CN106967628B - 一种异养硝化好氧反硝化不动杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种异养硝化好氧反硝化不动杆菌及其应用。所述不动杆菌为(Acinetobacter sp.)YN‑3，其保藏编号为CGMCC No.11366，其可应用于含氮水体脱氮。本发明的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN‑3，同时抗链霉素和四环素，并且异养硝化性能测定结果表明，上述不动杆菌YN‑3对于氨氮具有很高的去除率，且中间产物硝酸盐和亚硝酸盐积累量极少。好氧反硝化性能测定结果表明，该菌株在有氧条件下能够将硝态氮很好的去除，且亚硝酸盐累残余量低，无二次污染。

Description

一种异养硝化好氧反硝化不动杆菌及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种异养硝化好氧反硝化不动杆菌及其应用。
背景技术
工农业的迅速发展和人类的生产活动，给水体环境带来了严重的污染。氮源超标是水体污染中最常见的一类污染问题，其引起水体富营养化，导致藻类大量繁殖，水体溶氧降低，水体发黑，不仅危及人类的用水安全，还会严重影响水体的生态平衡。氮源排放过量会导致氮平衡被破坏，造成水体失去自净功能，因此富含氮的污水需要经过脱氮处理达标后才能排放到自然环境中。
氮素在水体中主要以有机氮(如蛋白质、氨基酸等)和无机氮(氨氮、硝态氮和亚硝态氮)两种形式存在。其中，有机氮一部分被水生生物同化吸收，一部分由微生物分解脱氮转化为氨氮，氨氮经硝化菌的硝化作用和反硝化菌的反硝化作用转化为氮气释放到空气中，完成自然界的氮素循环。生物脱氮技术是目前应用广泛且经济效益较高的脱氮方法。传统的生物脱氮由好氧自养硝化作用和厌氧异养反硝化作用共同完成，而异养硝化好氧反硝化微生物代谢途径的发现打破了对传统生物脱氮领域的认识。此新的代谢途径可使硝化和反硝化在同一反应器中完成，由此可以加快反应过程，减小反应器容积，缩短水力停留时间，降低运行成本，还可以处理高浓度的氨氮废水。
因此，获得具有异养硝化好氧反硝化代谢功能的微生物，将其用于污水生物脱氮，提高生物脱氮效率，对提高污水的脱氮处理效率和经济性有着重要的意义。中国专利文献(CN102747015A)公开了一种具有异养硝化-好氧反硝化功能菌株不动杆菌LN5(Acinetobacter schindleri LN5)，所述不动杆菌LN5属于申氏不动杆菌(Acinetobacterschindleri)，对金霉素具良好的耐受能力，并具有在好氧条件下同时进行异养硝化-好氧反硝化脱氮的性能。由于受污染情况、地理环境、气候、季节等因素的影响，污水中含有的重金属离子、磷源、抗生素等均会不同，所以有时需要用于生物脱氮处理的微生物对多种因素有一定程度的耐受性，例如多种抗生素。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中缺乏同时抗多种抗生素的异养硝化-好氧反硝化细菌的缺陷，从而提供一种同时抗四环素和链霉素的异养硝化-好氧反硝化不动杆菌，所述异养硝化-好氧反硝化不动杆菌具有高效脱氮的功能。
本发明要解决的另一个技术问题在于克服现有技术中缺乏高效脱氮的方法，从而提供上述异养硝化-好氧反硝化不动杆菌在含氮水体脱氮中的应用。
为此，本发明的技术方案为：
一种不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3，其保藏编号为CGMCC No.11366。所述YN-3菌株是从污水中经过分离、纯化筛选得到的，于2015年9月11日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCG)，保藏编号为CGMCC No.11366。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
筛选过程为：将污泥接入异养硝化菌培养基进行初筛，再经溴百里酚蓝(BTB)平板筛选法复筛出本发明的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3。
上述不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3，为革兰阴性球杆菌，菌落呈圆形，半透明乳白色，有一定粘性，表面光滑，边缘整齐；菌体呈短杆状，大小为1.0-2.0×0.5-0.8μm。
可利用铵盐或硝酸盐为唯一氮源生长。
