CN107460141A - 一种异养硝化好氧反硝化柠檬酸杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异养硝化好氧反硝化弗氏柠檬酸杆菌，该菌可以被用于工农业生产或生活污水处理的应用。所述该菌株已保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC No.13434，其可应用于含氮水体的生物脱氮及各种水体环境下多种抗生素的生物降解。本发明中的弗氏柠檬酸杆菌CFS06不仅能够进行有机或无机氮的生物脱除，还被发现耐受水体中的苯酚并可以有效地对其进行降解。异养硝化性能测定结果表明，上述不动杆菌弗氏柠檬酸杆菌CFS06对于有机及无机氨氮具有很高的去除率，且无中间代谢物硝酸盐及亚硝酸盐的积累；该菌株可以在有氧条件下进行硝酸盐的反硝化处理，对C/N营养要求低，在污水环境中的繁殖能力强，共对苯酚的耐受及降解使其在河道工业污染物的绿色治理方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于应用微生物领域，具体涉及可以一种可以被应用于污水处 理的异养硝化好氧反硝化柠檬酸杆菌。
背景技术
畜牧养殖、现代种植业的发展使得农业污染排放超过工业污泥，成为全 国最大的行业污染源；另外在城市人口密集、生活垃圾处置方案及设施还 不完善的情况下，城市的水环境也面临着很大的超排放压力，水体环境中 的氮磷超标非常普遍，轻则引起水体富营养化，藻类大量繁殖，影响水体 的生态平衡及其自净功能，重则导致水体黑臭化，危及生活用水安全，因 此富含氮的生活污水需要经过脱氮处理，另外，城市及工业区周围的水体 环境常因炼焦炼油、煤气制造、绝缘材料、药品、化工原料生产等工厂的 存在而出现严重的酚类污染，另外，应用于大范围的灭钉螺或蝗虫操作时， 会带来大面积的五氯酚钠等酚类物质的污染，最后它们经雨水注入河道及 湖泊等水体环境。
水体中超标的氮元素主要以有机氮(如蛋白多肽分子、寡肽或氨基酸 等)及无机氮(氨氮、硝酸根或亚硝酸根)两种形式存在。在正常的水体 环境中，有机氮可被水生生物同化吸收，另一部分由微生物分解脱氮转化 为氨氮，氨氮由硝化菌和反硝化菌的协同作用下转化为氮气释放到空气中， 完成自然界的氮素循环。因此，在氮超标的水体中，通常可以利用由硝化 菌和反硝化菌为核心的微生物群体进行生物催化脱氮，即生物脱氮技术， 它是一种被广泛应用且成本较低的传统脱氮方法。但这种方法处理效率不 高，需要的水力停留时间长，对水体中高浓度的氨氮会出现不能及时处理 等问题，而异养硝化好氧反硝化微生物的出现更新了微生物生物脱氮的认 识，这种新型的代谢途径可由单一微生物完成，并让硝化和反硝化在同一 反应器中完成，因此不仅可以加快反应进程，缩短水力停留时间，还可以 处理高浓度的氨氮废水。因此，近年，对异养硝化好氧反硝化微生物的筛 选、功能鉴定及水处理应用的报道不时出现。由于氮超标污染水体中可能 同时会伴随情况不同的其它污染源，如酚类物质超标。因此，用于生物脱 氮处理的微生物因此还需要具备一定的抗污染、分解污染能力，这类功能 微生物将在复杂的污染处理应用的更具应用前景。
发明内容
因此，本发明将通过提供一种能够应用于含酚污水氨氮超标治理的微 生物及其应用方法，这种高效的异养硝化-好氧反硝化细菌可以用于生活及 工业污水处理。
为此，本发明的技术方案为：
一种弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06(CFS06)，是从污水的 淤泥中经过富集培养及分离纯化而得到的，于2016年12月7日，保藏于 中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCG)，保藏编号为CGMCC No.13434。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
完整的分离过程如下：将淤泥以1％(w/v)接入异养硝化富集培养基进 行初筛，再由溴百里酚蓝(BTB)平板筛选法获得多株具有异养硝化好氧 反硝化功能的菌株，通过功能验证确定出本发明中的的柠檬酸杆菌CFS06。
上述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)CFS06，为革兰氏阴性杆菌， 在LB培养板上的菌落呈规则圆形，菌体呈乳白色，半透明，微凸，菌落挑 起时呈现一定粘性，直径2-5mm，边缘整齐，镜检下单个菌体呈杆状，大 小约为0.8-5.0×0.3-1.0μm。CFS06可利用硫酸铵或硝酸盐作为唯一氮源生 长。
上述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)CFS06经过了核糖体DNA (rDNA)的扩增及测序，获得的16S rDNA基因的测序长度为1434bp，如 序列表中SEQ ID NO.1所示；再经BLAST序列同源性比对及遗传进化树的 分析，鉴定该菌株的属于柠檬酸杆菌属，因此命名为不动杆菌弗氏柠檬酸 杆菌(Citrobacter freundii)S06。
上述柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06在水体环境中生物脱氮工艺 中的应用。
上述应用中，所述含氮水体可以存在酚类化学物质的污染，其污染浓 度是上限可以是200mg/L。
所述应用包括：将柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06经液体放大培 养制备微生物菌体并接种至受污染的水环境。
所述应用中，菌株适于生物脱氮的水体温度为10-37℃。
