CN107177530B - 一种新的生活污水高效脱氮菌及其应用 - Google Patents

一种新的生活污水高效脱氮菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物环保技术领域，具体涉及一种新的生活污水高效脱氮菌及其应用。所述脱氮菌分类命名为假单胞菌Pseudomonas sp.，为新种，于2016年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.13454。本发明新型高效脱氮菌可直接应用于农村生活污水治理中，具有较好的脱氮效果。通过投加该菌，可有效提高对农村生活污水中氮的去除效率。

Description

一种新的生活污水高效脱氮菌及其应用
技术领域
本发明属于生物环保技术领域，具体涉及一种新的生活污水高效脱氮菌及其应用。
背景技术
中国目前有行政村60多万个，村庄人口有7.6亿，其中96％村庄缺乏污水处理系统。农村污水基数大，但受农村经济发展水平和生产、生活方式等发展水平影响，不同地区农村的污水排放特征差别很大。目前城镇污水处理厂采用的技术和运行模式不适合用于农村分散型污水的处理。随着国家对农村开发力度加大，诸如农家乐、村办企业和养殖企业等不断增多，农村污水类型不断增加，污水中含盐量、氮磷等含量不断升高，加之化肥和农药的使用，这增加了污水治理难度。污水无序排放造成地表水、地下水的污染，水库、池塘和河道等水体变黑，富营养化严重，恶臭污染大气，严重影响居住环境和身心健康。加之，农村地区经济较为落后，高耗能、较高费用的技术很难推广应用。当前，必需寻找一种成本较低、无二次污染、应用范围广和适应性强的技术，且适合在中国农村地区推广应用。微生物脱氮法与物理、化学法相比较,以它高效率、低成本、无二次污染等不可比拟的优点已被人们所认可。本发明新型高效脱氮菌可直接应用于农村生活污水治理中，具有较好的脱氮效果。通过投加该菌，可有效提高对农村生活污水中氮的去除效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的生活污水高效脱氮菌及其应用。所述生活污水高效脱氮菌是从天津生活污水中分离筛选得到的，该菌可以应用在污水处理中，特别是农村生活污水处理中。
本发明提供的生活污水高效脱氮菌，该菌分类命名为：假单胞菌Pseudomonassp.，为新种，于2016年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为：CGMCC No.13454。
优选地，所述生活污水高效脱氮菌菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示，其长度为1498bp。
优选地，所述生活污水高效脱氮菌菌株具有以下表型特征：在30～37℃下，琼脂培养基上培养24～72h后，菌落白色，半透明，圆形，表现光滑，边缘整齐；菌体短杆状，0.4×0.8μm～2.0μm，单个或成对排列，革兰氏阴性；其生长的温度为15～42℃，NaCl浓度为0％～4％，pH为6～11。
优选地，所述生活污水高效脱氮菌菌株与序列相似的模式菌株进行DAN-DNA杂交，同源性低于40％。
具体地，所述序列相似的模式菌株为：Pseudomonas alcaliphila AL15-21T、Pseudomonas toyotomiensis HT-3T和Pseudomonas chengduensis MBRT。
优选地，所述生活污水高效脱氮菌具有硝化反硝化功能。
所述生活污水高效脱氮菌菌株经鉴定为假单胞菌属新种，故分类命名为：假单胞菌Pseudomonas sp.。
优选地，所述生活污水高效脱氮菌去除氨氮效果为起始氨氮浓度小于500mg/L。
更优选地，所述生活污水高效脱氮菌去除氨氮效果为起始氨氮浓度小于100mg/L。此时，脱氮率可达到95％以上。
本发明提供上述脱氮菌在生活污水净化中的应用。
特别地，所述污水为农村生活污水。
本发明的生活污水高效脱氮菌为筛选自农村生活污水中的土著微生物，将其用于含盐量高的农村生活污水中，其经济效益可观，将会大大节约污水处理成本，也不需要考虑菌种的安全性，适合在我国聚集地较为分散的农村地区使用。本发明生活污水高效脱氮菌具有良好的脱氮效果，通过投加该菌，可有效提高土著微生物对农村生活污水中氮的去除效率。本发明新型高效脱氮菌可直接应用于农村生活污水治理中，具有较好的脱氮效果。通过投加该菌，可有效提高对农村生活污水中氮的去除效率。
保藏说明
菌种名称：生活污水高效脱氮菌
分类命名：假单胞菌Pseudomonas sp.
菌株编号：68
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2016年12月15日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.13454
附图说明
图1为本发明生活污水高效脱氮菌菌株菌体形态电镜照片。
图2为本发明生活污水高效脱氮菌菌株菌落形态照片。
图3为本发明生活污水高效脱氮菌菌株与相关种的16S rDNA序列发育树。
图4为本发明生活污水高效脱氮菌菌株脱氮效果。
具体实施方式
实施例1本发明生活污水高效脱氮菌菌株的分离鉴定：
(1)培养基：
①硝化脱氮培养基：硫酸铵0.48g，琥珀酸4.71g，微量元素溶液50mL，溶解后用蒸馏水定容至1L，pH控制在7.0～7.2。(固体培养基，加入2％琼脂)
