CN109456913B - 铜绿假单胞菌及应用其处理有机废水的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于废水生物处理技术领域，尤其涉及一种铜绿假单胞菌及应用其处理有机废水的方法。该铜绿假单胞菌G12的分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15857。铜绿假单胞菌G12在好氧条件下能够实现对废水中NH4 +‑N、NO3 ‑‑N的高效降解，具有异养硝化‑好氧反硝化脱氮的能力，并且在脱氮同时，还能够用将废水中的Cr(VI)还原成低毒性的Cr(III)，适用于处理存在氮素及Cr(VI)的复合污染的水体，在处理存在氮、Cr(VI)复合污染的有机废水方面表现出良好的应用前景。

Description

铜绿假单胞菌及应用其处理有机废水的方法
技术领域
本发明属于应用废水生物处理技术领域，尤其涉及一种铜绿假单胞菌及应 用其处理有机废水的方法。
背景技术
环境中的铬(Cr)主要以Cr(III)和Cr(VI)两种价态存在，其中，Cr(VI) 进入生物体内后会诱发基因突变并有致癌的可能性，其毒性比Cr(III)高一百 多倍。然而，Cr(VI)作为一种常用的工业原料，被广泛应用于电镀、染料制 造、皮革和冶金等行业，这些行业产生大量含铬废水，这些废水也不可避免的 进入周围环境中。对于废水中Cr(VI)的处理，通常是采用物理法、化学法或 者是物理-化学法等将Cr(VI)还原成Cr(III)，如吸附、膜分离、离子交换、 化学沉淀、电化学处理以及光催化还原法等方法。虽然物理化学法处理所需时 间短，去除效率高，方便快捷；但常规的物理处理方法仍然存在许多不足，如 成本高昂、设备要求高、需经常维修护理、设施基建费用高、对水质要求高等； 而化学法通常需要加入过量化学药剂，容易引入新的污染，并且产生的化学沉 淀物难以处理，极易产生二次污染等。上世纪70年代，学者在厌氧环境中成功 的分离出一株具有Cr(VI)还原功能的细菌，此后，又连续有多株能够将还原 Cr(VI)为Cr(III)的细菌被报道从环境中分离出来，至此，微生物法还原Cr (VI)的方法被提出。微生物法还原Cr(VI)因其具有投资小、不存在二次污 染等的特点，具有较大的发展应用潜力。
另一方面，水体氮素污染普遍存在于地表水体和地下水体中，来源广泛， 如：农业面源污染、大气沉降、生活污水排放等等，也就是说，大部分水体可 能同时存在氮素和Cr(VI)这两种污染物。近年来，国内外学者在海洋沉积物、 盐碱湖、江河及污水处理系统等多种环境中成功分离出能高效脱氮的异养硝化- 好氧反硝化菌，相比其他脱氮技术，异养硝化-好氧反硝化具有快速、环保、低 耗、高效等优点，是目前脱氮技术的研究热点。值得一提的是，研究还发现在 Cr(VI)污染严重的水体，如制革废水、垃圾渗沥液等水体中也存在着异养硝 化-好氧反硝化现象，这使得利用生物法同步去除氮素和Cr(VI)这两种污染物 成为可能。因此，从环境中分离出具有同步异养硝化-好氧反硝化脱氮和还原Cr (VI)能力的微生物，研究其同步处理氮素污染物和Cr(VI)污染物的能力， 并将其应用于处理含氮及含Cr(VI)的有机废水，使其作为功能微生物同步去 除废水中的氮素和Cr(VI)污染物，正逐步成为废水生物处理的一大研究热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种铜绿假单胞菌及应用其处理有机废水的方法， 旨在解决现有技术中水体存在氮素和六价铬复合污染的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)G12，铜 绿假单胞菌G12于2018年06月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路，保藏编号为CGMCC No.15857。
进一步地，铜绿假单胞菌G12的16S rRNA的核苷酸序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明的另一目的在于提供一种应用铜绿假单胞菌G12处理含氮有机废水 的方法，取铜绿假单胞菌G12接种于含氮有机废水中。
进一步地，在上述应用铜绿假单胞菌G12处理含氮有机废水的处理方法中， 含氮有机废水中含有NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N中的一种或几种。
进一步地，在上述含氮有机废水的处理方法中，含氮有机废水的温度为25～35℃。
本发明的另一目的在于提供一种应用铜绿假单胞菌G12处理含氮和含六价 铬的有机废水的方法，取铜绿假单胞菌G12接种于含氮和含六价铬的有机废水 中。
进一步地，在上述应用铜绿假单胞菌G12处理含氮和含六价铬的有机废水 的处理方法中，六价铬被还原成三价铬。
进一步地，在上述应用铜绿假单胞菌G12处理含氮和含六价铬的有机废水 的处理方法中，含氮和含六价铬的有机废水中初始六价铬浓度为0mg/L～20 mg/L。
进一步地，在上述应用铜绿假单胞菌G12处理含氮和含六价铬的有机废水 的处理方法中，含氮和含六价铬的有机废水中含有NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N中 的一种或几种。
进一步地，在上述应用铜绿假单胞菌G12处理含氮和含六价铬的有机废水 的处理方法中，含氮和含六价铬的有机废水的温度为25～35℃。
本发明的有益效果：本发明的铜绿假单胞菌G12，其具有异养硝化-好氧反 硝化脱氮能力，在好氧条件下能够实现对废水中氮素，如NH4 +-N、NO3 --N及 NO2 --N等的高效降解和有机碳的同步脱除，将其应用于含氮有机废水的处理， 有望突破传统生物脱氮过程对溶解氧需求的对立局限，从而达到简化工艺控制 条件、降低基建及运营维护成本等的目的；另一方面，铜绿假单胞菌G12在脱 氮的同时，还能够还原废水中的Cr(VI)，降低废水中Cr的毒性，并且，其对 较高浓度的Cr(VI)具有一定的耐受性，在Cr(VI)浓度较高的情况下，异养硝化-好氧反硝化脱氮的能力不会受到抑制，适用于处理存在氮素及Cr(VI)的 复合污染的水体，在处理存在氮、Cr(VI)复合污染的有机废水方面表现出良 好的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例提供的铜绿假单胞菌在不同碳源条件下对NO3 --N、TN 及Cr(VI)的去除特性图；