所述应用中，柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06放大培养的培养基 为LB或NRM培养基，接种量按菌体湿重计为0.01-0.1g/L。
所述应用中的LB培养基的配方(1L培养液)为：胰蛋白胨10g/L，酵 母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH为7.0；
所述应用中的NRM培养基的配方(1L培养液)为：(NH4)2SO4 2.0 g/L，柠檬酸钠20.0g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，1.0mM磷酸盐缓冲液K-PBS， pH 6.8。
上述应用中，将扩大培养后的柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06 按0.1％-5％的投种比应用于SBR污水反应器进行生物脱氮及苯酚降解处 理，所述含氮水体的初始pH为5.0-10.0，水力停留时间为6-24h，曝气时 间4-12h，溶氧为1.5～4.0mg/L，转速100-300rpm，柠檬酸的后续补充量 为0-20g/L。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06，可以耐受并降 解苯酚等酚类物质，苯酚的含量在50mg/L以下时，30℃，处理48小时， 去除率在98％左右；该微生物生长适应能力强，营养要求低，可以耐受广 谱的pH域(耐受pH 5.0-10.0)，在多样的应用环境下均具备良好的生物催 化功能。
2.本发明提供的柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06在污染水体生物 脱氮中的应用，对污水中氨态氮、硝基氮及总氮、COD均有较高的去除率， 其生物脱氮的温度适应范围宽广，脱除效率很高，总氮脱除率在90％以上。
附图说明
对柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06的生物脱氮，将由本发明中的 附图进行展示说明。
图1为本发明的菌株柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06的种群分析 结果(专利菌株CFS06的遗传进化树图)。
图2为本发明中的微生物菌株柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06 对氨氮和总氮的脱除结果分析。
图3本发明的柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06在不同温度下的 培养36h时的脱氮效果分析。
图4本发明中的柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06对酚类物质的 耐受及脱除效果分析。
具体实施方案
以下实施例对本发明的技术方案做进一步描述和补充，但本发明并不局 限于下述实施方式，一般技术人员在本发明所揭露的技术范围内，做细节 修改或非保护性的技术变化，均在本发明的保护范围内。实例中涉及到的 对氨氮、总氮、COD、和硝态氮等指标的测定方法分别由以下方法约定： 氨氮采用《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》(HJ 535-2009)测定；总 氮采用《碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》(GB 11894-89)；COD采用 《快速消解分光光度法》(GB11914-89)；硝态氮(NO3--N)采用紫外分光光 度法对水质测定硝酸盐氮的方法(HZ-HJ-SZ-0138)。
实施例1 柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06的富集培养及分离
活性污泥取自上海浦东竹园第一污水处理厂的处理池，5mL泥水混合 液接种到45mL灭菌的NRM富集培养基中(NRM培养基的配方为： (NH4)2SO4 2.0g/L，柠檬酸钠20.0g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，1.0mM磷酸 盐缓冲液K-PBS，pH 6.8。)；30℃，200rpm，恒温摇床培养24h；然后将 富集的种子液进行梯度稀释，用涂棒涂布到NRM固体培养板(NRM，含 2％琼脂)；30℃恒温培养箱中培养24h后，对生长出的微生物克隆进行单 独培养，接种到的液体的溴百里酚蓝(BTB)培养基中，30℃恒温培养箱 中培养24h。BTB培养基的配方为(按每升计)：KNO31g，琥珀酸钠8.5g， MgSO4·7H2O 1g，CaCl2 0.15g，FeSO4·7H2O 0.05g，磷酸盐缓冲液K-PBS(0.2M，pH 6.8)10mL，1％BTB 1.0mL，琼脂20g，1g BTB溶于100mL 无水乙醇后加到固体培养基中。微生物在BTB培养板上生长后，有些可出 现蓝色的晕圈，挑出这些菌落，进行BTB培养基的划线纯化。
实施例2 菌株的鉴定和遗传树分析
收集2ml新鲜的菌株培养液，离心10,000g，2min，利用基因组DNA 提取试剂盒，如Axygen公司的试剂盒，提取CFS06的基因组DNA，溶解 并稀释到100mg/L，以此为模板进行16S rDNA的扩增，所用的引物对分 别为16S-F及16S-R，序列分别为，16S-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA， 以及16S-R：GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR的反应混合液配制如下：模板DNA 1μL，PCR Taq mix 25μL，上下游引物各1.0μL(20μM)，加ddH2O 至50μL。PCR程序运行如下：94℃5min，94℃30s，53℃1min，72℃2 min，30个循环，再72℃5min，4℃1min。PCR产物由专业生物公司 测序完成，如上海生工生物有限公司，所获得的序列利用网络工具完成Blastn分析，并由生物信息学软件Mega6完成遗传树分析。
