CN103555637B - 一株反硝化细菌及其培养条件 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一株反硝化细菌及其培养条件,属于环境微生物领域。经鉴定,该反硝化细菌为黄色海假单胞菌Pseudomonas xanthomarina,命名为DN1,现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No. 7650。经初步优化,该菌株的培养基为:丁二酸钠6-8 g/L、酵母粉6-10 g/L、硝酸钠0.67 g/L、磷酸二氢钾1.36 g/L、硫酸铵0.24 g/L、硫酸镁0.2 g/L,摇床培养条件为:pH 5.0,30℃,200 rpm。上述条件下所得菌体,在NO3 -浓度为10 mmol/L的水体中,作用72h,脱氮率达到90%以上。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域,具体涉及一株反硝化细菌及其培养方法,以及其反硝化能力。
背景技术
水体富营养化是现今我国水环境面临的重大问题,严重地阻碍着我国国民经济的发展。废水处理过程中的脱氮处理越来越显示其重要地位。在现代水产养殖业中,由于养殖动物排泄和饵料过剩等原因造成水体中氨氮、亚硝酸盐等的含量严重超标,水质恶化,进而导致病害频发,并严重影响了水产养殖业的健康可持续发展。相对于物理化学脱氮方法,生物脱氮已经成为废水中去除氮素污染的最有效的方法之一,而微生物的反硝化作用正是改善水质,特别是降低水体中亚硝酸盐浓度的有效手段之一。
本发明的目的在于提供一株反硝化细菌及其培养条件,并初步研究其反硝化能力,可应用于水体的净化工艺。
发明内容
反硝化细菌的筛选、鉴定与培养条件优化方法如下:
(1)平板初筛及反硝化能力初步鉴定:从江南大学湖边采集土壤样品,制备土壤悬液,涂布于DM固体平板,于30℃恒温培养至长出明显菌落,用接种环逐个挑取形态各异的菌落至新的DM固体平板,划线分离出单菌落。选取分离后的单菌落,点种于BTB平板上,挑取有蓝色变色圈的阳性菌株即为反硝化细菌。
(2)摇瓶复筛与脱氮能力测定:初筛得到的菌株经摇瓶发酵,测定其脱氮能力。经复筛,3号菌总氮去除率最高,达78%。
(3)菌株16S rDNA鉴定:提取总DNA,用细菌16S rDNA通用引物扩增,得到的基因序列为1500 bp,经测序比对,为黄色海假单胞菌(Pseudomonas xanthomarina),命名为DN1,于2013年5月29日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No. 7650。
(4)菌株发酵条件初步优化:利用单因素实验对菌株的发酵培养基及发酵条件进行优化,得到最适培养基配方为丁二酸钠6-8 g/L、酵母粉6-10 g/L、硝酸钠0.67 g/L、磷酸二氢钾1.36 g/L、硫酸铵0.24 g/L、硫酸镁0.2 g/L,摇床培养条件为:pH 5.0,30℃,200 rpm,该条件下发酵14h,OD600达7.29,约3×108 cfu/ml。
(5)反硝化能力测定:在NaNO3浓度为10 mmol/L的水体中,添加丁二酸钠4 g/L,按1%的量接入上述菌液,72h后检测水样中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮含量(以不投加菌体的水样作为对照),计算脱氮率达到90%以上。
其中步骤(1)中所述的DM培养基为(g/L):丁二酸钠 4.72,NaNO3 0.67,KH2PO4 1.50,Na2HPO4 0.42,MgSO4·7H2O 1.00,微量元素溶液 2 ml,pH调至7.2,固体培养基添加2%琼脂;BTB平板培养基为(g/L):FeCl3·H2O 0.5,琥珀酸钠8.5,BTB 1 ml(1%溶于酒精),KNO3 1.00,KH2PO4 1.00,CaCl2·2H2O 0.2,MgSO4·7H2O 1.00,pH调至7.0-7.3。
本发明所述的Pseudomonas xanthomarina DN1为反硝化细菌,可广泛应用于各种富营养化水体的净化。
具体实施方式
实施例1 反硝化细菌的筛选与鉴定
1、培养基配方
LB培养基(g/L):胰蛋白胨1,酵母提取物0.5,氯化钠1,pH 7.0~7.2。需要时使用前加入100 μg /ml 氨苄青霉素,固体培养基添加2%琼脂,用于大肠杆菌的培养。