上述不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3的16S rDNA基因的有效序列长度为1437bp，如序列表中SEQ ID NO.1所示。经BLAST序列同源性比对及系统发育进化树的构建，鉴定该菌株的属于不动杆菌属(Acinetobacter sp.)，命名为不动杆菌(Acinetobactersp.)YN-3。
上述不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3在含氮水体脱氮中的应用。
上述应用中，所述含氮水体含有四环素和/或链霉素。
上述应用中，所述应用包括：将不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3扩大培养后接种于含氮水体进行好氧连续培养。
上述应用中，所述好氧连续培养的温度为30-35℃。
上述应用中，将不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3扩大培养至对数期，接种量按菌体湿重计为0.2-3g/L。
上述应用中，扩大培养所使用的培养基为LB培养基、NM培养基或DM培养基；
所述LB培养基的配方为：包括胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH为7.0；
所述NM培养基的配方为：(NH4)2SO40.945g/L，柠檬酸钠16.34g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，0.2M、pH 6.8的磷酸盐缓冲液K-PBS 10mL，按每升计；
所述DM培养基的配方为：KNO30.53g/L，柠檬酸钠3g/L，MgSO4·7H2O1g/L，0.2M、pH6.8的磷酸盐缓冲液K-PBS 10mL，按每升计。
上述应用中，所述含氮水体中污水中四环素含量为0.001-50mg/L；所述含氮水体中污水中链霉素含量为0.001-100mg/L。
上述应用中，所述含氮水体的初始pH为5.0-10.0。
上述应用中，将不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3扩大培养后应用于SBR反应器，SBR反应器条件设置为：水力停留时间为8-15h，曝气时间6-9h，溶氧为1.5～4.0mg/L；转速100-300rpm。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3，同时抗链霉素和四环素，耐受性分别高达100mg/L和50mg/L，并且异养硝化性能测定结果表明，所述不动杆菌YN-3对于氨氮具有很高的去除率，且中间产物硝酸盐和亚硝酸盐积累量极少。；好氧反硝化性能测定结果表明，该菌株在有氧条件下能够将硝态氮很好的去除，且亚硝酸盐累残余量低，无二次污染；同时所述不动杆菌YN-3生长适应能力强，可以耐受广谱的pH域(耐受pH5.0-10.0)，并且在pH 5.0-10.0环境下，兼具异养硝化-好氧反硝化能力。
2.本发明提供的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3在含氮水体脱氮中的应用，对生活污水中氨氮、总氮和COD均有较高的去除率，用于污水培养8h后对生活污水中的氨氮和COD的去除率均达到98％以上，总氮去除率达到92％，取得了较好的脱氮及COD去除效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的菌株(Acinetobacter sp.)YN-3对氨氮和总氮的去除效果。
图2为本发明的菌株(Acinetobacter sp.)YN-3的遗传树分析结果。
图3本发明的菌株(Acinetobacter sp.)YN-3在不同pH下的生长情况。
图4本发明的菌株(Acinetobacter sp.)YN-3在不同pH下的脱氮情况。
图5.本发明的菌株(Acinetobacter sp.)YN-3抗四环素及链霉素的结果。
图6本发明的菌株(Acinetobacter sp.)YN-3SBR脱氮效果。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明的技术方案做进一步描述。目的是为了更好地解释本发明，但本发明并不局限于下述实施方式，本领域一般技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化，均在本发明的保护范围内。
