CN111592995B - 不动杆菌及其培养方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于污水处理技术领域，具体涉及一种不动杆菌及其培养方法和应用。所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCC NO.16620。该不动杆菌具有在有氧条件下能发挥反硝化作用的特点，采用该好氧反硝化菌株代替了常规的厌氧反硝化菌，进行污水的生物脱氮处理时，可以使硝化作用和反硝化作用在一个反应中进行，因此具有简化污水处理流程，降低基建运行成本，提高生物脱氮的效果，该不动杆菌在含氮污水处理方面具有很好的应用前景。

Description

不动杆菌及其培养方法和应用
技术领域
本发明属于污水处理技术领域，具体涉及一种不动杆菌及其培养方法和应用。
背景技术
工农业的迅速发展和人类的生产活动，给水体环境带来了严重的污染。氮超标是水体污染中最常见的一类污染问题，其会引起水体富营养化，导致藻类大量繁殖，水体溶氧降低，水体黑臭，这不仅危及人类的用水安全，还会严重影响水体的生态平衡；另外，氮排放过量还会导致氮平衡被破坏，从而造成水体失去自净功能。因此，富含氮的污水需要经过脱氮处理达标后才能排放到自然环境中。
生物脱氮是目前应用广泛的脱氮方法，有处理效果好、处理过程稳定可靠和操作管理方便等优点。传统的生物脱氮是利用硝化菌的好氧自养硝化作用和反硝化菌的厌氧异养反硝化作用共同完成，这样的生物脱氮需要分别提供有氧和无氧的两个反应器以分别进行硝化作用和反硝化作用，以达到脱氮的目的。故这样的反应器所占空间较大，运行成本较高，工艺较为繁琐。
因此，现有技术有待改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种不动杆菌及其培养方法和应用，旨在解决现有污水处理运行成本较高，工艺较为繁琐的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供一种不动杆菌，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCC NO.16620。
本发明另一方面提供一种上述不动杆菌的培养方法，包括如下步骤：
配制液体培养基，所述液体培养基中的碳氮质量比为(8-12):1；
将所述不动杆菌的菌种加入所述液体培养基中，进行摇床培养。
最后，本发明提供一种不动杆菌的应用，将本发明的上述不动杆菌和本发明的上述培养方法得到的不动杆菌用于处理含氮污水。
本发明提供的不动杆菌是一种好氧反硝化菌，该不动杆菌通过生物培养手段富集筛选得到，该不动杆菌具有在有氧条件下能发挥反硝化作用的特点，采用该好氧反硝化菌株代替了常规的厌氧反硝化菌，进行污水的生物脱氮处理时，可以使硝化作用和反硝化作用在一个反应中进行，因此具有简化污水处理流程，降低基建运行成本，提高生物脱氮的效果，该不动杆菌在含氮污水处理方面具有很好的应用前景。
本发明提供的上述不动杆菌的培养方法，工艺简单易行，只需通过液体摇床培养就可得得到大量的不动杆菌，而且在该碳氮质量比的液体培养基中进行培养具有很好的生长效果。将该培养方法得到的不动杆菌进行污水的生物脱氮处理时具有很好的生物脱氮效果，因此在含氮污水处理方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的菌种脱氮过程及其生长变化曲线。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
术语：
好氧反硝化菌：是指利用好氧反硝化酶的作用，在有氧条件下进行反硝化作用的一类反硝化菌。
城市黑臭水体：城市黑臭水体是指城市建成区内，呈现令人不悦的颜色(黑色或泛黑色)，和(或)散发出令人不适气味(臭或恶臭)的水体的统称。
一方面，本发明实施例提供了一种不动杆菌，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCC NO.16620。
本发明实施例提供的不动杆菌是一种好氧反硝化菌，该不动杆菌通过生物培养手段富集筛选得到，该不动杆菌具有在有氧条件下能发挥反硝化作用的特点，采用该好氧反硝化菌株代替了常规的厌氧反硝化菌，进行污水的生物脱氮处理时，可以使硝化作用和反硝化作用在一个反应中进行，因此具有简化污水处理流程，降低基建运行成本，提高生物脱氮的效果，该不动杆菌在含氮污水处理方面具有很好的应用前景。