所述微量元素溶液：K2HPO4·3H2O 6.5g，MgSO4·7H2O 2.5g，NaCl 2.5g，FeSO4·7H2O 0.05g，MnSO4·H2O 0.04g，溶解后用蒸馏水定容至1L；
②反硝化脱氮培养基：好氧反硝化培养基：KNO3 0.36g，Na2HPO4·7H2O 7.9g，KH2PO4 1.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，琥珀酸钠2.81g，微量元素溶液2mL，溶解后用蒸馏水定容至1L，pH7.0～7.5。微量元素溶液：EDTA 50.0g，ZnSO4 2.2g，CaCl2 5.5g，MnCl2·4H2O5.06g，FeSO4·7H2O 5.0g，CuSO4·5H2O 1.57g，CoCl2·6H2O 1.61g，溶解后用蒸馏水定容至1L，pH7.0。
(2)硝化菌株的分离筛选
用无菌移液管取10mL天津生活污水，置于容量为250mL的三角瓶(其中含有100mL无菌脱氮培养基)中，摇床富集培养，培养条件为30℃，转速160rpm，每一代培养三天。采用二苯胺试剂检测氨氧化菌的存在。
采用极限稀释的方法将含有硝酸菌的培养液进行平板涂布，37℃恒温培养箱中培养48h后，选取单一菌落进行多次平板分区划线。在显微镜下观察无杂菌时，菌株纯化结束。
将纯化好的10％的菌株接种于100mL新鲜液体硝化培养基中，30℃、120rpm摇床培养48h后，测定氨氮去除率，选取氨氮去除率高于85％的菌株作为选到的硝化脱氮菌。
(3)反硝化菌株的筛选
将10％的接种量接种于100mL新鲜液体反硝化培养基中，30℃、120rpm摇床培养48h后，测定硝酸盐氮去除率，选取去除率高于90％的菌株作为选到的反硝化脱氮菌。
图1为本发明生活污水高效脱氮菌菌株菌体形态电镜照片。图2为本发明生活污水高效脱氮菌菌株菌落形态照片。由图1和图2可见，所述菌株具有以下表型特征：在30～37℃下，琼脂培养基上培养24～72h后，菌落白色，半透明，圆形，表现光滑，边缘整齐；菌体短杆状，0.4×0.8μm～2.0μm，单个或成对排列，革兰氏阴性；其生长的温度为15～42℃，NaCl浓度为0％～4％，pH为6～11。
(4)16S rDNA序列分析与系统发育分析
通过16S rDNA的PCR扩增与测序，得到16S rDNA基因序列长度为1498bp(参见SEQID NO:1)。提交Genbank进行比对，发现本发明生活污水高效脱氮菌属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)。采用MEGA 5.0软件，邻位连接法显示该菌株与相关种的16S rDNA序列发育树，进行1000次的相似度重复计算，图3中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值(参见图3。图3为本发明菌株与相关种的16S rDNA序列发育树)。
(5)微生物菌种DAN-DNA杂交
本发明生活污水高效脱氮菌与序列相似的模式菌株进行DAN-DNA杂交，同源性低于40％。具体地，本发明生活污水高效脱氮菌与Pseudomonas alcaliphila AL15-21T的杂交同源性为35.4％，本发明生活污水高效脱氮菌与Pseudomonas toyotomiensis HT-3T的杂交同源性为33.3％，本发明生活污水高效脱氮菌与Pseudomonas chengduensis MBRT的杂交同源性35.4％。
实施例2脱氮效果实验
将本发明生活污水高效脱氮菌菌株接种于100mL不同氮含量的脱氮培养基中，起始氨氮浓度分别为50mg/L，未接菌种的培养基为空白对照，37℃，转速为160rpm，摇床培养箱培养30h。取培养液分别在10000rpm下离心6分钟，经过0.45μm的滤膜过滤，测定培养液中的氨氮(ammonia nitrogen)、硝氮(nitrate nitrogen)、亚硝酸盐氮(nitrite nitrogen)、以及总氮(total nitrogen)的含量。具体测定结果见图4。图4为本发明生活污水高效脱氮菌菌株脱氮效果。
由图4可以看出，起始氨氮浓度为50mg/L,去除率可以达到100％。且亚硝酸氮累计均较少，说明本发明菌株具有较好的硝化反硝化功能。起始氨氮浓度小于500mg/L的范围均可发挥脱氮功能，且起始氨氮浓度小于100mg/L时，效果最佳。
实施例3农村生活污水降解实验
将本发明生活污水高效脱氮菌菌液直接投加到格栅过滤后的的实际农村生活污水中，接种量为10％体积。培养温度为30℃，搅拌速度为180rpm。结果：处理3天后，水体中总氮的去除率可达到80％。
SEQUENCE LISTING
<110> 农业部环境保护科研监测所
<120> 一种新的生活污水高效脱氮菌及其应用
<130> Y161366-OI
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1498
<212> DNA
<213> 假单胞菌（Pseudomonas sp.）
<400> 1
agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60
