CN113699060B - 耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌及其应用 - Google Patents

耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了耐低碳高氮的异养硝化‑好氧反硝化鞘氨醇盒菌及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021682，命名为鞘氨醇盒菌Sphingopyxissp.CY‑10。该菌株可以在低C/N条件下去除高浓度氨氮，并首次发现其具有异养硝化‑好氧反硝化功能，在低C/N和高氨氮环境下均能保持较高活性，可用于养殖沼液、高速服务区废水和分散式污水等的生物处理，有望在极端环境生物脱氮领域取得新的突破。

Description

耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌及其应用
技术领域
本发明涉及环境微生物领域，具体涉及耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌， 还涉及耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化菌的应用。
背景技术
水体中氨氮超标会引起水体富营养化，导致水质恶化，不仅会对鱼类及水生生物产生毒 害作用，而且严重危害生态平衡及人体健康。生物脱氮法由于其经济、高效、无二次污染等 特点，被广泛应用于氨氮废水的处理。传统的生物脱氮过程包括好氧硝化和厌氧反硝化，需要自养硝化菌和厌氧反硝化菌在两个反应器中进行，导致其脱氮工艺流程长。且高浓度氨氮 废水中含有的大量游离氨会抑制自养硝化菌的生长代谢，使得传统的脱氮微生物处理高氨氮 废水时耐受性差，处理效率低。因此，开发新型生物脱氮工艺对于高氨氮废水的低耗高效处 理具有重要意义。
近些年来，有研究者从环境中发现了异养硝化-好氧反硝化菌，这类微生物能够在好氧条 件下同时进行硝化和反硝化，且生长速度快，氨氮耐受浓度高。当前国内关于鞘氨醇盒菌的 异养硝化-好氧反硝化功能还未有报道。且当前已报导的异养硝化-好氧反硝化菌在脱氮过程 中需要较高的C/N，往往需要外加碳源，使得成本增加。因此，亟需一种能够在低C/N下、耐受高氨氮浓度的异养硝化-好氧反硝化菌株用于废水处理。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌； 本发明的目的之二在于提供所述耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌在处理降解 氨氮中的应用；本发明的目的之三在于提供所述耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒 菌在处理氨氮废水中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌，所述异养硝化-好氧反硝化菌分类命 名为鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021682。
本发明优选的，所述鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10的16S rDNA序列如SEQID NO.1 所示。
本发明优选的，所述异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌耐受氨氮浓度为3000mg/L。
本发明优选的，所述异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌耐受C/N最低为1。
2、所述耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌在处理降解氨氮中的应用。
3、所述耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌在处理氨氮废水中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开的鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10，可以在低碳 氮比条件下有效去除氨氮、总氮和COD；且菌体生长速度快，去除速率高。特别适用于低碳 废水中高浓度氨氮的降解，可以广泛推广，是当前唯一发现的具有异养硝化-好氧反硝化功能 的鞘氨醇盒菌。本发明解决了现有技术中异养菌脱氮对C/N需求高的问题。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10的生长曲线；
图2为鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10的系统发育树及革兰氏染色照片；
图3为鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10在不同C/N条件下对氨氮和总氮的降解效果曲 线图；
图4为鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10在降解不同浓度氨氮的效果曲线图。
菌种保藏
本发明中鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10是从重庆巴南区重庆木犴生猪养殖场沼液废 水中分离得到的菌株，送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M2021682，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2021年6月7日，分类命名为鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明使用的实验材料如下：异养硝化好氧反硝化选择培养基的组成如下：C6H5Na3O7·2H2O 2g/L；0.2g/L；(NH4)2SO4 1.5g/L；维氏盐溶液50ml/L，去离子水1L。
LB培养基的组成如下：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水1L。
其中异养硝化好氧反硝化选择固体培养基和LB固体培养基可在如上所述的液体培养基 中加入20g/L的琼脂进行制备。
平板：90mm的玻璃培养皿。
其余试剂为市售分析纯产品。
实施例1、菌种富集与优化
1)富集培养：取重庆巴南区重庆木犴生猪养殖场沼液水样2ml，接种至装有100mlLB 培养基的250ml锥形瓶中，放入摇床设定30℃，160r/min；培养72h后按2％接种至同样装有100ml LB培养基的250ml锥形瓶中，传代培养2次，得到富集菌液。
2)传代驯化：取富集菌液2ml，接种至装有100ml异养硝化好氧反硝化选择培养基的 250ml锥形瓶中，放入摇床设定30℃，160r/min，每24h检测培养瓶中OD600、NH4 +-N、TN， 传代培养3次，得到脱氮效果稳定的混合菌群。
3)纯菌分离：用已冷却的无菌蒸馏水对混合菌液进行10倍系列稀释，制成稀释度为10-1、 10-2、10-3的稀释液。采用倾注法进行异养硝化好氧反硝化选择固体培养基培养。将选择固体 培养基置于生化培养箱中，30℃培养3d，将长势好(形成单菌落)的菌种进行多次传代，纯 化得到纯菌，命名为鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp CY-10，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏编号为CCTCC NO:M 2021682，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2021年6月7 日。
4)菌种优化：利用纯菌株制备菌悬液，加入到装有100ml异养硝化培养基的250ml锥 形瓶中，放入摇床设定30℃、160r/min条件下振荡培养，每隔24h检测菌液浓度(OD600)，鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10的生长曲线如图1所示。
实施例2、菌种鉴定
委托四川擎科公司完成筛选菌株的16SrDNA测序。测序后获得菌株的16S rDNA序列， 根据结果，在NCBI中进行Blast比对鉴定，选取与目地基因序列同源性相近的菌种，用MEGA 7.0软件，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树。
