CN103074278B

CN103074278B - 一种氨氧化细菌及其应用

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Publication number: CN103074278B
Application number: CN201210586159.7A
Authority: CN
Inventors: 谢柳; 杨岳平; 杨浩峰; 周俊利; 胡安辉; 张挺
Original assignee: HUZHOU ENVIRONMENTAL SCIENCE AND TECHNOLOGY INNOVATION CENTER; ZHEJIANG ZHIMEI ENVIRONMENT TECHNOLOGY Co Ltd; Zhejiang University ZJU
Current assignee: HUZHOU ENVIRONMENTAL SCIENCE AND TECHNOLOGY INNOVATION CENTER; ZHEJIANG ZHIMEI ENVIRONMENT TECHNOLOGY Co Ltd; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2032-12-28
Also published as: CN103074278A

Abstract

本发明公开了一种氨氧化细菌及其应用，该氨氧化细菌命名为亚硝化单胞菌(Nitrosomonas eutropha)CM-NRO14，已于2012年11月12日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2012456。本发明还提供了所述亚硝化单胞菌CCTCC M 2012456在污水生物脱氨氮中的应用。本发明还提供了所述亚硝化单胞菌CCTCC M 2012456在水体富营养化治理中的应用。本发明氨氧化细菌的氨氧化速率和氨氮去除效率高，适合于高氨氮污水的处理。

Description

一种氨氧化细菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，尤其涉及一种氨氧化细菌及其应用。

背景技术

水是人类赖以生存的重要资源。随着我国经济的发展，水资源不足的矛盾已日益突现，成了制约许多城市经济发展的瓶颈，严重影响国民经济的增长。根据2011年中国环境状况公报，2011年氨氮排放量为82.6万吨，比2010年下降了0.41％(中华人民共和国环境保护部，2011)，然而氨氮和总氮仍是我国长江、黄河、海河等水系以及滇池、太湖、巢湖等主要湖泊的主要污染物指标。含氮污染物排放引起的水体富营养化仍然十分严重，威胁到人类健康和生态安全。氮素污染已成为我国当前亟待解决的重大环保课题。“十二五”期间，我国的氨氮减排目标较2010年下降10％。因此，污水和水体中氨氮去除效率的提高迫在眉睫。

针对这种氮素污染现状及其发展趋势，脱氮工艺的研究已成为国内外环境科学与工程领域内的研究热点之一。

短程硝化-反硝化工艺，是荷兰代尔伏特工业大学提出的新型生物脱氮工艺。其基本原理是：在较高的温度(30～40℃)下，氨氧化细菌的生长速率高于硝酸细菌，通过控制较高的温度和pH、较短的污泥停留时间，将硝酸细菌洗出，使亚硝酸细菌在反应器中占据绝对优势，从而使大部分NH₄ ⁺-N氧化成NO₂ ^--N，然后进行反硝化脱氮。与传统的全程硝化-反硝化相比，该工艺具有以下优点：(1)硝化与反硝化可放在同一个反应器中进行，工艺流程简单；(2)硝化产生的酸度可部分地由反硝化产生的碱度中和，减少化学试剂用量；(3)水力停留时间(HRT)缩短，减少反应器体积和占地面积，节省基建投资；(4)节省反硝化所需的碳源，NO₂ ^--N反硝化比NO₃ ^--N反硝化可节省碳源(以甲醇为例)40％；(5)需氧量下降25％，减少动力消耗。

在短程硝化反硝化工艺中，氨氧化细菌起着核心作用，目前国内科研学者为了更好的提高氨氮的去除率，开始对脱氮微生物进行分离、筛选、研究。窦立军等(窦立军，蒋进元等，《环境科学研究》，2011，24(11))报道了两株自养型氨氧化细菌A.P-7和A.P-8为假单胞菌属，最大氨氧化速率分别为19.96mg/L·d和23.58mg/L·d；张建等在(张建等，《宁波大学学报(理工版)》，2011，24(3))报道了一株亚硝酸单胞杆菌，该菌株最大氨氧化速率的氨氮浓度为200mg/L，当氨氮浓度达到2000mg/L时氨氧化速率受到明显的抑制；又如公开号为CN102268387A的中国专利文献公开了一种氨氧化细菌及其分离方法与应用，该氨氧化细菌命名为A.P-7，为上述窦立军等人2011年分离的氨氧化细菌，该专利阐述了该菌株的氨氧化效果可达到90％以上。