图2是本发明实施例提供的铜绿假单胞菌在Cr(VI)浓度为5mg/L条件下 的好氧反硝化去除NO3 --N同时还原Cr(VI)的特性图；
图3是本发明实施例提供的铜绿假单胞菌在Cr(VI)浓度为10mg/L条件 下的好氧反硝化去除NO3 --N同时还原Cr(VI)的特性图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以 下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体 实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的， 而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。 由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该 特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体 的限定。
在本发明的描述中，需要说明的是：下述实施例中的实验方法，如无特殊 说明，均为常规的实验方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均自常规生化试剂商店购买得到的；下述实施例中所涉及的各实验均设置三次 重复，结果取平均值。
本发明提供了一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)G12，于2018 年06月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路，保藏编号为CGMCC No.15857。
本发明的铜绿假单胞菌G12的16S rRNA的核苷酸序列具有如SEQ ID NO.1 所示的序列，且SEQ ID NO.1所示的序列的长度为1407bp，在GenBank中基因 序列登录号为MH266777。
本发明所提供的铜绿假单胞菌G12是从重庆市鸡冠石污水厂曝气池外回流 井取源泥，对源泥中的活性污泥菌群进行分离并通过平板划线法纯化所得。
具体地，将源泥从污水厂取回进行活化后，在含NO3 --N的选择培养基中进 行首次性能筛选，随后对经过初筛的细菌悬液进行后续的划线分离和选择培养， 经过多次固体平板划线和液体选择培养的往复循环筛选及分离后得到目标菌株 G12。再采用16S rDNA基因测序技术对经划线纯化得到的目标菌株G12的部分 16S rRNA基因进行测定，测定得到的如SEQ ID NO.1所示的序列，该序列的长 度为1407bp；将测得的序列上传到GenBank中(登录号为MH266777)，并与 该数据库中已有的微生物基因序列进行比对，比对结果表明其与大多数的 Pseudomonas aeruginosa属的细菌有超过99％的相似度，因此，判断目标菌株 G12属于Pseudomonas aeruginosa属的一株细菌，并将其命名为铜绿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)G12。
根据本发明的另一方面，其还提供了一种应用铜绿假单胞菌G12处理含氮 有机废水的方法，即，取铜绿假单胞菌G12接种于含氮有机废水中。
具体地，将铜绿假单胞菌G12以1％(v/v)接种到100mL含NH4 +-N的有 机废水中，好氧培养72h后，其能够将初始浓度为500mg/L的NH4 +-N的浓度 降低至约为90mg/L，并且此时菌株的OD600(溶液在600nm波长处的吸光值， 表示菌体密度)值约为2.1。也就是说，本发明的铜绿假单胞菌G12能够应用于 处理含NH4 +-N的有机废水，在异养好氧的条件下表现较好的生长和代谢氮的能 力，具有异养硝化去除废水中NH4 +-N的能力。
更具体地，将铜绿假单胞菌G12以1％(v/v)接种到100mL含NO3 --N的 有机废水中，好氧培养96h后，其能够将初始浓度为500mg/L的NO3 --N的浓 度降低至约为10mg/L，并且对废水中总氮的去除率高达70％。即，本发明的铜 绿假单胞菌G12能够应用于处理含氮有机废水，其能以硝态氮作为电子受体， 以好氧反硝化的方式将废水中硝酸盐氮转化成N2或者N2O等气态产物从水体中 排除。
更具体地，铜绿假单胞菌G12还可以利用葡萄糖、柠檬酸三钠、乙酸钠以 及琥珀酸钠等为唯一碳源，NO3 --N、NH4 +-N以及NO2 --N为唯一氮源进行生长 代谢并进行异养硝化-好氧反硝化作用，去除废水中的氮素。
进一步地，将本发明的铜绿假单胞菌G12应用于处理含氮有机废水时，其 所处理的含氮有机废水含有NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N中的至少一种。也就是说， 铜绿假单胞菌G12具有异养硝化的能力，能去除废水的NH4 +-N；同时，其还具 有好氧反硝化的能力，能够去除废水的NO3 --N和NO2 --N，并且，其还对NO2 --N 具有耐受性，能够抵抗NO2 --N的生物毒性。
