JP3861126B2 - ステロイド骨格含有化合物分解菌 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ステロイド骨格を有する化合物を分解することができる、新規なNovosphingobium属に属する菌株、及びその利用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、社会的な問題となっている内分泌攪乱化学物質、いわゆる環境ホルモンは、体内の天然ホルモンの作用を攪乱することによって生体に悪影響を及ぼすと考えられている。この攪乱物質の多くが難生分解性であり、市民生活において極めて身近に存在することから大変深刻な社会問題となっている。
【０００３】
環境ホルモンには水圏生態系に悪影響を及ぼすものも知られており、例えば多摩川に生息している鯉のメス化現象は河川水に含まれるノニルフェノール（NP）及びエストラジオールが主原因ではないか、とする説が有力になっている（朝日新聞 ２００１年７月６日）。
【０００４】
水生生物に対して内分泌攪乱作用を示す天然エストロゲンの中でも最も強力な作用を有するものはエストラジオールであり、エストラジオールは人及び家畜の排泄物から抱合体（不活性型）として排出されるが、下水中の微生物によって脱抱合されて活性型に戻ることが知られている。
また、人畜が排出する１７β−エストラジオール（以下、本明細書において「Ｅ２」と記載した場合は、１７β−エストラジオールのことを意味する）等も、エストロゲン（女性ホルモン）活性を有するため、水生生物（魚類、両生類等）の生殖機能に影響を与えることが判明している。
【０００５】
そして、エストラジオール類の化合物の１種である、１７α−エチニルエストラジオールは合成卵胞ホルモンの一種であり、従来より避妊薬（ピル）として用いられている。低容量ピルが最近、正式に認可されたことから、今後ピルの使用が飛躍的に上昇することが考えられ、それとともに、ピルに含まれるエストラジオールの廃棄量も増加することが考えられる。
【０００６】
このようなエストロゲンは、都市部での人口増加及び畜産業の規模拡大化によって、最近においては全国の河川から高頻度に検出されており、環境省も産業由来内分泌攪乱化学物質とともに、その環境動態を詳しく調査すべき「要監視物質」として取り扱っている。
【０００７】
上述したように、Ｅ２等のエストロゲンは難生分解性であり、また生殖器官に異常を発生する生物学的影響等も報告されており、従って、バイオレメディエーションに応用できる、新規なエストロゲン（ステロイド骨格を有する化合物）分解菌を単離及び同定することが望まれていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ステロイド骨格を有する化合物を分解することができる、新規な微生物を単離及び同定することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、東京都における汚水処理プラントの活性汚泥中に顕著なステロイド骨格含有化合物分解活性が観察されることを見だした。今回、本発明者らは、新規なステロイド骨格含有化合物分解菌（ＡＲＩ−１^Tと命名）を単離することに成功した。さらに、この単離したステロイド骨格含有化合物分解菌の特徴を分析した結果、この菌が新種の菌であるという知見を得た。本発明は、上記知見に基づいてなされなものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、ステロイド骨格含有化合物を分解することができるNovosphingobium属に属する菌株を提供するものである。なお、ステロイド骨格含有化合物としては、例えばエストラジオール、エストロン、エストリオール等が挙げられる。
本発明の菌株の好ましい具体例としては、ステロイド骨格含有化合物を二酸化炭素に分解するものであり、グルコース、アラビノース、マンノース、マンニトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、マルトース、グルコン酸、アジピン酸及びリンゴ酸からなる群からなる化合物を同化しない菌株である。すなわち、本発明の好ましい菌株としては、ステロイド骨格含有化合物（例えば、エストラジオール、エストロン、エストリオール等）以外の多くの炭素源を資化せず、ステロイド骨格含有化合物のみを特異的に資化する菌株である。
【００１１】
本発明の菌株の好ましい具体例としては、カタラーゼ及びニトレートレダクターゼの酵素活性が陽性で、β−グルコシダーゼ、ゼラチナーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの酵素活性が陰性である菌株である。
本発明の菌株の好ましい具体例としては、グラム陰性、好気性、桿状の細菌であり、コロニーが円形、凸状、不透明かつ淡褐色であり、２５℃で生育できるが、４℃又は４２℃では生育できない菌株である。
【００１２】
本発明の菌株の好ましい具体例としては、ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量が約６１％である菌株である。本発明の菌株の好ましい具体例としては、主要な非極性脂肪酸が１８：１であり、主要な２−ヒドロキシ脂肪酸が１４：０ ２−ＯＨであり、３−ヒドロキシ脂肪酸は存在せず、主要なイソプレノイドキノンはユビキノンＱ−１０である菌株である。本発明の菌株の好ましい具体例としては、唯一の炭素源としてエストラジオールを含む培地を用いたスクリーニングにより単離される菌株である。本発明の菌株の好ましい具体例としては、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９２４を有する菌株である。