具体地，该新发现的不动杆菌命名为Acinetobacter sp.A3，该菌株具有优异的好氧反硝化功能，可利用硝态氮作为唯一氮源进行新陈代谢，在有氧条件下通过反硝化作用将硝态氮转化为气态产物而达到脱氮目的。本发明实施例发现的不动杆菌从城市黑臭水体筛选到，是一种可应用于城市黑臭水体治理中的具有高效好氧反硝化能力的脱氮菌株；将该不动杆菌进行污水处理的过程中，可将分别置有硝化菌和反硝化菌的好氧反应器和厌氧反应器合并为一个同时置有硝化菌和不动杆菌的一步式好氧反应器，从而简化污水处理流程，降低基建运行成本，提高生物脱氮的效果。
另一方面，本发明实施例提供一种上述不动杆菌的培养方法，包括如下步骤：
S01：配制液体培养基，所述液体培养基中的碳氮质量比为(8-12):1；
S02：将所述不动杆菌的菌种加入所述液体培养基中，进行摇床培养。
本发明实施例提供的上述不动杆菌的培养方法，工艺简单易行，只需通过液体摇床培养就可得得到大量的不动杆菌，而且在该碳氮质量比的液体培养基中进行培养具有很好的生长效果。将该培养方法得到的不动杆菌进行污水的生物脱氮处理时具有很好的生物脱氮效果，因此在含氮污水处理方面具有很好的应用前景。
进一步地，上述步骤S01中：所述液体培养基中含有微量元素，所述微量元素包括锌、铜、锰、钴、硼和钼。具体地，所述微量元素由微量元素母液提供，所述微量元素母液包括EDTA、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、Co(NO3)2、H3BO3和Na2MoO4。
进一步地，所述液体培养基包括C4H4Na2O4、NaNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4和CaCl2。
在本发明一实施例中，该液体选择培养基包括：C4H4Na2O4，NaNO3，K2HPO4，MgSO4，FeSO4，CaCl2，微量元素母液(含有EDTA，ZnSO4，CuSO4，MnSO4，Co(NO3)2，H3BO3，Na2MoO4)。即C4H4Na2O4为碳源、NaNO3为氮源，进行液体培养基配制。在碳氮质量比(C/N)为(8-12):1时，液体培养基中进行培养具有很好的生长效果，更优选地，碳氮质量比为10:1。具体地，该液体选择培养基详细配方为：每升水中含：5.625g C4H4Na2O4·6H2O，0.607g NaNO3，1.76gK2HPO4·3H2O，0.20g MgSO4·7H2O，0.005g FeSO4·7H2O，0.02g CaCl2，0.1ml微量元素母液(微量元素母液成分为每升水中含：3.5g EDTA，2.0g ZnSO4·7H2O，1.0g CuSO4·5H2O，2.0gMnSO4·7H2O，0.9g Co(NO3)2·6H2O，1.0g H3BO3，1.0g Na2MoO4)。进一步地，所述液体培养基的pH值为7-10。该pH条件范围内，可跟好地适应本发明实施例的不动杆菌的生长。
进一步地，上述步骤S02中：所述摇床培养的温度为25-30℃。所述摇床培养的转速为120-170rpm。在上述温度和转速条件下，可得到活性更好的本发明实施例的不动杆菌。更优选地，该摇床培养为在150rpm、25℃条件下恒温振荡培养。
更进一步地，为筛选得到单菌落菌株，可用平板分离技术从上述液体摇床培养的菌液中筛选。平板分离采用的固体选择培养基是在上述液体选择培养基成分的基础上另加15g琼脂粉。
最后，本发明实施例提供一种不动杆菌的应用，将本发明实施例的上述不动杆菌和本发明实施例的上述培养方法得到的不动杆菌用于处理含氮污水。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
实施例1菌种的筛选与鉴定
(1)从净化城市黑臭水体的污水处理装置中筛选出菌种；
将采集净化城市黑臭水体的污水处理装置生物膜中的环境样本用于高效脱氮菌的富集分离。接种时，取上述环境样本0.1mL，将其加入盛有100mL液体选择培养基的250mL锥形瓶中。将接种了环境样本的锥形瓶放置在摇床中，设定摇床培养条件为150rpm、25℃恒温振荡培养。
液体选择培养基配方为每升水中含：5.625g C4H4Na2O4·6H2O，0.607g NaNO3，1.76g K2HPO4·3H2O，0.20g MgSO4·7H2O，0.005g FeSO4·7H2O，0.02g CaCl2，0.1ml微量元素母液(微量元素母液成分为每升水中含：3.5g EDTA，2.0g ZnSO4·7H2O，1.0g CuSO4·5H2O，2.0g MnSO4·7H2O，0.9g Co(NO3)2·6H2O，1.0g H3BO3，1.0g Na2MoO4)。
(2)在实验室进行富集纯化；
