取一定量的海藻酸钠，溶于一定体积的蒸馏水中，充分搅拌溶解，用0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.6，115℃灭菌20min。海藻酸钠溶液浓度为0.5％～2.0％为宜，优选浓度为1.0％。
(2)调节发酵液pH值
用酸性溶液调节芽孢杆菌发酵液pH值至5.0～7.0，优选pH值为6.0～6.5。
(3)絮凝剂和促凝剂添加
往上述调整pH值的发酵液中加入20ml/L～60ml/L壳聚糖溶液，采用较快速度搅拌2～3min，搅拌转速120～150rpm，使壳聚糖与发酵液充分混合均匀，之后加入10ml/L～40ml/L海藻酸钠溶液，缓慢搅拌2～5min(优选为2min)，使菌体与絮凝剂絮凝成团，静置15～30min(优选为15min)使菌体沉积到容器底部。
(4)收集菌体
待包裹细菌的絮团沉降后，直接从上层移去清液，收集下层沉积的菌体，作进一步处理；或者从底层放出菌体悬浊液，将悬浊液再静置沉淀10～30min(优选为10min)后吸走上层清液，收集下层沉降菌体。
(5)指标检测
发酵液絮凝沉淀15min后，吸取上清液并测定其体积，采用LB平板活菌计数法测定上清液中残留细菌数量，以未处理的发酵原液作为对照，计算细胞回收率。
步骤(1)中所述的壳聚糖为脱乙酰度不低于85％的产品。
步骤(2)中所述的酸性溶液可是HCl溶液，也可是硫酸溶液。
步骤(2)中所述的芽孢杆菌为芽孢杆菌属下的各个种及其亚种，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌等。
步骤(3)中所述的絮凝剂壳聚糖溶液的添加量为20ml/L～60ml/L，优选添加量为40ml/L，促凝剂海藻酸钠溶液的添加量为10ml/L～40ml/L，优选添加量为20ml/L。
步骤(3)中絮凝剂和促凝剂添加顺序为先添加絮凝剂与发酵液充分搅拌混合均匀生成絮状小颗粒，之后再加入促凝剂缓慢搅拌形成块状絮团，搅拌转速以50～60rpm为宜。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首先将芽孢杆菌发酵液pH值调整至合适范围，然后加入天然安全无毒絮凝剂和促凝剂溶液，充分搅拌使絮凝剂与发酵液中细胞结合并絮凝成团，静置一段时间后移去上层清液，回收下层富含细菌的絮团沉积液。通过这种絮凝沉积方法，可使芽孢杆菌发酵液浓缩至原体积1/5～1/9，细菌回收率达90％以上，最高可达97％。
(2)本发明通过往发酵液中添加絮凝剂方式使发酵液中芽孢杆菌细胞絮凝成团并快速沉降浓缩，可从发酵液中快速回收高浓度菌体，该方法可减少传统喷雾干燥工艺蒸发量，可大大减少设备投资，节省后处理时间，降低生产成本。
附图说明
图1是不同pH条件下枯草芽孢杆菌的絮凝效果图；其中，左边是对照组(未添加絮凝剂和促凝剂)；中间为pH6.5条件下絮凝效果；右边为pH7.0条件下絮凝效果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ACCC11089，地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC12759。
本发明在不同pH条件下，枯草芽孢杆菌的絮凝效果图如图1所示。
实施例1
取枯草芽孢杆菌发酵液(pH7.02)100mL，往发酵液中加入4mL浓度为1.5％壳聚糖溶液，充分搅拌使壳聚糖与乳杆菌混合均匀，之后加入2mL浓度为1.0％海藻酸钠溶液，缓慢搅拌使菌体缓慢成团，静置15min，移去上清液并采用LB平板进行活菌计算，收集下层絮团沉积液。
经检测分析，枯草芽孢杆菌发酵液中细菌数为2.2×109cfu/mL，上清液中残留细菌数为2×108cfu/mL，细菌沉积率达90.9％。絮团沉积液体积为21mL，浓缩液体积约为原发酵液的1/5。
实施例2
取枯草芽孢杆菌发酵液(pH6.5)500mL，往发酵液中加入20mL浓度为1.5％壳聚糖溶液，快速搅拌使壳聚糖与乳杆菌充分混合均匀，之后加入10mL浓度为1.0％海藻酸钠溶液，缓慢搅拌使菌体缓慢成团，静置15min，移去上清液并进行活菌计数，收集下层絮团沉积液。
经检测分析，枯草芽孢杆菌发酵液中细菌数为2.2×109cfu/mL，上清液中残留细菌数为1.3×108cfu/mL，细菌沉降率达94.1％。絮团沉积液体积约为70mL，浓缩液体积约为原发酵液的1/7。
实施例3