综合上述文献及专利中所叙述的氨氧化细菌，这些菌株在污水生物脱氨氮中表现出一定的脱氨氮效率，但整体来说，这些菌株所表现出的氨氧化速率、氨氮去除效率仍然较低，此外，这些菌株的氨氮浓度的耐受力也十分有限，而目前存在大量的高氨氮污水的情况下，更是制约了这些菌株的应用。

发明内容

本发明提供了一种氨氧化细菌，氨氧化速率和氨氮去除效率高。

一种氨氧化细菌，分类命名为亚硝化单胞菌(Nitrosomonas eutropha)，完整命名为亚硝化单胞菌(Nitrosomonas eutropha)CM-NRO14，该菌株已于2012年11月12日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2012456。

本发明菌株在培养基上菌落为圆形，淡黄色，表面光滑湿润，显微镜观察该菌株的菌体呈椭球或短杆状，大小为(1.0～1.3)×(1.6～2.3)μm，细胞内部有比较复杂的内膜系统和羧酶体，革兰氏染色反应呈阴性。

所述培养基的成分为：(NH₄)₂SO₄，2.0g/L；KH₂PO₄，0.7g/L；Na₂HPO₄，7g/L；NaHCO₃，1g/L；MgSO₄·7H₂O，0.2g/L；CaCl₂·2H₂O，5mg/L；Fe-EDTA，1mg/L；琼脂，1.5～2％；pH为7.8～8.0。

在氧气的参与下，该菌株可以将氨氮转化为亚硝酸盐，因此，可对工业污水、市政污水中的氨氮进行处理以及修复水体富营养化。

本发明还提供了所述的亚硝化单胞菌CCTCC M 2012456在污水生物脱氨氮中的应用。

具体包括：向污水处理系统的好氧池中加入填料和接入亚硝化单胞菌CCTCC M 2012456，挂膜完成后向好氧池内连续通入污水进行处理。

所述污水处理系统为厌氧-好氧工艺系统、厌氧-缺氧-好氧工艺系统、序批式活性污泥系统、流化床生物膜反应器系统等。

填料为细菌的生长提供载体，所述的填料可以为聚氨酯海绵、拉西环填料、活性炭、陶粒等。

所述填料在好氧池中的填充率为10～30％，更优选为20％。填充率过大，不利于菌株形成优势种群，填充率过小，则细菌生长的生物量过少，影响脱氮效率。

所述挂膜的时间为3～4天。时间过短，菌株尚未在填料上繁殖足够的生物量形成生物膜，时间过长，则菌株老化，氨氧化能力下降。

污水处理时，好氧池内的温度为20～40℃，溶解氧浓度为0.5～3mg/L，pH为7～8.5，氨氮浓度≤2400mg/L，优选的，氨氮浓度为200～400mg/L，pH为7.5～8.0，温度为34℃。

污水处理时，在上述条件下，有利于菌株的生长和增殖，使其更有效的去除污水中的氨氮，氨氮去除率可大于95％，总氮去除率大于75％。

本发明还提供了所述的亚硝化单胞菌CCTCC M 2012456在水体富营养化治理中的应用。

具体包括：

(1)将所述的亚硝化单胞菌CCTCC M 2012456固定在载体上制成微生物微球；

(2)对微生物微球进行驯化；

(3)将驯化后的微生物微球投入到待处理水体中进行处理。

所述的载体为聚乙烯醇和海藻酸钠的混合物。传质性能好，且微生物微球的稳定性强。

为了增强微生物微球的稳定性，通常在载体中还加入适量的二氧化硅、铁粉、碳酸钙等。

二氧化硅可以增加微生物微球的比重，减少其上浮。碳酸钙可增强微生物微球的通透性，提高活性。铁粉也可减少微生物微球的上浮现象，并增强微生物微球的活性。

在修复水体富营养化的过程中，所述的微生物微球也可以联合水生动物和/或植物共同修复富营养化的水体。利用不同种生物之间的协同作用可以达到更好的修复效果。

所述的水生动物为大型溞。大型溞可摄食水体中的藻类，降低藻类的密度，提高水体的透明度，同时大型溞可替代藻类释放氧气，促进氨氧化细菌的生长，此外，大型溞排放的粪便可被植物吸收利用。

所述的植物为苦草。苦草可吸收富营养化水体中的氮，供自身生长所需，同时，苦草也可分泌化学物质抑制藻类生长，苦草还是水生动物的栖息产卵的场所。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明菌株的最大氨氧化速率为70.6mg/L·d，是目前报道的氨氧化细菌的氨氧化速率的3～4倍；