【００１３】
また、本発明は、上述の本発明のNovosphingobium属に属する菌株を用いることを特徴とする、ステロイド骨格含有化合物分解方法を提供するものである。
また、本発明は、上述の本発明のNovosphingobium属に属する菌株を用いることを特徴とする、廃水処理方法を提供するものである。
また、本発明は、上述の本発明のNovosphingobium属に属する菌株を用いることを特徴とする、ステロイド骨格含有化合物を分解するためのバイオリアクターを提供するものである。該バイオリアクターは、排水処理用として好適に用いられる。
【００１４】
また、本発明は、上述の本発明のNovosphingobium属に属する菌株を用いることを特徴とする、ステロイド骨格含有化合物を検出するためのバイオセンサを提供するものである。
また、本発明は、唯一の炭素源としてエストラジオールを含む培地を用いてスクリーニングを行うことを特徴とする、ステロイド骨格含有化合物を分解することができる、Novosphingobium属に属する菌株のスクリーニング方法を提供するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
先ず、本発明のNovosphingobium属に属する菌株について説明する。本発明のNovosphingobium属に属する菌株は、ステロイド骨格含有化合物を分解することのできる菌株であり、以下、本明細書において「ステロイド骨格含有化合物分解菌」ともいう。本発明において、ステロイド骨格含有化合物とは、ステロイド骨格を含有する有機化合物全てを含む概念であり、例えばエストラジオール、エストロン、エストリオール等の化合物を意味する。エストラジオール、エストロン、エストリオールの化学構造を以下に示す。
【００１６】
【化１】

【００１７】
本発明の菌株は、Novosphingobium属に属する菌株であり、本発明者らが単離した一例の菌株（ＡＲＩ−１^T）は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９２４として寄託されている。上記菌株は、東京の汚水処理プラントの活性汚泥から単離されたものである。ＡＲＩ−１^T株の分離のために、０．１質量％の１７β−エストラジオール（以下、本明細書において「Ｅ２」ともいう）を含むＹＮＢ寒天（pH7.0;25℃）（Ｅ２−ＹＮＢ培地）を使用した。
後述する実施例に詳述する通り、得られた微生物の菌学的性質を調べ、新規微生物であることを確認した。得られた菌株の菌学的性質を以下に示す。
【００１８】
〔１〕形態学的性質
（１）細胞の形：桿状
（２）大きさ：長さ１．２μｍ；直径０．８μｍ
（３）グラム染色：陰性
【００１９】
〔２〕生育状態
コロニーは円形、凸状、不透明かつ淡褐色である。
〔３〕生理学的性質
（１）生育温度：２５℃で生育できるが、４℃又は４２℃では生育できない。
（２）酸素要求性：好気的
（３）資化性：エストラジオール、エストロン、エストリオールを同化するが、グルコース、アラビノース、マンノース、マンニトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、マルトース、グルコン酸、アジピン酸及びリンゴ酸を同化しない。
【００２０】
（４）カタラーゼ及びニトレートレダクターゼの酵素活性は陽性である。
（５）β−グルコシダーゼ、ゼラチナーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの酵素活性は陰性である。
（６）ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量は約６１％である。
（７）主要な非極性脂肪酸は１８：１であり、主要な２−ヒドロキシ脂肪酸は１４：０ ２−ＯＨであり、３−ヒドロキシ脂肪酸は存在しない。主要なイソプレノイドキノンはユビキノンＱ−１０である。
【００２１】
本発明のステロイド骨格含有化合物を分解することができるNovosphingobium属に属する菌株は、汚水処理プラントの活性汚泥等から、例えば０．１質量％のＥ２を含むＹＮＢ寒天（pH7.0;25℃）（Ｅ２−ＹＮＢ培地）を使用してスクリーニングすることにより単離することができる。Ｅ２を含むＹＮＢ培地は、唯一の炭素源としてＥ２を含む培地である。単離された菌株は、Ｅ２を検出するＨＰＬＣ等の常用手段を用いて培養液を経時的に分析することによって、Ｅ２分解活性を検出することができる。
【００２２】
本発明のステロイド骨格含有化合物を分解することができる菌株を培養するための培地としては、通常、これらの菌株が生育することのできるものであれば、天然培地であっても合成培地であってもよく、いずれも使用することができる。また、培地は固体培地、液体培地のいずれでもよい。用いられる培地には、炭素源、窒素源及び無機物などが含まれる。炭素源としては、エストラジオールが好ましく用いられ、その他の各種炭化水素が含まれていてもよい。窒素源としては、例えば酵母エキス、肉エキス、ペプトン、各種のアミノ酸等の有機窒素類、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素等が挙げられる。炭素源、窒素源、いずれも単独で用いてもよく、又は２種以上を混合して用いてもよい。その他の無機物としては、例えばカリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、カルシウム塩等を必要に応じて適宜使用する。本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌の培養方法としては、通常の方法でよく、例えば培養温度は１５〜３５℃が好ましく、２０〜３０℃が更に好ましい。また、培地のｐＨは６〜８とすることが好ましく、７付近であることが更に好ましい。また、培養は振盪培養を行うか、又は通気撹拌を行い、好気条件下で行うことが好ましい。