进一步地，将本发明的铜绿假单胞菌G12应用于处理含氮有机废水时，其 所处理的含氮有机废水的溶解氧DO的含量约为3.0mg/L～8.0mg/L，具体可以 为3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L、6.0mg/L、6.5mg/L、7.0mg/L、7.5mg/L或 者8.0mg/L；保证废水中DO的含量以满足菌株好氧呼吸所需要的氧气的量，以 使菌株能够正常的生长和代谢，保证菌株具有高效的氮素降解能力。一般地， 实验室条件下，上述DO的含量可以通过恒温振荡培养箱对培养液进行振荡来 实现，如DO的含量3.0mg/L～8.0mg/L时，其所对应的恒温振荡培养箱的转速为90rpm～180rpm，转速越高对应的DO的含量越高，反之则越低；当然，其 也可以采用曝气头曝气或者是搅拌曝气等的方式来实现。因此，只要能够给菌 株的生长提供好氧的环境，此处对具体的实现方式不做具体的限定。
更进一步地，将本发明的铜绿假单胞菌G12应用于处理含氮有机废水时， 含氮有机废水的温度为25～35℃，具体可以为25℃、28℃、30℃、32℃、 34℃或者36℃等；将废水温度控制在一定的范围之内，为铜绿假单胞菌G12 的生长及代谢提供合适的外界环境，以尽可能的提高菌株的生长及代谢活力， 保证菌株的高效脱氮能力。一般地，实验室条件下，可以通过设定恒温震荡培 养箱的温度来调节含氮有机废水的温度，当然，也可以采用水浴加热等的加热 方式来进行控制，此处对加热方式不做具体的限定。
更进一步地，将本发明的铜绿假单胞菌G12应用于处理含氮有机废水时， 含氮有机废水的碳氮比C/N为6～20，具体可以为6、10、12、15、18或者20 等；保证废水中合理的C源和N源的含量，提供菌株生长所需的营养物质，保 证菌株的生长和代谢，为提高菌株降解氮素的能力提供良好的条件。其中，C/N 比的具体调节依靠投加进废水中的含氮物质和含氮物质的量来决定，其具体的 投量计算方式在此不进行赘述。
更进一步地，将本发明的铜绿假单胞菌G12应用于处理含氮有机废水时， 含氮有机废水的pH值为6～10，具体可以为6、7、8、9或者10等。不同的微 生物适应于在不同的pH环境下生长，良好的酸碱环境是保证微生物正常生长和 代谢甚至是存活的必要条件，因此，保证废水的pH值维持在6～10的数值范围， 是维持本发明的铜绿假单胞菌G12的正常生长代谢所必须的条件之一，并且在 此pH范围内，菌株能够表现出较好的脱氮能力。
根据本发明的另一方面，还提供了一种应用铜绿假单胞菌G12处理含氮和 含六价铬有机废水的方法。即，取铜绿假单胞菌G12接种于含氮和含六价铬的 有机废水中。
具体地，将铜绿假单胞菌G12以1％(v/v)接种到100mL含氮和含Cr(VI) 的有机废水中，好氧培养96h后，铜绿假单胞菌G12再好氧反硝化将氮素浓度 降低的情况下，还能同步将废水中的Cr(VI)去除，如将初始浓度为300mg/L 的NO3 --N的浓度降低至约为35mg/L的同时，将初始浓度为5mg/L的Cr(VI) 降低至约0.8mg/L；而当NO3 --N初始浓度为500mg/L、Cr(VI)浓度为10mg/L 时，其反应96h后，对两者的去除率分别可高达97％和93％。
具体地，本发明的铜绿假单胞菌G12在处理含氮和含Cr(VI)有机废水时， 废水中的六价铬被还原成三价铬，即，当铜绿假单胞菌G12应用于处理同时含 氮和含六价铬两种污染物的有机废水时，铜绿假单胞菌G12不仅能以硝态氮作 为电子受体，对氮素进行还原去除，其还能以Cr(VI)为电子受体，将Cr(VI) 还原成毒性较低的Cr(III)，从而达到降低水体Cr污染的目的。因此，本发明 的铜绿假单胞菌G12不仅适合用于处理含氮有机废水，其还适用于处理受氮素 和Cr(VI)复合污染的水体。
更具体地，铜绿假单胞菌G12还可以利用葡萄糖、柠檬酸三钠、乙酸钠以 及琥珀酸钠等为唯一碳源，NO3 --N、NH4 +-N以及NO2 --N为唯一氮源进行生长 代谢并在进行好氧反硝化脱氮的同时还原废水中的Cr(VI)，将Cr(VI)还原 成毒性较低的Cr(III)，从而达到同步去除废水中氮素污染物和Cr(VI)污染 物的目的。
进一步地，将本发明的铜绿假单胞菌G12应用于处理含氮和含六价铬有机 废水时，其所处理的含氮和含六价铬的有机废水含有NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N 中的至少一种。也就是说，铜绿假单胞菌G12在被六价铬污染的水体，其仍然 能够异养硝化去除废水中的NH4 +-N；同时，也能够表现好氧反硝化的能力，能 够去除废水的NO3 --N和NO2 --N，并且，其还对NO2 --N具有耐受性，能够抵抗 NO2 --N的生物毒性。
进一步地，将发明的铜绿假单胞菌G12应用于处理含氮和含六价铬的有机 废水时，含氮和含六价铬的有机废水中初始六价铬浓度为0mg/L～20mg/L，具 体可以为0mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、12mg/L、15mg/L或者20mg/L。 即，铜绿假单胞菌G12对不同浓度的Cr(VI)均表现出较好的耐受性，较高浓 度的Cr(VI)也不会抑制铜绿假单胞菌G12的生长及代谢活性，在不同分体受 不同浓度Cr(VI)污染的情况下铜绿假单胞菌G12均能将Cr(VI)还原成Cr (III)，从而降低废水中Cr的毒性。
更进一步地，将本发明的铜绿假单胞菌G12应用于处理含氮和含六价铬的 有机废水时，其所处理的含氮有机废水的溶解氧DO的含量约为3.0mg/L～8.0 mg/L，具体可以为3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L、6.0mg/L、6.5mg/L、7.0mg/L、 7.5mg/L或者8.0mg/L；保证废水中DO的含量以满足菌株好氧呼吸所需要的氧 气的量，以使菌株能够正常的生长和代谢，保证菌株具有高效的降解氮素和还 原Cr(VI)的能力。一般地，实验室条件下，上述DO的含量可以通过恒温振 荡培养箱对培养液进行振荡来实现，如DO的含量3.0mg/L～8.0mg/L时，其所 对应的恒温振荡培养箱的转速为90rpm～180rpm，转速越高对应的DO的含量 越高，反之则越低；当然，其也可以采用曝气头曝气或者是搅拌曝气等的方式 来实现。因此，只要能够给菌株的生长提供好氧的环境，此处对具体的实现方 式不做具体的限定。