待上述液体选择培养基培养变浑浊后，从锥形瓶中新取1mL混合菌液接种于新的100mL液体选择培养基中继续进行相同的摇床培养，如此转接培养3次，用于富集驯化。
液体选择培养基配方为每升水中含：5.625g C4H4Na2O4·6H2O，0.607g NaNO3，1.76g K2HPO4·3H2O，0.20g MgSO4·7H2O，0.005g FeSO4·7H2O，0.02g CaCl2，0.1ml微量元素母液(微量元素母液成分为每升水中含：3.5g EDTA，2.0g ZnSO4·7H2O，1.0g CuSO4·5H2O，2.0g MnSO4·7H2O，0.9g Co(NO3)2·6H2O，1.0g H3BO3，1.0g Na2MoO4)。
(3)平板分离得到目标菌种；
将已完成3次转接培养的菌液进行系列梯度稀释，得到菌液浓度分别为原菌液浓度的10-3、10-4、10-5、10-6以及10-7倍的稀释液。分别取各浓度稀释液20μL用于在固体选择培养基上进行平板涂布操作，每个浓度的菌液涂布两个平板以相互对照。
待平板上长出菌落后，挑选出菌落进行鉴定，并测试其反硝化能力。
固体选择培养基：在上述液体选择培养基成分的基础上另加15g琼脂粉。
(4)微生物鉴定内容
本实施例的不动杆菌为革兰氏阴性菌，菌体呈稍弯或直的杆状，不形成芽孢；于固体培养基上培养得到的菌落呈圆形，且菌落为边缘透明、中心呈黄色隆起，表面光滑、湿润的形态。
本实施例的不动杆菌的16S rDNA基因序列如下所示：
SEQ ID NO.1：
GGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGATCGGCTTTTTGAGATTAGCATCCTATCGCTAGGTAGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCGCCTTCCTCCAGTTTGTCACTGGCAGTATCCTTAAAGTTCCCGACATTACTCGCTGGCAAATAAGGAAAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTATGTAAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTTACTATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTATCGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGCCTCAAAGGCCCCAACGGCTAGTAGACATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTGTTAGGCCAGATGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCATCCTCTCCCACACTCTAGCTAACCAGTATCGAATGCAATTCCCAAGTTAAGCTCGGGGATTTCACATTTGACTTAATTAGCCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAAATCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCGAGTAACGTCCACTATCTCTAGGTATTAACTAAAGTAGCCTCCTCCTCGCTTAAAGTGCTTTACAACCATAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCGGATCATCCTCTCAGACCCGCTACAGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACTTAGGCTCATCTATTAGCGCAAGGTCCGAAGATCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCATTCCTTTCGAAATGTTGTCCCCCACTAATAGGCAGATTCCTAA。
该序列长度为1282bp，在GenBank中基因序列的登录号为MK163532。将该菌的基因序列上传至GenBank中进行比对，比对结果表明：该菌的基因序列与Acinetobacter的序列相似性最高。因此，结合细菌的形态特征判断该菌株属于不动杆菌菌(Acinetobacter)，并将其命名为Acinetobacter sp.A3。