【００２３】
次に、本発明のステロイド骨格含有化合物分解方法について説明する。
本発明のステロイド骨格含有化合物分解方法は、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を用いることを特徴とする。具体的には、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を、エストラジオール、エストロン、エストリオール等のステロイド骨格含有化合物を含む処理対象（例えば、下水、畜産廃水、井戸水、水道水等）に接触させ、上記分解菌の作用により処理対象物中のステロイド骨格含有化合物を分解し、無毒化する。
【００２４】
次に、本発明の排水処理方法について説明する。
本発明の排水処理は、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を用いることを特徴とする。具体的には、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を、エストラジオール、エストロン、エストリオール等のステロイド骨格含有化合物を含む排水（例えば、下水、畜産排水、井戸水、水道水など）に接触させ、上記分解菌の作用により処理対象物中のステロイド骨格含有化合物を分解し、無毒化する。
【００２５】
次に、本発明のバイオリアクターについて説明する。
本発明のバイオリアクターは、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を用いることを特徴とする。具体的には、本発明のバイオリアクターは、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を担体に固定化し、ステロイド骨格含有化合物分解菌固定化担体を得、環境水等の処理対象物を通液するタンク内に、上記ステロイド骨格含有化合物分解菌固定化担体を設置することによって製造することができる。なお、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌が本来の活性を損なわないようにしつつ、動かないように固定することが必要である。また、制御装置、ポンプ、各種センサー等を設置してもよい。用いられる担体としては、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を固定化することができるものであれば、どのようなものであってもよい。用いられる担体としては、例えばアルギン酸、ポリビニルアルコール、ゲランガム、アガロース、セルロース、デキストラン等のゲル状物質や、ガラス、活性炭、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、木材、シリカゲル等の担体が挙げられる。ステロイド骨格含有化合物分解菌を固定化する方法としては、アルギン酸、ポリビニルアルコール、ゲランガム、アガロース、セルロース、デキストラン等のゲル状物質に包括固定する方法、ガラス、活性炭、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、木材、シリカゲル等の担体に吸着固定する方法が挙げられる。
【００２６】
本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を担体に固定化する方法について簡単に説明すると、例えば菌株の培養液を担体に流し込むことにより固定化する固定法、アスピレーターを用いて担体を減圧下にし、菌株の培養液を流し込むことにより固定化する固定法、菌株の培養液を滅菌した培地と担体との混合物に流し込み、振盪培養を行った後、上記混合物から取り出した担体を自然乾燥する方法等が挙げられる。
【００２７】
本発明のバイオリアクターは、例えば廃水処理用として用いられる。このような排水処理は、例えば回分式、半回分式、連続式等の方法により行うことができる。排水処理は、処理対象物となる排水の温度を、好ましくは１５〜３５℃の温度、更に好ましくは２０〜３０℃の温度に調整して処理を行う。
【００２８】
次に、本発明のバイオセンサについて説明する。
本発明のバイオセンサは、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を用いることを特徴とする。具体的には、本発明のバイオセンサは、本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を固定化した担体と、例えば酸素電極とを組み合わせて製造される。
【００２９】
ステロイド骨格含有化合物を固定化する担体としては、ニトロセルロース膜等の膜が用いられる。また、アルギン酸カルシウムゲル等のゲルを用いることもでき、この場合には耐久性に優れるとともに、微生物担持ゲルをガラス管内に重点することによりユニット化することができるという利点もある。
本発明のステロイド骨格含有化合物分解菌を担体に固定化する方法については、バイオリアクターの説明において記載したのと同様の方法でよい。
【００３０】