更进一步地，将本发明的铜绿假单胞菌G12应用于处理含氮和含六价铬的 有机废水时，含氮有机废水的温度为25～35℃，具体可以为25℃、28℃、30℃、 32℃、34℃或者36℃等；将废水温度控制在一定的范围之内，为铜绿假单胞 菌G12的生长及代谢提供合适的外界环境，以尽可能的提高菌株的生长及代谢 活力，保证菌株高效的氮素降解和还原Cr(VI)的能力。一般地，实验室条件 下，可以通过设定恒温震荡培养箱的温度来调节含氮有机废水的温度，当然， 也可以采用水浴加热等的加热方式来进行控制，此处对加热方式不做具体的限 定。
更进一步地，将本发明的铜绿假单胞菌G12应用于处理含氮和含六价铬的 有机废水时，含氮有机废水的碳氮比C/N为6～20，具体可以为6、10、12、15、 18或者20等；保证废水中合理的C源和N源的含量，提供菌株生长所需的营 养物质，保证菌株的生长和代谢，为提高菌株氮素降解和还原Cr(VI)的能力 提供良好的条件。其中，C/N比的具体调节依靠投加进废水中的含氮物质和含氮 物质的量来决定，其具体的投量计算方式在此不进行赘述。
更进一步地，将本发明的铜绿假单胞菌G12应用于处理含氮和含六价铬的 有机废水时，含氮有机废水的pH值为6～10，具体可以为6、7、8、9或者10 等。不同的微生物适应于在不同的pH环境下生长，良好的酸碱环境是保证微生 物正常生长和代谢甚至是存活的必要条件，因此，保证废水的pH值维持在6～10 的数值范围，是维持本发明的铜绿假单胞菌G12的正常生长代谢所必须的条件 之一，并且在此pH范围内，菌株能够表现出较好的脱氮及还原Cr(VI)的能 力。
本发明的铜绿假单胞菌G12，其在好氧条件下能够实现对废水中氮素，如NH4 +-N、NO3 --N、NO2 --N等的高效降解和有机碳的同步脱除，将其应用于含氮 有机废水的处理，有望突破传统生物脱氮过程对溶解氧需求的对立局限，从而 达到简化工艺控制条件、降低基建及运营维护成本等的目的；另一方面，铜绿 假单胞菌G12在好氧反硝化脱氮的同时，还能够还原废水中的Cr(VI)，降低 废水中Cr的毒性，并且，其对较高浓度的Cr(VI)具有一定的耐受性，在Cr (VI)浓度较高的情况下，其好氧反硝化脱氮的能力不会受到抑制，适用于处 理存在氮素及Cr(VI)的复合污染的水体，在处理存在氮、Cr(VI)复合污染 的有机废水方面表现出良好的应用前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例一：铜绿假单胞菌G12的分离及鉴定
1、铜绿假单胞菌G12的分离及纯化
本实施例所用的活性污泥取自重庆市鸡冠石污水厂曝气池外的回流井，铜 绿假单胞菌G12的筛选采用平板划线法，其中液体培养条件为温度30℃、摇 床转速为120rpm，固体平板培养条件为生化培养箱30℃无菌培养。具体的分离 及纯化按如下步骤进行：
1)菌株的初筛和富集：向装有95mL无菌水的三角瓶中加入一定量的用于 打散活性污泥的玻璃小球，灭菌处理后，取5mL取自重庆市鸡冠石污水厂曝气 池外回流井的活性污泥接种于上述三角瓶中，并将其置于恒温振荡培养箱中好 氧培养1h，得到分散混匀的菌悬液。随后，取1mL上述的菌悬液接种于100mL 的液体选择培养基中，并将其置于恒温振荡培养箱中好氧培养48h，得到分散 混匀的培养液，随后再取1mL培养液转移至新鲜的液体选择培养基中，共转接 4次，且每次均于恒温振荡培养箱中好氧培养72h，以进行功能细菌的驯化初筛。 最后，将最后一次初筛培养后的培养液取约1mL接种于LB液体培养基中，并 置于恒温振荡培养箱中好氧富集培养24～48h，得到富集培养液。
2)菌株的复筛和纯化：将上述的富集培养液梯度稀释成10-1～10-6的稀释培 养液，然后进行以下步骤：①取不同浓度梯度的稀释培养液分别于固体选择培 养基上接种划线，在生化培养箱中倒置培养4～7d；②挑取平板中长势良好的单 个菌落接种于液体选择培养基中，如挑取颜色、大小、形状不同的单个菌落， 再将接种后的培养液置于恒温振荡培养箱中好氧培养72h，培养后测定液体选 择培养基中NO3 --N和Cr(VI)含量；③选取对NO3 --N和Cr(VI)去除效果较 好的培养液；④再将步骤③中得到的培养液进行梯度稀释，并重复步骤①～③， 直至获取一株对NO3 --N和Cr(VI)去除效果较好且去除稳定的菌株，将其命名 为G12，该菌株具有好氧反硝化脱氮和去除废水中Cr(VI)的能力。
具体地，上述步骤所涉及的培养基的构成分别为：
LB培养基的构成(每升)：酵母粉5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、NaH2PO4·2H2O 和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
液体选择培养基的构成(每升)：KNO3 3.6105g、C6H5Na3O7·2H2O 20.423g、 NaCl4g/L、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
固体选择培养基的构成(每升)：在液体选择培养基的基础上加入15～20g 琼脂粉；
上述微量元素溶液的构成(每升)：MgSO4·7H2O 3g、MnSO4·H2O 3.36g、 H3BO31.12g、ZnSO4·7H2O 3g、FeSO4·7H2O 0.3g和CaCl2 0.6g。
1000mg/L的Cr(VI)标准液为：K2Cr2O7 2.8293g/L，将不同体积的1000 mg/L Cr(VI)(K2Cr2O7)加入培养基至所需的Cr(VI)浓度。
更具体地，本实施例的培养基在使用之前均进行灭菌处理，灭菌条件为： 高压蒸汽灭菌锅、121℃、灭菌30min；并且，本实施例的上述的取样、接种 及稀释过程均在无菌环境下进行。
2、铜绿假单胞菌G12的鉴定
本实施例的铜绿假单胞菌G12为非发酵革兰氏阴性杆菌，菌体细长、且长 短不一，菌体略呈球杆状或线状，常成对或呈短链状排列，菌体的一端有单鞭 毛，在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。