ggatgagagg agcttgctcc ttgatttatc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct 120
gcctagtggt gggggataac gttccgaaag gaacgctaat accgcatacg tcctacggga 180
gaaagcgggg gatcttcgga cctcgcgcca ttagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt 240
ggtgaggtaa aggctcacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca 300
cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 360
atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttcg gattgtaaag 420
cactttaagt tgggaggaag ggtattcacc taatacgtga gtattttgac gttaccgaca 480
gaataagcac cggctaactt cgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggt gcaagcgtta 540
atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggttcgt taagttggat gtgaaagccc 600
cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac tggcgagcta gagtacggta gagggtggtg 660
gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg 720
accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 780
accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc aactagccgt tggaatcctt gagattttag 840
tggcgcagct aacgcattaa gttgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca 900
aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960
aagaacctta cctggccttg acatgctgag aactttccag agatggattg gtgccttcgg 1020
gaactcagac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080
gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gtcaccagca cgttatggtg ggcactctaa 1140
ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt 1200
acggccaggg ctacacacgt gctacaatgg tcggtacaaa gggttgccaa gccgcgaggt 1260
ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320
agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga atgtcacggt gaatacgttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgctccag aagtagctag tctaaccttc 1440
ggggggacgg ttaccacgga gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca aggtaacc 1498

Claims (4)

1.一种生活污水高效脱氮菌在生活污水净化中的应用，该菌分类命名为：假单胞菌Pseudomonas sp.，于2016年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No. 13454；所述生活污水高效脱氮菌菌株的16S rDNA序列如SEQID NO: 1所示；所述生活污水高效脱氮菌具有硝化反硝化功能。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生活污水高效脱氮菌去除氨氮效果为起始氨氮浓度小于500mg/L。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生活污水高效脱氮菌去除氨氮效果为起始氨氮浓度小于100mg/L。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述污水为农村生活污水。
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