测序完成的16S rDNA的有效序列长度为1434bp，如序列表中SEQ ID NO.1所示。经过遗传树分析，确认该微生物的16s rDNA序列NCBI数据 库中发表的柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)同源性达99％以上，其最近 缘的微生物菌株就是柠檬酸杆菌(见图1)，因此确认该微生物属于柠檬酸 杆菌属，因此命名为Citrobacter freundii S06。
实施例3 Citrobacter freundii S06的培养及生物脱氨分析
将LB平板上的单克隆菌落接种到50ml的LB液体培养基，30℃，200 rpm，在250ml的摇瓶中振荡培养24h，取3％(v/v)培养液离心，3,000g， 2min，以1ml NRM培养基洗涤，再接种至100ml NRM液体培养基，30℃， 200rpm，在500ml的摇瓶中振荡培养72h，定期取样测定氨氮(NH3-N)、 硝酸盐(NO3-N)和亚硝酸盐(NO2-N)的浓度，通过分析总氮(TN)的 残余量来计量菌株对无机氮的脱除率，并由此来判断菌株的异养硝化好氧 反硝化性能。由图2可以看出，分离获得的菌株CFS06在人工合成培养基 中的生物脱氮性能非常高，具备很好的脱氮性能，48h时的总氮去除率接 近92％，游离氨氮和硝基氮的残余量接近为0，并且检测不到中间产物亚硝 态氮。所用NRM培养基的配方为：(NH4)2SO4 2.0g/L，柠檬酸钠20.0g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，1.0mM磷酸盐缓冲液K-PBS，pH 6.8。
实施例4 Citrobacter freundii S06的生长适应性研究
利用NRM培养基在不同的温度下进行菌株CSF06的适应性生长和生物 脱氮性能的观察。先将CFS06接种到LB培养基，30℃，200rpm过夜培养， 经离心获取细胞后，利用洗涤，分别接种至50mL的NRM液体培养液中， 接种量按菌体湿重计为0.2g/L，然后将这些培养瓶分别放入10-40℃的培养 箱中进行振荡培养36h，定期取样测定氨氮(NH3-N)、硝酸盐(NO3-N) 和亚硝酸盐(NO2-N)的浓度，通过分析总氮(TN)的残余量来分析和比 较CFS06在36h时对无机氮的脱除率，其结果如图3所示，可以看出，CSF06 在很低的水温(10℃)仍能进行一定的生长和脱氮功能，随着温度的升高， 其对无机氮的利用和降解急剧增加，并在25-40℃之间保持很高的生物催化 能力。
实施例4 Citrobacter freundii S06对苯酚的降解分析
将LB平板上的单克隆菌落接种到50ml的LB液体培养基，30℃，200 rpm，在250ml的摇瓶中振荡培养24h，取3％(v/v)培养液离心，3,000g， 2min，以1ml NRM培养基洗涤，再接种至分别含有5-300mg/L苯酚 (CAS#：108-95-2)的50ml NRM液体培养基，30℃，200rpm，在250ml 的摇瓶中振荡培养48h，定期取样测定氨氮(NH3-N)、硝酸盐(NO3-N) 和亚硝酸盐(NO2-N)以及苯酚的浓度，分析总氮(TN)及苯酚的残余量 来计量菌株对无机氮和苯酚的生物脱除效率。图4列出的是在不同的苯酚 浓度下CFS06对苯酚在48h时对培养液中的苯酚的降解结果。在补加了300 mg/L的苯酚的培养液中，CFS06的生长出现严重的迟缓，而在5-200mg/L 的培养液中，CFS06均可以在48h内生长至对数期的后期，如图4中的OD600值所示；而在较低浓度下，苯酚基本被完全利用，没有苯酚的残余，在含 有较高浓度苯酚的培养液中，如200mg/L，其降解或利用率达到了90.6％， 而苯酚浓度在50mg/L以下时，降解率达到98％左右。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。
SEQ ID No 1
gcaggcctaacacatgcaagtcgaacggtagcacagaggagcttgctccttgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcccgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaatgtactttcagcgaggaggaaggtgttgtggttaataaccgcagcaattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtgggaagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaacttagcagagatgctttggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgtt gggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggttaggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtg
SEQ ID No 1