本实施例的铜绿假单胞菌G12的16S rDNA基因序列见序列表，序列长度 为1407bp，在GenBank中基因序列的登录号为MH266777。将该菌的基因序列 上传至GenBank中进行比对，比对结果表明：该菌的基因序列与Pseudomonas aeruginosa的序列相似性最高。因此，结合细菌的形态特征判断该菌株属于铜绿 假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，并将其命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)G12。
具体地，本实施例的铜绿假单胞菌G12已于2018年06月04日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区 北辰西路，其保藏编号为CGMCC No.15857。
实施例二：铜绿假单胞菌G12在不同碳源下对NO3 --N和Cr(VI)的去除 特性
将铜绿假单胞菌G12接种于以KNO3为氮源分别以柠檬酸三钠、琥珀酸钠、 葡萄糖或乙酸钠为唯一碳源的四种对照培养基(A、B、C、D)中，检测菌株对 污水中NO3 --N、TN和Cr(VI)的降解及NO2 --N的累积情况。其中，各对照培 养基中NO3 --N的初始浓度均为500mg/L、Cr(VI)的初始浓度均为10mg/L、 C/N比均为8。接种后，将各对照培养基置于30℃、120rpm恒温振荡培养箱中 连续好氧培养72h，培养后，取各培养基培养液测定培养液的OD600，并于8000 rpm、4℃条件下离心10min后测定上清液中TN、NO3 --N、NO2 --N以及Cr(VI) 的含量。
如图1所示，其示出了铜绿假单胞菌G12在不同碳源条件下对氮素及Cr(VI) 的处理情况。在碳源为柠檬酸钠时，铜绿假单胞菌G12在72h能将93％的Cr (VI)还原，此时，NO3 --N去除率达85％，TN去除率约为50％；在以琥珀酸 钠为唯一碳源条件下，菌株G12在72h能将92％的Cr(VI)还原，此时，NO3 --N 去除率达77％，TN去除率约为40％；而当分别以葡萄糖和乙酸钠作为唯一碳源 时，铜绿假单胞菌G12的脱氮能力以及Cr(VI)还原能力不佳，但是，也仍然 表现出一定的去除及降解能力。也就是说，铜绿假单胞菌G12在以柠檬酸钠或 者琥珀酸钠为唯一碳源时，其具有高效好氧反硝化脱氮和高效还原Cr(VI)的 能力，去除效果良好，因此，对于铜绿假单胞菌G12而言，柠檬酸三钠和琥珀 酸钠是适合其生长和代谢的更为优质的碳源；而对于葡萄糖和乙酸钠这两种碳 源而言，菌株虽然没有表现出高效的去除能力，但是，其仍然表现出一定的耐 受能力，具有一定的应用潜力。
上述A培养基配方为(每升)：KNO3 3.6105g、C6H5Na3O7·2H2O 16.337g、 NaCl 4g、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
上述B培养基配方为(每升)：KNO3 3.6105g、C4H4Na2O4 13.504g、NaCl 4 g、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
上述C培养基配方为(每升)：KNO3 3.6105g、C6H12O6·H2O 11.009g、NaCl 4g、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
上述D培养基配方为(每升)：KNO3 3.6105g、CH3COONa 13.672g、NaCl 4g、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
1000mg/L的Cr(VI)标准液为：K2Cr2O7 2.8293g/L，将不同体积的1000 mg/L Cr(VI)(K2Cr2O7)加入培养基至所需的Cr(VI)浓度；
微量元素的构成均与实施例一相同，故在此不再进行赘述。
更具体地，本实施例的培养基在使用之前均进行灭菌处理，灭菌条件为： 高压蒸汽灭菌锅、121℃、灭菌30min；并且，本实施例的上述的取样、接种 及稀释过程均在无菌环境下进行。
实施例三、铜绿假单胞菌G12好氧反硝化同时还原Cr(VI)的特性研究
将铜绿假单胞菌G12以1％(v/v)接种于A、B两种C/N比均为10的反硝 化培养基中；其中，A培养基中NO3 --N浓度为300mg/L、Cr(VI)浓度为5mg/L， B培养基中NO3 --N浓度为500mg/L、Cr(VI)浓度为10mg/L。接种后，将A、 B两有机培养基置于30℃、120rpm恒温振荡培养箱中连续好氧培养，并于0h、 12h、21h、24h、27h、30h、36h、48h、72h、96h分别取培养液 测定各培养液的OD600，随后再于8000rpm、4℃条件下离心10min测定各上清 液中TN、NO3 --N、NO2 --N以及Cr(VI)的含量。
结果如图2和图3所示，从图中可以看出，铜绿假单胞菌G12在NO3 --N浓 度为300mg/L的A培养液中培养96h后，细菌生长量OD600达到了1.7左右； 此时，Cr(VI)浓度从初始的5mg/L降到了0.79mg/L，Cr(VI)还原率达到 了85％；NO3 --N浓度则从初始的300mg/L降低到了35mg/L，其去除率达88％， 而TN去除率在50％左右。而当铜绿假单胞菌G12在NO3 --N浓度为500mg/L 的B培养液中培养96h后，细菌生长量OD600也可以达到1.4左右；此时，Cr (VI)浓度则从初始的10mg/L降到了0.66mg/L，Cr(VI)还原率高达93.4％； NO3 --N则从500mg/L降到了12mg/L，去除率高达97％，并且，TN去除率维 持在70％左右。