鉴定结果显示：该菌属革兰氏阴性菌，菌落直径2-4mm，好氧，表面湿润，有光泽，不透明。鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10的16S rDNA的测序如SEQ ID NO.1所示，碱基序列在GenBank核酸序列数据库进行比较发现与鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.的菌株SAS22、T2、 SM 105序列相似，鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10系统发育树见图2。
实施例3、鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10在不同C/N下对氨氮降解效果
分别配置C/N为1、2、4、6、8、10、20的异养硝化好氧反硝化选择培养基，一式三份，将上述培养基于121℃条件下高温灭菌，待冷却后于超净台接种2ml鞘氨醇盒菌CY-10菌液，盖好胶塞摇匀，放入摇床设定于30℃、160转/min条件下培养，每隔24h检测菌液浓度(OD600)、 氨氮(NH4 +-N)、总氮(TN)浓度。氨氮的检测方法为纳氏试剂分光光度法，比色皿及波长 分别为20mm玻璃比色皿和420nm。检测过程中所用试剂为纳氏试剂及酒石酸钾钠。总氮的检测方法为碱性过硫酸钾分光光度计法，比色皿及光程分别为10mm石英比色皿，220nm波 长和275nm波长。检测中所用试剂为碱性过硫酸钾和1+9盐酸。Sphingopyxis sp.CY-10在不 同C/N下对氨氮和总氮降解效果如图3所示。由图3可知，鞘氨醇盒菌Sphingopyxissp.CY-10 在C/N为1-20时，对氨氮和总氮有一定去除率，且生长状况较好。
实施例4、鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10对不同浓度氨氮的降解效果
分别配制氨氮浓度为300mg/L、500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、3000mg/L的异养硝化好氧反硝化培养基。接种2ml鞘氨醇盒菌CY-10菌液，放入摇床设定30℃、160转/min条件下培养，每隔24h检测菌液浓度(OD600)、氨氮(NH4 +-N)、总氮(TN)浓度。 不同浓度氨氮降解效果见图4，结果显示，鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.CY-10对浓度高达 3000mg/L的氨氮具有较好的降解效果。
综上可以看出，本发明从重庆巴南区重庆木犴生猪养殖场废水中筛选得到的鞘氨醇盒菌 具有异养硝化好氧反硝化功能。不仅对氨氮浓度具有高耐受性，又可以在低C/N条件下去除 高浓度氨氮，在高氨氮、低C/N条件下能保持较高活性。鞘氨醇菌独特的降解特性有望在低 碳高氮废水处理的工程应用领域取得新的突破。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限 于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范 围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 重庆理工大学
<120> 耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1391
<212> DNA
<213> 鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis sp)
<400> 1
gcgcgcgtat cccgtggtag cttcctccct tgcgggttag agcactgcct tcgggtgaaa 60
ccaactccca tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcctg ggaacgtatt caccgcggca 120
tgctgatccg cgattactag cgattccgcc ttcatgctct cgagttgcag agaacaatcc 180
gaactgagac ggcttttgga gattagctac ctctcgcgag gttgctgccc actgtcaccg 240
ccattgtagc acgtgtgtag cccagcgcgt aagggccatg aggacttgac gtcatcccca 300
ccttcctccg gcttatcacc ggcagtttcc ttagagtgcc caacttaatg atggcaacta 360
gggatgaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga 420
cagccatgca gcacctgtca ctgatccagc cgaactgaag gaaaccatct ctggtaaccg 480
cgatcaggat gtcaaacgct ggtaaggttc tgcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct 540
ccaccgcttg tgcaggcccc cgtcaattcc tttgagtttt aatcttgcga ccgtactccc 600
caggcggata acttaatgcg ttagctgcgc cacccaagtt ctatgaaccc ggacagctag 660
ttatcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt 720
cgcacctcag cgtcaatact tgtccagtca gtcgccttcg ccactggtgt tcttccgaat 780
atctacgaat ttcacctcta cactcggaat tccactgacc tctccaagat tctagttttc 840
cagtttcaaa ggcaattccg gggttgagcc ccgggctttc acctctgact taaaaaaccg 900
cctacgcgcg ctttacgccc agtaattccg aacaacgcta gctcccctcg tattaccgcg 960
gctgctggca cgaagttagc cggagcttat tctcccggta ctgtcattat catcccgggt 1020
aaaagagctt tacaacccta gggccttcat cactcacgcg gcattgctgg atcaggcttt 1080
cgcccattgt ccaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt 1140
cccagtgtgg ctgatcatcc tctcagacca gctaaggatc gtcgccttgg tgagctttta 1200
cctcaccaac tagctaatcc tacgcgggct catccttggg cgataaatct ttggtccgaa 1260
gacattatac ggtattagca caaatttctc tgagttattc cgtacccaag ggcagattcc 1320
cacgcgttac gcacccgtgc gccactagat ccgaagatct cgtcgactgc aggtagcagc 1380
cccccaaacc c 1391

Claims (3)

1.耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌(Sphingopyxis sp.)，其特征在于：所述异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌分类命名为鞘氨醇盒菌(Sphingopyxissp.)CY-10，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021682。
2.权利要求1所述耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌在处理降解氨氮中的应用。
3.权利要求1所述耐低碳高氮的异养硝化-好氧反硝化鞘氨醇盒菌在处理氨氮废水中的应用。
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