具体地，本实施例的菌株Acinetobacter sp.A3已于2018年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路，其保藏编号为CGMCC NO.16620。
实施例2菌种的好氧反硝化性能
用接种环轻微蘸取平板上所长出纯菌落后，将接种环沾有细菌的部分浸入100mL已灭菌的反硝化性能测试培养基中，从而完成菌株从固体培养基至液体培养基的转接。已接种的液体培养基盛于250mL锥形瓶内，瓶口使用仅允许气体分子交换的封口膜密封。锥形瓶置于摇床中恒温振荡培养，培养条件设为150rpm、30℃。每隔一定时间用移液枪从培养基中抽取4ml液体，将其在8000rpm的转速下离心5min(GT16-W，湘仪)后取出上清液，并测定上清液中的硝酸盐氮、亚硝酸盐氮以及氨氮的浓度。绘制浓度随时间变化的折线图，从而比较各个菌株对硝酸盐氮的降解速率、中间产物的累计量以及总氮脱除率等特性。
反硝化性能测试培养基配方具体为每升水中含：14.06g C4H4Na2O4·6H2O，0.63gNH4Cl，0.61g NaNO3，1.76g K2HPO4·3H2O，0.20g MgSO4·7H2O，0.02g CaCl2，0.005gFeSO4·7H2O，0.1mL微量元素母液(与液体选择培养基配方相同)。
硝酸盐氮的测定
本测试利用硝酸根离子在220nm波长处存在吸收，而且硝酸根浓度与吸光度在此波长处的上下一定范围内成线性关系的原理，从而测定水样中硝酸盐氮的含量。本测试方法的灵敏度为0.08mg/L，量程为0.32～4mg/L。最终结果如图1中NO3—N曲线所示。
测定步骤为：将适量待测水样转移置10ml比色管中，用去离子水定容至标线。向定容后的比色管中依次加入0.2ml盐酸溶液和10％氨基磺酸溶液，摇匀，放置15min。再将比色管中的溶液转移至光程长为10mm的石英比色皿中，在220nm处测其吸光度，测前用参比溶液(即用去离子水加了相同计量的盐酸和氨基磺酸溶液并显色后的溶液)将分光光度计调零。将所测得的吸光度带入由标准曲线得出的硝氮浓度计算公式(式2-1)计算出对应的硝酸盐氮浓度。此时，若所计算出的稀释浓度在本方法的量程内，或在量程的合理外延范围内，则直接将其乘以稀释倍数，得到的数值即为被测水样中硝酸盐氮的浓度；若计算出的稀释浓度远超出或低于本测试方法的量程，则重新调整稀释倍数，重新进行上述测试步骤，直至得出符合量程要求的稀释浓度为止。
式2-1：水样中的硝氮浓度＝6.489×A220×稀释倍数
注：式中A220为220m波长测的吸光度，硝氮浓度单位为mg/L，6.489为标准曲线的系数。
亚硝酸盐氮的测定
本测试利用了在酸性条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸和α-萘胺生成的紫红色化合物在540nm的波长处存在最大吸收峰，而且亚硝酸氮浓度在此波长的上下一定范围内与吸光度成线性关系的原理，从而用分光光度计测定水样中亚硝氮浓度。该测试方法的灵敏度为0.01mg/L，最大测量值不超过0.20mg/L。最终结果如图1中NO2—N曲线所示。
测定步骤为：将适量待测水样转移置10ml比色管中，用去离子水定容至标线。向定容后的比色管中加入0.2ml显色剂，放置20min。再将比色管中的溶液转移至光程长为10mm的石英比色皿中，在540nm处测其吸光度，测前用参比溶液(即用去离子水加了相同计量的显色剂并显色后的溶液)将分光光度计调零。将所得吸光度带入由标准曲线得出的亚硝氮浓度计算公式(式2-2)计算出对应稀释后的亚硝酸盐氮浓度，其值若超出本方法的测量上线，则增加稀释倍数并重新测试，若没有超出，则将其乘以稀释倍数，从而得到被测水样中亚硝酸盐氮的浓度。
式2-2：水样中的亚硝氮浓度＝0.37156×A540×稀释倍数
注：式中A540为540m波长测吸光度，亚硝氮浓度单位为mg/l，0.37156为标准曲线的系数。
氨氮的测定
本测试方法利用了碘化汞和碘化钾的氢氧化钠溶液与氨发生反应生成的金黄色化合物在420nm波长处由最大吸收峰，而且其吸光度在此波长上下一定范围内与氨氮含量成线性关系的原理，从而计算出待测水样中氨氮的含量。本测试方法的灵敏度为0.025mg/L，最大测量值不超过2mg/L。最终结果如图1中NH4—N曲线所示。
测定步骤为：将适量待测水样转移置10ml比色管中，用去离子水定容至标线。向定容后的比色管中依次加入0.2ml酒石酸钾钠溶液和0.3ml纳氏试剂，放置10min。再将比色管中的溶液转移至光程长为10mm的石英比色皿中，在420nm处测其吸光度，测前用参比溶液(即去离子水加了0.2ml酒石酸钾钠溶液和0.3ml纳氏试剂并显色后的溶液)将分光光度计调零。将所得吸光度带入由标准曲线得出的氨氮浓度计算公式(式2-3)计算出对应稀释后的氨氮浓度，其值若超出本方法的测量上线，则增加稀释倍数并重新测试，若没有超出，则将其乘以稀释倍数，从而得到被测水样中氨氮的浓度。