由此可知，铜绿假单胞菌G12对于含较高浓度的NO3 --N和Cr(VI)的废 水具有良好的去除效果，并且，在一定的浓度范围内，随着NO3 --N和Cr(VI) 浓度的增加，其去除率也同步增加。表明，铜绿假单胞菌G12具有良好的同步 好氧反硝化脱氮以及还原Cr(VI)降低废水中Cr的毒性的能力，能够用于处理 存在氮素和Cr(VI)复合污染的废水。
上述A培养基配方为(每升)：KNO3 2.166g、C6H5Na3O7·2H2O 12.253g、 NaCl 4g、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
上述B培养基配方为(每升)：KNO3 3.611g、C6H5Na3O7·2H2O 20.423g、 NaCl 4g、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
1000mg/L的Cr(VI)标准液为：K2Cr2O7 2.8293g/L，将不同体积的1000 mg/L Cr(VI)(K2Cr2O7)加入培养基至所需的Cr(VI)浓度。
微量元素的构成均与实施例一相同，故在此不再进行赘述。
更具体地，本实施例的培养基在使用之前均进行灭菌处理，灭菌条件为： 高压蒸汽灭菌锅、121℃、灭菌30min；并且，本实施例的上述的取样、接种 及稀释过程均在无菌环境下进行。
实施例四、铜绿假单胞菌G12异养硝化-好氧反硝化同时还原Cr(VI)的 特性研究
研究铜绿假单胞菌G12在NH4 +-N条件下，同步异养硝化去除NH4 +-N和还 原Cr(VI)的性能，将铜绿假单胞菌G12以1％(v/v)接种于含有Cr(VI)且 以NH4 +-N为唯一氮源的硝化培养基中，其中，NH4 +-N浓度为500mg/L、Cr(VI) 浓度为10mg/L、C/N为10。接种后，将其置于30℃、120rpm恒温振荡培养箱 中连续好氧培养72h，培养后，取废水培养液测定培养液的OD600，并于8000rpm、 4℃条件下离心10min后测定上清液中NH4 +-N及Cr(VI)的含量。
结果如表1所示，以NH4 +-N为唯一氮源培养足够长时间如72h后，菌株的 OD600值可以达到2.077；并且，铜绿假单胞菌G12还能将54.61％的Cr(VI) 还原；此时，NH4 +-N的去除率达80.34％。即，铜绿假单胞菌G12能以NH4 +-N 作为氮源进行生长和繁殖，具有同步异养硝化和还原Cr(VI)的能力；并且， 当NH4 +-N浓度高达500mg/L时，其仍然能够表现出较好的Cr(VI)还原能力， 表明高浓度的氨氮不会抑制铜绿假单胞菌G12的生长，并且也不会抑制细菌对 Cr(VI)进行还原降毒。
表1铜绿假单胞菌G12异养硝化去除NH4 +-N和还原Cr(VI)的性能表
Figure BDA0001865112160000151
上述培养基配方为(每升)：NH4Cl 1.910g、C6H5Na3O7·2H2O 20.423g、NaCl 4g、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
1000mg/L的Cr(VI)标准液为：K2Cr2O7 2.8293g/L，将不同体积的1000 mg/L Cr(VI)(K2Cr2O7)加入培养基至所需的Cr(VI)浓度。
微量元素的构成均与实施例一相同，故在此不再进行赘述。
更具体地，本实施例的培养基在使用之前均进行灭菌处理，灭菌条件为： 高压蒸汽灭菌锅、121℃、灭菌30min；并且，本实施例的上述的取样、接种 及稀释过程均在无菌环境下进行。
实施例五、铜绿假单胞菌G12去除NO2 --N和还原Cr(VI)的特性研究
研究铜绿假单胞菌G12在以NO2 --N为唯一氮源的条件下，去除NO2 --N和 还原Cr(VI)的性能。将铜绿假单胞菌G12以1％(v/v)接种于且以NO2 --N 为唯一氮源且含有Cr(VI)的硝化培养基中，其中，NO2 --N浓度为500mg/L、 Cr(VI)浓度为10mg/L、C/N为10。接种后，将培养液置于30℃、120rpm恒 温振荡培养箱中连续好氧培养72h，培养后，取废水培养液测定培养液的OD600， 并于8000rpm、4℃条件下离心10min后测定上清液中NO2 --N及Cr(VI)的含量。
结果如表2所示，在以NO2 --N为唯一氮源条件下，菌株G12能克服亚硝酸 盐氮的生物毒性，在500mg/L的NO2 --N存在条件下生长代谢，72h时测得的 OD600值为1.873，略低于以氨氮和硝酸盐氮为氮源的培养液；在此条件下能将 Cr(VI)还原90.2％，NO2 --N去除率可以达到30％左右。在以硝酸盐氮为唯一 氮源情况下作为对比，在72h时，细菌生长量相差不大，OD600值差值较小；较 以氨氮为氮源而言，在相同的培养条件下，G12菌株能更好的还原Cr(VI)，还 原率达到93.4％；较以亚硝酸盐氮为氮源而言，G12菌株对Cr(VI)的还原率 相差不大。菌株G12不仅可以进行好氧反硝化去除硝酸盐氮，还能进行异养硝 化去除氨氮，除此之外还能以亚硝酸盐氮为唯一氮源进行生长代谢。
上述培养基配方为(每升)：NaNO2 2.464g、C6H5Na3O7·2H2O 20.423g、NaCl 4g、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
1000mg/L的Cr(VI)标准液为：K2Cr2O7 2.8293g/L，将不同体积的1000 mg/L Cr(VI)(K2Cr2O7)加入培养基至所需的Cr(VI)浓度；
微量元素的构成均与实施例一相同，故在此不再进行赘述。
更具体地，本实施例的培养基在使用之前均进行灭菌处理，灭菌条件为： 高压蒸汽灭菌锅、121℃、灭菌30min；并且，本实施例的上述的取样、接种 及稀释过程均在无菌环境下进行。
表2铜绿假单胞菌G12去除NO2 --N和还原Cr(VI)的性能表
Figure BDA0001865112160000171
实施例六、铜绿假单胞菌G12在不同NO3 --N浓度下还原Cr(VI)的特性 研究