(2)本发明菌株的氨氮去除率达到95％以上，相对于现有氨氧化细菌80％或90％以上的氨氮去除率有明显提高；

(3)现有的氨氧化细菌在氨氮浓度为2000mg/L时氨氧化活性就会受到明显的抑制，而本发明菌株在氨氮浓度为2400mg/L时氨氧化活性才受到明显抑制，适用于高氨氮污水的处理。

附图说明

图1为亚硝化单胞菌CCTCC M2012456的透射电镜图片；

其中，IM为胞浆膜，C为羧酶体；

图2为亚硝化单胞菌CCTCC M2012456基于16S rDNA序列同源性构建的系统发育树；

图3为氨氮浓度对亚硝化单胞菌CCTCC M2012456氨氧化速率的影响；

图4为pH对亚硝化单胞菌CCTCC M2012456氨氧化速率的影响；

图5为温度对亚硝化单胞菌CCTCC M2012456氨氧化速率的影响；

图6为亚硝化单胞菌CCTCC M2012456对生活污水中氨氮含量的去除曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

实验检测方法

氨氮(NH4⁺-N)的检测方法：水杨酸-次氯酸盐光度法；

亚硝酸盐氮(NO2^--N)的检测方法：N-(1-萘基)-乙二胺光度法；

硝酸盐氮(NO3^--N)的检测方法：紫外分光光度法。

实施例1亚硝化单胞菌CCTCC M2012456的分离鉴定

(1)培养基

液体培养基：(NH₄)₂SO₄，2.0g/L；KH₂PO₄，0.7g/L；Na₂HPO₄，7g/L；NaHCO₃，1g/L；MgSO₄·7H₂O，0.2g/L；CaCl₂·2H₂O，5mg/L；Fe-EDTA，1mg/L；pH调节至7.8～8.0，121℃灭菌20分钟；

固体培养基：上述液体培养基成分中加入1.5～2％的琼脂。

(2)菌株的分离纯化

取杭州污水处理厂A²/O工艺的好氧段活性污泥，取1mL污泥进行梯度稀释10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵倍后，取150～200μL稀释液涂布于固体培养基平板上，30℃恒温黑暗培养1～2周，观察平板上菌落的生长情况。

挑取单菌落接种至50mL液体培养基中，30℃，150r/min恒温摇床富集培养7～10天，检测培养基中氨氮、亚硝酸盐氮的含量，计算氨氧化速率，来判断菌株的氨氧化能力。

筛选出氨氧化能力最高的阳性菌落，将其富集液进行划线进一步分离纯化，并收集部分菌液低温保藏待用；将该菌株命名为CM-NRO14，对其进行形态观察和鉴定。

a、CM-NRO14菌株的菌落、菌体形态观察

菌体形态学研究：对菌体进行革兰氏染色，在光学显微镜16×100油镜下进行观察。

菌体内部结构研究：对菌体进行超薄切片，用透射电子显微镜观察菌体内部结构。

在固体培养基上，CM-NRO14菌株的菌落淡黄色，圆形，表面光滑湿润。该菌株的菌体呈椭球或短杆状，大小为(1.0～1.3)×(1.6～2.3)μm，细胞内部有比较复杂的内膜系统和羧酶体(见图1)，革兰氏染色反应呈阴性。

b、CM-NRO14菌株的分子生物学鉴定

用细菌基因组DNA提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司)提取CM-NRO14菌株的DNA，扩增该菌株的16S rDNA，将获得的PCR产物纯化后委托上海生工生物工程有限公司测序。

PCR扩增引物为：

上游引物(CTO189f)：5’-GGAGGAAAGTAGGGGATCG-3’；

下游引物(CTO654r)：5’-CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC-3’。

PCR扩增体系如表1所示。

表1PCR扩增体系

成分	含量(uL)
		DNA模板	3
10×buffer	5
		dNTP混合物(各2.5mmol/L)	4
CTO189f(10pmol/L)	1
		CTO654r(10pmol/L)	1
Taq DNA聚合酶	0.3
		超纯水	35.7
总计	50

PCR反应条件为：

94℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸3min，进行30个循环，72℃延伸7min。

经测序获得到长度为444bp的16S rDNA片段，在GenBank中的注册登记号为JX545090，碱基序列如SEQ ID NO.3所示。通过Blast比对发现，CM-NRO14菌株与已报道亚硝酸菌属(Nitrosomonas)一些细菌的16SrDNA序列相似性达94％～99％。用MEGA4.0软件对这些细菌构建了系统发育树，并进行同源性分析。