以下实例中涉及到的总氮、氨氮、COD、和硝态氮的测定方法分别如下：总氮采用《碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》(GB11894-89)测定；氨氮采用《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》(HJ 535-2009)测定；COD采用《快速消解分光光度法》(GB11914-89)测定；硝态氮(NO3--N)分别采用紫外分光光度水质测定硝酸盐氮的方法(HZ-HJ-SZ-0138)，该方法利用硝酸根离子在220nm波长处的吸收而定量测定。
实施例1 异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选及分离
取上海浦东竹园第一污水处理厂污水处理池的活性污泥，从该活性污泥中取5mL泥水混合液至45mL灭菌的NSM富集培养基中。
然后置于30℃，200rpm的气浴摇床富集培养12h。将富集液进行梯度稀释后，均匀涂布于NSM分离培养基(琼脂20g/L，其余成分同NSM)。在30℃恒温培养箱中培养1d后，挑取形态大小不同的单克隆，划线纯化后编号保藏，得到初筛菌株。
其中，NSM培养基的配方为，按每升计：(NH4)2SO40.945g，柠檬酸钠16.34g，MgSO4·7H2O 1.0g，NaCl 0.12g，MnSO4·H2O 0.01g，FeSO4·7H2O0.02g，磷酸盐缓冲液K-PBS(pH6.8)10mL。
将以上初筛的菌株接种到溴百里酚蓝(BTB)分离培养基。BTB培养基的配方为,，按每升计：KNO31g，琥珀酸钠8.5g，MgSO4·7H2O 1g，CaCl20.15g，FeSO4·7H2O 0.05g，磷酸盐缓冲液K-PBS(0.2M，pH 6.8)10mL，1％BTB 1.0mL，琼脂20g。1g BTB溶于100mL无水乙醇即得1％BTB乙醇溶液。在30℃恒温培养箱中培养1d后，挑取周围培养基出现蓝色晕圈的菌株至BTB培养基，划线纯化。
从平板挑取菌落接种至LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0)，在30℃气浴摇床200rpm培养12h，取4％(体积比)菌液离心洗涤，接种至NM液体培养基。1升NM培养基的配方为：(NH4)2SO40.945g，柠檬酸钠16.34g，MgSO4·7H2O 1.0g，0.2M,pH为6.8的磷酸盐缓冲液K-PBS 10mL(下述NM培养基均为此配方)。在30℃，气浴摇床200rpm摇瓶培养，定期取样测定氨氮(NH3-N)、硝酸盐(NO3-N)和亚硝酸盐(NO2-N)的浓度，通过分析总氮(TN)的去除率来判断菌株的异养硝化性能。由图1可以看出，菌株YN-3具备很好的脱氮性能，36h时的总氮去除率达到98.8％，并且作为中间产物的硝态氮和亚硝态氮极少积累，累积量在0.02mg/L左右。
从平板挑取菌落接种至LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0)，30℃气浴摇床200rpm培养12h，取4％(体积比)菌液离心洗涤，接种至DM液体培养基。(1升DM培养基的配方为：KNO30.53g，柠檬酸钠3g，MgSO4·7H2O 1.0g，0.2M，pH为6.8的磷酸盐缓冲液K-PBS 10mL)30℃，200rpm摇瓶培养，定期取样测定氨氮(NH3-N)、硝酸盐(NO3-N)和亚硝酸盐(NO2-N)的浓度，通过分析总氮(TN)的去除率来判断菌株的好氧反硝化性能。由图1可以看出，菌株YN-3具有良好的硝态氮脱除性能，培养36h后，硝态氮脱除率达到80.61％，在反硝化过程中，亚硝酸盐的累积量很少，含量在0.1mg/L左右。
经过上述筛选和培养鉴定，得到(Acinetobacter sp.)YN-3，在本发明中也可称之为菌株YN-3。
实施例2 分子生物学鉴定
采用Axygen公司的试剂盒提取YN-3的基因组DNA，并以此为模板扩增16S rDNA，引物：16S rDNA-8F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。
PCR反应体系(50μL)：模板DNA 1μL，PCR Taq mix 25μL，上下游引物各1.5μL，DMSO2μL，加ddH2O至反应体系为50μL。PCR程序：94℃5min，94℃30s，50℃1min，72℃2min，72℃5min，72℃10min；30个循环。PCR产物的纯化和测序由美吉生物医药科技有限公司完成，测序序列登录NCBI进行同源序列搜索(Blastn分析)，将所获得的序列再导入生物信息学软件Mega6进行遗传树分析。