DM培养基(g/L):丁二酸钠 4.72,NaNO3 0.67,KH2PO4 1.50,Na2HPO4 0.42,MgSO4·7H2O 1.00,微量元素溶液 2 ml,pH调至7.2,固体培养基添加2%琼脂。
微量元素溶液(g/L):CuSO·5H2O 4.00,FeSO4·7H2O 0.7,FeCl3·6H2O,CoCl2·6H2O,Na2MO4·2H2O 3.40,CaCl2·2H2O 2.00。
SM培养基(g/L):丁二酸钠3,NaNO3 0.67,KH2PO4 1.36,酵母粉1,MgSO4·7H2O 1.00,pH调至7.2,固体培养基添加2%琼脂。
BTB平板(g/L):FeCl3·H2O 0.5,琥珀酸钠8.5,BTB 1 ml(1%溶于酒精),KNO3 1.00,KH2PO4 1.00,CaCl2·2H2O 0.2,MgSO4·7H2O 1.00,pH调至7.0-7.3。
2、平板初筛及反硝化能力初步鉴定
从江南大学湖边采集土壤样品,称取10g置于250 ml三角瓶中,加100 ml无菌水及几粒玻璃珠,摇床振荡1 5 min使土样分散均匀。待土样分散后,静置5 min后,吸取l ml土壤悬液至9 ml稀释液(无菌水),得到10-2稀释度悬液,依次按l0倍稀释法稀释至l0-7,由此制得各稀释度土壤悬液。分别吸取各稀释度悬液0.1 ml至DM固体平板(放置过夜,无杂菌生长),于30℃恒温培养至长出明显菌落,用接种环逐个挑取形态各异的菌落至新的DM固体平板,划线分离出单菌落。
选取分离后的单菌落,点种于BTB平板上,BTB在酸性条件是黄绿色的,当反硝化细菌消耗了硝酸根,pH上升,BTB会变蓝,初筛得到3株反硝化细菌。
3、摇瓶复筛与脱氮能力测定
初筛得到的菌株经摇瓶发酵,测定其脱氮能力。通过测定滤液中的NO3 --N和NO2 --N浓度变化,可以反映各菌株的硝酸盐还原能力和实际脱氮能力。NO3 --N的去除率,可以表明菌株的硝酸盐还原能力,而不考虑硝酸盐还原产物类型的差异(不论终产物是亚硝酸盐或气态产物);NOx --N(NOx --N =NO3 --N+NO2 --N,亦称总氧化氮TON)的去除率,可以近似表明菌株的脱氮能力。NO3 --N和NO2 --N浓度测定采用国标方法。
经复筛,3号菌总氮去除率最高,达78%。
4、16S rDNA鉴定
提取总DNA,用细菌16S rDNA通用引物扩增,得到的基因序列为1500 bp,经测序比对,与黄色海假单胞菌的16S rDNA序列同源性高达99%,初步判断其为黄色海假单胞菌(Pseudomonas xanthomarina),命名为DN1。
实施例2 菌株发酵条件初步优化及反硝化能力测定
利用单因素实验对菌株的发酵培养基及发酵条件进行优化,得到最适培养基配方为丁二酸钠6-8 g/L、酵母粉6-10 g/L、硝酸钠0.67 g/L、磷酸二氢钾1.36 g/L、硫酸铵0.24 g/L、硫酸镁0.2 g/L,摇床培养条件为:pH 5.0,30℃,200 rpm,该条件下发酵14h,OD600达7.29,约3×108 cfu/ml。
在NaNO3浓度为10 mmol/L的水体中,添加丁二酸钠4 g/L,按1%的量接入上述菌液,72h后检测水样中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮含量(以不投加菌体的水样作为对照),计算脱氮率达到90%以上。
Claims (3)
1.一株反硝化细菌DN1,分类命名为黄色海假单胞菌Pseudomonas xanthomarina,现保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No. 7650,保藏日期为2013年5月29日。
2.权利要求1所述菌株的培养方法,其培养基为:丁二酸钠6-8 g/L、酵母粉6-10 g/L、硝酸钠0.67 g/L、磷酸二氢钾1.36 g/L、硫酸铵0.24 g/L、硫酸镁0.2 g/L,摇床培养条件为:pH 5.0,30℃,200 rpm。
3.利用权利要求2所述的培养方法得到的菌液在水体脱氮中的应用方法:在NO3 -浓度为10 mmol/L的水体中,作用72h,脱氮率达到90%以上。
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