研究铜绿假单胞菌G12在不同NO3 --N浓度下还原NO3 --N的特性，将铜绿 假单胞菌G12以1％(v/v)接种于含有NO3 --N为唯一氮源的四种硝化培养基A、 B、C和D中，其中，A、B、C和D四种硝化培养基中所含Cr(VI)浓度均 为10mg/L，C/N均为10，所含NO3 --N的浓度分为100、300、500、700mg/L。 接种后，将各培养液置于30℃、120rpm恒温振荡培养箱中连续好氧培养72h， 培养后，取废水培养液测定培养液的OD600，并于8000rpm、4℃条件下离心10 min后测定上清液中NO3 --N及Cr(VI)的含量。
结果如表4所示，菌株G12在不同NO3 --N浓度下，对NO3 --N均有较高的 去除效果，菌株G12甚至能在NO3 --N浓度为700mg/L的极端条件下正常生长， 没有受到高浓度硝酸盐的影响。当NO3 --N的浓度较低时，菌株G12生长量较小， 对Cr(VI)的还原效果不明显。随着NO3 --N浓度的增高，菌株G12的生长量 增大，Cr(VI)去除率升高。
上述A培养基配方为(每升)：KNO3 0.7221g、C6H5Na3O7·2H2O 20.423g、 NaCl 4g、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
上述B培养基配方为(每升)：KNO3 2.166g、C6H5Na3O7·2H2O 20.423g、 NaCl 4g、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
上述C培养基配方为(每升)：KNO3 3.611g、C6H5Na3O7·2H2O 20.423g、 NaCl 4g、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
上述D培养基配方为(每升)：KNO3 5.055g、C6H5Na3O7·2H2O 20.423g、 NaCl 4g、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
1000mg/L的Cr(VI)标准液为：K2Cr2O7 2.8293g/L，将不同体积的1000 mg/L Cr(VI)(K2Cr2O7)加入培养基至所需的Cr(VI)浓度；
微量元素的构成均与实施例一相同，故在此不再进行赘述。
更具体地，本实施例的培养基在使用之前均进行灭菌处理，灭菌条件为： 高压蒸汽灭菌锅、121℃、灭菌30min；并且，本实施例的上述的取样、接种 及稀释过程均在无菌环境下进行。
表3铜绿假单胞菌G12去除NO3 --N和还原Cr(VI)的性能表
Figure BDA0001865112160000181
实施例七、铜绿假单胞菌G12对不同浓度Cr(VI)的还原特性研究
研究铜绿假单胞菌G12在不同初始浓度Cr(VI)条件下的还原特性研究， 将铜绿假单胞菌G12以1％(v/v)接种于含有NO3 --N为唯一氮源的五种硝化培 养基A、B、C、D和E中，其中，A、B、C、D和E五种硝化培养基中NO3 --N 浓度均为500mg/L，C/N均为10，所含Cr(VI)的浓度分别为1、5、10、15、 20mg/L。接种后，将各培养基置于30℃、120rpm恒温振荡培养箱中连续好氧 培养72h，培养后，取废水培养液测定培养液的OD600，并于8000rpm、4℃条 件下离心10min后测定上清液中NO3 --N及Cr(VI)的含量。
结果如表3所示，在连续培养72h后，培养液中的Cr(VI)的去除率均在 85％以上，最高甚至达到99％，基本完全去除。在Cr(VI)初始浓度为0-20mg/L 条件下，铜绿假单胞菌G12均能进行正常的生长代谢活动，并且还能有效的去 除NO3 --N，其去除率均达到96％以上。菌株G12能够耐受较高浓度的Cr(VI)， 不仅能够正常生长繁殖，还能对氮素有较高的去除效果。
上述培养基配方为(每升)：KNO3 3.611g、C6H5Na3O7·2H2O 20.423g、NaCl 4g、微量元素3mL、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O调节pH至7.5；
1000mg/L的Cr(VI)标准液为：K2Cr2O7 2.8293g/L，将不同体积的1000 mg/L Cr(VI)(K2Cr2O7)加入培养基至所需的Cr(VI)浓度；
微量元素的构成均与实施例一相同，故在此不再进行赘述。
更具体地，本实施例的培养基在使用之前均进行灭菌处理，灭菌条件为： 高压蒸汽灭菌锅、121℃、灭菌30min；并且，本实施例的上述的取样、接种 及稀释过程均在无菌环境下进行。
表4铜绿假单胞菌G12对还原不同浓度Cr(VI)的性能表
Figure BDA0001865112160000191
综上，本发明提供的铜绿假单胞菌G12具有如下优点：
1、铜绿假单胞菌G12在处理含铬有机废水时，当Cr(VI)的初始浓度为 0-20mg/L，Cr(VI)的还原率可达80％-94％；
2、当上述含铬有机废水中NO3 --N的浓度为100-700mg/L，NO3 --N的去除 率可达80％-97％；
3、当上述含铬有机废水NH4 +-N的浓度为500mg/L，NH4 +-N的去除率可达 80％；
4、当上述含铬有机废水NO2 --N的浓度为500mg/L，NO2 --N的去除率约为 30％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆大学
<120> 铜绿假单胞菌及应用其处理有机废水的方法
<130> 2018.11.13
<160> SEQ ID NO.1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1407
<212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa strain G12
<400> 1
ctgcagtcga gcggatgaag ggagcttgct cctggattca gcggcggacg ggtgagtaat 60