取枯草芽孢杆菌发酵液(pH6.0)1000mL，往发酵液中加入40mL浓度为1.5％壳聚糖溶液，快速搅拌使壳聚糖与乳杆菌充分混合均匀，之后加入20mL浓度为1.0％海藻酸钠溶液，缓慢搅拌使菌体缓慢成团，静置15min，移去上清液并进行活菌计数，收集下层絮团沉积液。
经检测分析，枯草芽孢杆菌发酵液中细菌数为2.2×109cfu/mL，上清液中残留细菌数为6.6×107cfu/mL，细菌沉降率达97％。絮团沉积液体积约为110mL，浓缩液体积约为原发酵液的1/9。
实施例4
取地衣芽孢杆菌发酵液(pH6.5)1000mL，往发酵液中加入40mL浓度为1.5％壳聚糖溶液，快速搅拌使壳聚糖与乳杆菌充分混合均匀，之后加入20mL浓度为1.0％海藻酸钠溶液，缓慢搅拌使菌体缓慢成团，静置15min，移去上清液并进行活菌计数，收集下层絮团沉积液。
经检测分析，地衣芽孢杆菌发酵液中细菌数为1.8×109cfu/mL，上清液中残留细菌数为1.2×108cfu/mL，细菌沉降率达93.3％。絮团沉积液体积约为72mL，浓缩液体积约为原发酵液的1/7。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法，其特征在于是通过往芽孢杆菌发酵液添加絮凝剂和促凝剂使细胞快速絮凝成团沉积；
包括如下步骤：
首先用酸性溶液调节芽孢杆菌发酵液pH值至5.0～7.0，再往调整好pH值的芽孢杆菌发酵液中加入20ml/L～60ml/L壳聚糖溶液，采用较快速度搅拌2～3min，搅拌转速120～150rpm，使壳聚糖与发酵液充分混合均匀，之后加入10ml/L～40ml/L海藻酸钠溶液，缓慢搅拌，使菌体与壳聚糖絮凝成团，静置沉降包含菌体的絮团，收集底层富含芽孢杆菌菌体浓缩液。
2.根据权利要求1所述的从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法，其特征在于：所述的壳聚糖溶液的浓度为1％～2％。
3.根据权利要求1所述的从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法，其特征在于：所述的海藻酸钠溶液的浓度为0.5％～2.0％。
4.根据权利要求1所述的从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法，其特征在于：用酸性溶液调节芽孢杆菌发酵液pH值至6.0～7.0。
5.根据权利要求1所述的从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法，其特征在于：所述的芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、侧孢芽孢杆菌(Bacilluslaterosporus)。
6.根据权利要求1所述的从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法，其特征在于：所述的壳聚糖添溶液的添加量为40ml/L，所述的海藻酸钠溶液的添加量为20ml/L。
7.根据权利要求1所述的从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法，其特征在于：
所述的壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液添加顺序为先添加壳聚糖溶液与发酵液充分搅拌混合均匀生成絮状小颗粒，之后再加入海藻酸钠溶液缓慢搅拌形成块状絮团，搅拌转速以50～60rpm为宜。
8.根据权利要求1或7所述的从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法，其特征在于：所述的缓慢搅拌的时间为2～5min。
9.根据权利要求1所述的从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法，其特征在于：所述的静置的时间为15～30min。
10.根据权利要求1所述的从芽孢杆菌发酵液中快速回收芽孢杆菌细胞的方法，其特征在于：
所述的收集底层富含芽孢杆菌菌体浓缩液，是待包裹细菌的絮团沉降后，直接从上层移去清液，回收下层的菌体溶液，作进一步处理；或者从底层放出菌体悬浊液，将悬浊液再静置沉淀10～30min后吸走上层清液，收集下层沉积菌体。
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