如图2所示，CM-NRO14菌株与亚硝化单胞菌(Nitrosomonas eutropha)的遗传距离最近，结合菌株的形态学特征，可初步确定CM-NRO14菌株为亚硝化单胞菌(Nitrosomonas eutropha)，命名为亚硝化单胞菌(Nitrosomonas eutropha)CM-NRO14，并将该菌株送至位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2012456，保藏日期为2012年11月12日。

实施例2亚硝化单胞菌CCTCC M2012456的扩大培养

(1)配制20L培养基；

培养基组分为：(NH₄)₂SO₄，2.0g/L；KH₂PO₄，0.7g/L；Na₂HPO₄，7g/L；NaHCO₃，1g/L；MgSO₄·7H₂O，0.2g/L；CaCl₂·2H₂O，5mg/L；Fe-EDTA，1mg/L；pH调节至7.8～8.0，121℃灭菌20分钟；

(2)按5％的接种量将摇瓶富集好的本发明菌株转接到20L培养基的发酵罐中进行扩大培养。

扩大培养条件为：温度30℃，发酵罐内的pH用NaHCO₃调节至7.8左右，DO控制在1～2mg/L。

本发明菌株扩大培养至第6天时，培养基内初始氨氮浓度由200mg/L降至10mg/L以下，去除率大于95％。

实施例3亚硝化单胞菌CCTCC M2012456最佳去氨氮生长条件的优化

培养液A：

KH₂PO₄，0.7g/L；Na₂HPO₄，7g/L；NaHCO₃，1g/L；MgSO₄·7H₂O，0.2g/L；CaCl₂·2H₂O，5mg/L；Fe-EDTA，1mg/L；

培养液B：

(NH₄)₂SO₄，2.0g/L；KH₂PO₄，0.7g/L；Na₂HPO₄，7g/L；NaHCO₃，1g/L；MgSO₄·7H₂O，0.2g/L；CaCl₂·2H₂O，5mg/L；Fe-EDTA，1mg/L。

(1)本发明菌株最适NH₄ ⁺-N浓度

以分批培养形式考察不同起始氨氮浓度下氨氧化细菌的氨氧化速率。

在250mL锥形瓶中加入培养液A和1mL活化富集好的菌液，加入硫酸铵使NH₄ ⁺-N浓度依次设定为0、10、20、50、100、200、400、600、1000mg/L，整个反应体积为100mL。为了防止氨氧化产生的酸度对细菌活性的影响，培养液中含50mmol/L磷酸盐缓冲液，调整初始pH为7.8，30℃，150r/min摇床黑暗培养。通过测定氨氮和亚硝酸盐氮浓度变化计算氨氧化速率，来判断菌株的氨氧化能力。

由图3可知，本发明菌株在NH₄ ⁺-N浓度为200mg/L～400mg/L时表现出最好的氨氧化能力。

(2)本发明菌株最适生长pH

在250mL锥形瓶中加入培养液B和1mL活化富集好的菌液，整个反应体积为100mL。30℃，150r/min摇床黑暗培养，初始氨氮浓度为200mg/L，设置pH值分别为6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。间隔一定周期测得氨氮和亚硝酸盐氮浓度，根据氨氧化速率判定最适pH。

由图4可知，本发明菌株在pH为7.5～8.0时，氨氧化能力强。

(3)本发明菌株最适生长温度

在250mL锥形瓶中加入培养液B和1mL活化富集好的菌液，整个反应体积为100mL。初始氨氮浓度为200mg/L，初始pH值为7.8，150r/min摇床黑暗培养，设置温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃。间隔一定周期测得氨氮和亚硝酸盐氮浓度，根据氨氧化速率判定最适温度。

由图4可知，本发明中菌株表现强氨氧化能力的最适温度为34℃。

实施例3亚硝化单胞菌CCTCC M2012456对氨氮的去除

(1)配制含氨氮培养基；

(2)将活化富集好的本发明菌株收集菌体(目的是为了减少种子菌液中亚硝氮和氨氮对实验的影响)，按体积比10％的接种比例转接至300mL培养基中，30℃，150r/min摇床恒温培养，以不加菌液的培养基为对照，每天测定培养基内的氨氮含量。