gcctaggaat ctgcctggta gtgggggata acgtccggaa acgggcgcta ataccgcata 120
cgtcctgagg gagaaagtgg gggatcttcg gacctcacgc tatcagatga gcctaggtcg 180
gattagctag ttggtggggt aaaggcctac caaggcgacg atccgtaact ggtctgagag 240
gatgatcagt cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg 300
gaatattgga caatgggcga aagcctgatc cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggtctt 360
cggattgtaa agcactttaa gttgggagga agggcagtaa gttaatacct tgctgttttg 420
acgttaccaa cagaataagc accggctaac ttcgtgccag cagccgcggt aatacgaagg 480
gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcgcg taggtggttc agcaagttgg 540
atgtgaaatc cccgggctca acctgggaac tgcatccaaa actactgagc tagagtacgg 600
tagagggtgg tggaatttcc tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatagga aggaacacca 660
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acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg tcgactagcc gttgggatcc 780
ttgagatctt agtggcgcag ctaacgcgat aagtcgaccg cctggggagt acggccgcaa 840
ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 900
cgaagcaacg cgaagaacct tacctggcct tgacatgctg agaactttcc agagatggat 960
tggtgccttc gggaactcag acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020
atgttgggtt aagtcccgta acgagcgcaa cccttgtcct tagttaccag cacctcgggt 1080
gggcactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca 1140
tcatggccct tacggccagg gctacacacg tgctacaatg gtcggtacaa agggttgcca 1200
agccgcgagg tggagctaat cccataaaac cgatcgtagt ccggatcgca gtctgcaact 1260
cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag aatgtcacgg tgaatacgtt 1320
cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg ggttgctcca gaagtagcta 1380
gtctaaccgc aagggggacg gtaccac 1407

Claims (9)

1.一种铜绿假单胞菌G12，其特征在于，所述铜绿假单胞菌G12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述铜绿假单胞菌G12的保藏编号为CGMCC NO.15857，所述铜绿假单胞菌G12的16S rRNA的核苷酸序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列，所述铜绿假单胞菌G12在GenBank中基因序列登录号为MH266777。
2.一种应用铜绿假单胞菌G12处理含氮有机废水的方法，其特征在于，取权利要求1所述的铜绿假单胞菌G12接种于含氮有机废水中。
3.根据权利要求2所述的应用铜绿假单胞菌G12处理含氮有机废水的处理方法，其特征在于，所述含氮有机废水中含有NH4 +-N、NO3 --N或者NO2 --N中的一种或几种。
4.根据权利要求2或3所述的含氮有机废水的处理方法，其特征在于，所述含氮有机废水的温度为25～35℃。
5.一种应用铜绿假单胞菌G12处理含氮和含六价铬的有机废水的方法，其特征在于，取权利要求1所述的铜绿假单胞菌G12接种于含氮和含六价铬的有机废水中。
6.根据权利要求5所述的应用铜绿假单胞菌G12处理含氮和含六价铬的有机废水的处理方法，其特征在于，所述六价铬被还原成三价铬。
7.根据权利要求5所述的应用铜绿假单胞菌G12处理含氮和含六价铬的有机废水的处理方法，其特征在于，所述含氮和含六价铬的有机废水中初始六价铬浓度为0mg/L～20mg/L。
8.根据权利要求5所述的应用铜绿假单胞菌G12处理含氮和含六价铬的有机废水的处理方法，其特征在于，所述含氮和含六价铬的有机废水中含有NH4 +-N、NO3 --N或者NO2 --N中的一种或几种。
9.根据权利要求5～8任一项所述的应用铜绿假单胞菌G12处理含氮和含六价铬的有机废水的处理方法，其特征在于，所述含氮和含六价铬的有机废水的温度为25～35℃。
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