扩增的菌株YN-3的16S rDNA的有效序列长度为1437bp，如序列表中SEQ ID NO.1所示。经过比对，该序列与NCBI数据库中数十种已发布的不动杆菌的序列最为相似，其中与Acinetobacter junii(NCBI登录号为：KP100325.1)同源性达99％，因此证实该菌属于不动杆菌属(Acinetobacter sp.)，因而将其命名为(Acinetobacter sp.)YN-3。
实施例3 (Acinetobacter sp.)YN-3的生长适应性及脱氨氮效果分析
利用NM培养基进行菌株YN3的培养，将YN3接种到LB培养基，30℃气浴摇床200rpm培养12h。然后分别取菌液离心洗涤，分别接种至50mL的NM液体培养液中，接种量按菌体湿重计为0.3g/L，培养液的酸碱度(pH)分别为4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，10.5，11.0。在30℃，200rpm气浴摇瓶培养24h，其结果如图3所示。
而由图3可以看出，YN3可以在pH值在5.0-10.0之间均可以生长，虽然在pH5.0或10.0时，生长变缓，但菌株生长仍旧进行；YN3在pH 5.0以下及10.0以上的培养液中没有生长现象或生长及其缓慢，并且在pH值在5.0-10.0时，氨氮降解依旧同时进行，如图4所示。
实施例4 (Acinetobacter sp.)YN-3抗生素抗性分析
将(Acinetobacter sp.)YN-3接种到分别添加了四环素或链霉素的LB琼脂培养平板中，四环素浓度分别为0.1mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L；四环素浓度分别为0.1mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L；放置于30℃恒温培养，观察YN-3菌株的生长情况。结果表明，YN-3菌株对四环素或链霉素的耐受能力分别为50mg/L和100mg/L。如图5所示，在培养箱中静置培养24h后，YN3在含有四环素(100mg/L)或链霉素(50mg/L)的培养基中生长情况。
实施例5 菌株YN-3在废水中的脱氮效果
小区生活污水，其pH为7.0，氨氮为26mg/L，总氮为42mg/L，COD为297mg/L，四环素为100mg/L，链霉素50mg/L。将生活污水引入SBR反应器。
将菌株YN-3接种于NSM液体培养基，30℃气浴摇床200rpm培养12h后，菌液OD600达到2.0以上；然后将培养液经离心收集细胞，再以无菌水洗涤重悬，接种至SBR反应器，接种量按菌体湿重计为2g/L。反应器水力停留时间为12h，曝气时间8h，溶解氧浓度维持在2mg/L。每隔2h测定水样中氨氮(NH4-N)，总氮(TN)及化学需氧量(COD)。结果如图6所示，菌株YN-38h后对生活污水的氨氮、总氮及COD的去除，最终出水氨氮和COD的去除率均达到98％以上，总氮去除率达到92％，取得了较好的脱氮及COD去除效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3，其保藏编号为CGMCC No.11366。
2.权利要求1所述的不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3在含氮水体脱氮中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述含氮水体含有四环素和/或链霉素。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3扩大培养后接种于含氮水体进行好氧连续培养。
5.根据权利要求4所述的的应用，其特征在于，所述好氧连续培养的温度为30-35℃。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3扩大培养至对数期，接种量按菌体湿重计为0.2-3g/L。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含氮水体中污水中四环素含量为0.001-50mg/L；所述含氮水体中污水中链霉素含量为0.001-100mg/L。
8.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述含氮水体的初始pH为5.0-10.0。
9.根据权利要求8述的应用，其特征在于，将不动杆菌(Acinetobacter sp.)YN-3扩大培养后应用于SBR反应器，SBR反应器条件设置为：水力停留时间为8-15h，曝气时间6-9h，溶氧为1.5～4.0mg/L，转速100-300rpm。
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