式2-3：水样中的氨氮浓度＝6.512×A420×稀释倍数
注：式中A420为420m波长测的吸光度，氨氮浓度单位为mg/l，6.512为标准曲线的系数。
从图1的NO3—N曲线、NO2—N曲线和NH4—N曲线可知，在好氧条件下，菌种不断生长(OD600代表培养液中菌种浓度)，培养液中NO3-N浓度随之下降，同时反硝化中间产物NO2-N浓度不断增加并趋于平衡，菌种表现出了良好的反硝化作用，而NH4—N曲线下降，是菌体生长的同化作用。因此，随着菌种的曲线生长，该菌种具有很好的生物脱氮效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中电建水环境治理技术有限公司
<120> 不动杆菌及其培养方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1282
<212> DNA
<213> 不动杆菌(Acinetobacter)
<400> 1
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tcgcttaaag tgctttacaa ccataaggcc ttcttcacac acgcggcatg gctggatcag 1020
gcttgcgccc attgtccaat attccccact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc 1080
tcagtcccag tgtggcggat catcctctca gacccgctac agatcgtcgc cttggtaggc 1140
ctttacccca ccaactagct aatccgactt aggctcatct attagcgcaa ggtccgaaga 1200
tcccctgctt tctcccgtag gacgtatgcg gtattagcat tcctttcgaa atgttgtccc 1260
ccactaatag gcagattcct aa 1282

Claims (10)

1.一种不动杆菌（Acinetobacter），其特征在于，所述不动杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且所述不动杆菌的保藏编号为CGMCC NO. 16620；所述不动杆菌利用硝态氮作为唯一氮源。
2.根据权利要求1所述的不动杆菌，其特征在于，所述不动杆菌的16S rDNA的核苷酸序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列。
3.一种权利要求1或2所述的不动杆菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
配制液体培养基，所述液体培养基中的碳氮质量比为（8-12）:1；
将所述不动杆菌的菌种加入所述液体培养基中，进行摇床培养。
4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基中含有微量元素，所述微量元素包括锌、铜、锰、钴、硼和钼。
5.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述微量元素由微量元素母液提供，所述微量元素母液包括EDTA、ZnSO4、CuSO4、MnSO4、Co(NO3)2、H3BO3和Na2MoO4。
6.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基包括C4H4Na2O4、NaNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4和CaCl2。
7.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基的pH值为7-10。
8.如权利要求3-7任一项所述的培养方法，其特征在于，所述摇床培养的温度为25-30℃。
9.如权利要求3-7任一项所述的培养方法，其特征在于，所述摇床培养的转速为120-170rpm。
10.一种不动杆菌的应用，其特征在于，将权利要求1或2所述的不动杆菌和/或权利要求3-9任一项所述的培养方法得到的不动杆菌用于处理含氮污水。
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