gcaggcctaacacatgcaagtcgaacggtagcacagaggagcttgctccttgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcccgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaatgtactttcagcgaggaggaaggtgttgtggttaataaccgcagcaattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtgggaagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaacttagcagagatgctttggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggttaggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtg
Claims (10)
1.一种弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)S06(CFS06)，其保藏编号为CGMCCNo.13434。
2.权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌CFS06在富含氨氮、硝基氮水体中生物脱氮的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述富含有机无机氮的水体中同时含有苯酚类污染物。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将弗氏柠檬酸杆菌CFS06经发酵扩大培养后投放到污染水体中后进行水处理应用。
5.根据权利要求4所述的的应用，其特征在于，所述的放大发酵培养温度为25-37℃。
6.根据权利要求5所述的的应用，其特征在于，所述的水处理应用的温度范围在10-37℃。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，弗氏柠檬酸杆菌CFS06经放大培养后施用到污染水体的接种量，按菌体湿重计为0.01-0.1g/L。
8.根据上述权利要求所述的应用，其特征在于，所述含氮污染水体中苯酚的测试添加量为0.01-200mg/L。
9.弗氏柠檬酸杆菌CFS06经扩大培养所使用的培养基为LB培养基或者NRM培养基；所述NRM培养基的配方为：(NH4)2SO4 2.0g/L，柠檬酸钠20.0g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，1.0mM磷酸盐缓冲液K-PBS，pH 6.8。
10.根据权利要求2-7任一项所述的应用，其特征在于，将弗氏柠檬酸杆菌CFS06扩大培养后应用于污水处理反应器，反应器条件设置为：所述含氮水体的初始pH为5.0-10.0，水力停留时间为6-24h，曝气时间4-12h，溶氧为1.5～4.0mg/L，转速100-300rpm，柠檬酸的后续补充量为0-20g/L。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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Application publication date: 20171212 Assignee: Dongguan Branch of Foshan Yuhuang Ecological Environment Technology Co.,Ltd. Assignor: FOSHAN CITY YUHUANG ECOLOGICAL ENVIRONMENT SCIENCE AND TECHNOLOGY CO.,LTD. Contract record no.: X2022440000220 Denomination of invention: A Heterotrophic Nitrifying Aerobic Denitrifying Citrobacter and Its Application Granted publication date: 20200925 License type: Common License Record date: 20221009 |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: Unit 1101, 11th floor, building 8, area a, Hantian science and Technology City, 17 Shenhai Road, Guicheng Street, Nanhai District, Foshan City, Guangdong Province, 528200 Patentee after: Yuhuang Ecological Technology Co.,Ltd. Address before: Unit 1101, 11th floor, building 8, area a, Hantian science and Technology City, 17 Shenhai Road, Guicheng Street, Nanhai District, Foshan City, Guangdong Province, 528200 Patentee before: FOSHAN CITY YUHUANG ECOLOGICAL ENVIRONMENT SCIENCE AND TECHNOLOGY CO.,LTD. |
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