由表2可知，本发明菌株培养至第5天，氨氮去除率大于95％，培养至第2天时，氨氧化速率为70.6mg/L·d，表明该菌株具有高效的脱氨氮的能力。

表2亚硝化单胞菌CCTCC M2012456对氨氮的去除

实施例4亚硝化单胞菌CCTCC M2012456应用于生活污水氨氮的去除

(1)采用A/O工艺进行生活污水生物脱氨氮处理试验，污水为生活污水化粪池出水；

(2)参照实施例2将本发明菌株扩大培养6天后，将菌液按体积比为10％投加至A/O工艺中的O池，同时，在O池内投加聚氨酯海绵填料，聚氨酯海绵填料在好氧池中的填充率为20％；

(3)挂膜3～4天，观察填料上菌株生长情况；

(4)填料挂膜完成后，连续进生活污水，每天检测进水和出水的氨氮含量；

生活污水氨氮去除小试运行条件和工艺参数：

进水的pH调节为7.5～8.0，进水流量控制在1.5L/h，检测进水水质状况，调节C/N比为5：1左右；厌氧池A池：检测池中水体溶氧要求稳定在0.2mg/L以下，pH稳定在7.0～7.5之间，温度不需要严格控制，可随环境温度变化而变化，一般为20～40℃；好氧池O池：检测池中水体溶氧要求稳定在0.5～1.5mg/L，pH稳定在7.5～8.0之间，温度不需要严格控制，可随环境温度变化而变化，一般为20～40℃，检测该池出水氨氮、总氮含量。O池混合液回流到A池，回流比设计为200％，沉淀池污泥回流到A池，回流比设计为100％(由于工艺流程中污泥产生量较少，污泥回流采用阶段性回流的方式)。整个工艺的水力停留时间为：18小时，其中O池水力停留时间为10小时。

由图6可知，生活污水进水的氨氮浓度为40～80mg/L，运用本发明菌株处理后，出水氨氮浓度基本保持在1～5mg/L，氨氮去除率大于95％。

实施例5亚硝化单胞菌CCTCC M2012456应用于水体富营化治理

(1)将本发明的菌株：以聚乙烯醇和海藻酸钠的混合物为载体，并添加铁粉，二氧化硅粉末和碳酸钙，进行包埋制备成微生物微球，各物质成分及包埋方法参照文献：闵航，郑耀通，钱泽澎，陈美慈，聚乙烯醇包埋厌氧活性污泥处理废水的最优化条件研究，环境科学，1994，15(5)；

(2)以富营化水体为修复对象，取富营化水按体积比30％、60％、100％加入微生物微球中进行逐步驯化，驯化时间为1天，温度30～35℃，使微生物微球适用水体环境，恢复其脱氨氮的能力；

(3)将驯化好的包埋有本发明细菌的微生物微球按体积比5％投加到事先建造好的试验水池内，该水池具有曝气、水体循环及微球截留等功能；

(4)将包埋有本发明细菌的活性微球并结合其他水生动物(大型溞)和植物(苦草)进行联合水体富营化治理。

治理前水质较差，水体泛黄，有异味，氨氮浓度大于2mg/L；治理后水质清澈，能见度在1.5m以上，氨氮去除率95％以上。

Claims

1.一种氨氧化细菌，其特征在于，命名为亚硝化单胞菌(Nitrosomonas eutropha)CM-NRO14，保藏编号为CCTCC NO：M2012456。

2.如权利要求1所述的氨氧化细菌在污水生物脱氨氮中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：向污水处理系统的好氧池中加入填料和接入亚硝化单胞菌CCTCC M2012456，挂膜完成后向好氧池内连续通入污水进行处理。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述污水处理系统为厌氧-好氧工艺系统、厌氧-缺氧-好氧工艺系统、序批式活性污泥系统或流化床生物膜反应器系统。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述填料在好氧池中的填充率为10～30%。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述填料为聚氨酯海绵、拉西环填料、活性炭或陶粒。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，污水处理时，好氧池内的温度为20℃～40℃，溶解氧浓度为0.5～3mg/L，pH为7～8.5，氨氮浓度≤2400mg/L。

8.如权利要求1所述的氨氧化细菌在水体富营养化治理中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，包括：

(1)将所述的亚硝化单胞菌CCTCC M2012456固定在载体上制成微生物微球；

(2)对微生物微球进行驯化；

(3)将驯化后的微生物微球投入到待处理水体中进行处理。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述载体为聚乙烯醇和海藻酸钠的混合物。