本発明のバイオセンサは、排水（例えば、下水、畜産排水、井戸水、水道水など）中のエストラジオール、エストロン、エストリオール等のステロイド骨格含有化合物の含有量を測定するために用いられる。具体的には、本発明のバイオセンサと、該バイオセンサを一定の温度に保温することのできる恒温槽と、バイオセンサにおける酸素電極の電流の変化を測定する電圧電流計と、測定された電流の変化を記録するための記録計とを備えた装置とし、ステロイド骨格含有化合物分解菌がステロイド骨格含有化合物を分解する時に消費する酸素濃度を測定することにより、排水中のステロイド骨格含有化合物の含有量の測定が可能となる。
【００３１】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
ステロイド骨格含有化合物分解菌の単離
東京都の汚水処理プラント（ＳＴＰ）の活性汚泥からステロイド骨格含有化合物分解菌を単離した。活性汚泥からのステロイド骨格含有化合物分解菌の単離のためには、０．１質量％のＥ２を含むＹＮＢ培地（以下、Ｅ２−ＹＮＢ培地という）を使用した。Ｅ２は和光純薬工業（株）から購入したものを用いた。ＹＮＢ培地は、Difco Manualに記載されている通り、窒素源としての（NH₄）₂SO₄、他の塩（KH₂PO₄、MgSO₄、NaCl及びCaCl₂）、微量の金属及び少量のビタミンを含んでいる。従って、Ｅ２−ＹＮＢ培地には、Ｅ２以外の炭素源は存在せずＥ２がＥ２−ＹＮＢ培地における唯一の炭素源であると考えられる。
【００３２】
活性汚泥を上記Ｅ２−ＹＮＢ培地に接種した。サンプルが液体の場合には１００μｌのサンプルを直接Ｅ２−ＹＮＢ寒天培地に接種した（サンプル量：30mg/ml）。サンプルが沈殿の場合には、接種前に１０ｇのサンプルを１０ｍｌのＹＮＢ培地に懸濁させ、この懸濁液を、上記のようにＥ２−ＹＮＢ培地に接種した。
【００３３】
次いで、サンプルを接種した培地を１５０ｒｐｍで回転しながら２５℃で１４日間培養した。培養終了後、培養物を１２０ｍｌのメタノールと混合し、０．２μｍのポアサイズのフィルター（Millex LG13,ミリポア製）を用いてろ過した。ろ液をMightysil RP-18GPオクタデシルシリルカラム（内径：４．６ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ）を有するＨＰＬＣシステムで分析を行い、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定することにより、Ｅ２の分解活性を分析した。すなわち、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収の減少によりＥ２の分解活性を確認した。なお、移動相としては８０％メタノール水を用いた。
【００３４】
分析の結果、１つのサンプルがＥ２分解活性を有することが示された。このサンプルは１４日間で６０％のＥ２を分解した。Ｅ２分解菌を分離するため、この寒天培地に増殖した微生物を３回継代培養した。継代培養は栄養寒天培地にて画線培養を行った。培養は２５℃の温度で行い、小さい白褐色のコロニーをひろい、これをＡＲＩ−１^Tと命名した。このＡＲＩ−１^Tは独立行政法人産業技術総合研究所特許生物センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９２４として寄託されている。
【００３５】
実施例２
ＡＲＩ−１ ^T 株による、各種ステロイド骨格含有化合物の分解活性
ＡＲＩ−１^Tのステロイド骨格含有化合物分解活性について、単一コロニーを、エストラジオール、エストロン、エストリオールを含むＹＮＢ寒天培地に接種し、エストラジオール、エストロン、エストリオールを分解するかどうかを調べた。エストラジオール、エストロン、エストリオールの培地中の濃度は、１０ｍｇ／３０ｍｌとした。エストラジオール、エストロン、エストリオールは、いずれも和光純薬工業（株）より購入したものを用いた。培養は、２５℃の温度で行った。培養初日、培養１０日後及び２０日後に、培養物を１２０ｍｌのメタノールと混合し、０．２μｍのポアサイズのフィルター（Millex LG13,ミリポア製）を用いてろ過した。ろ液をMightysil RP-18GPオクタデシルシリルカラム（内径：４．６ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ）を有するＨＰＬＣシステムで分析を行い、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定することにより、エストラジオール、エストロン、エストリオールの分解活性を分析した。すなわち、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸収の減少によりエストラジオール、エストロン、エストリオールの分解活性を確認した。なお、移動相としては８０％メタノール水を用いた。
【００３６】
結果を図１に示す。図１は、ＡＲＩ−１^T株による各種のステロイド骨格含有化合物の分解の時間経過を示すグラフである。図１のグラフにおいて、白丸はエストロン、三角はエストラジオール、四角はエストリオールの分解の時間経過である。図１に示すように、エストロンは１０日培養後には約１０％が分解され、２０日培養後には約５０％が分解された。エストラジオールは、１０日培養後に約７５％が分解され、２０培養後には約８５％が分解された。エストリオールは、１０日培養後に約９０％が分解され、１０日分解後には約９５％が分解された。
【００３７】
実施例３
エストラジオール濃度によるエストラジオール分解活性
培地中のエストラジオールの初濃度を、３０、１０及び５ｍｇ／３０ｍｌとした以外は、実施例２と同様に培養を行い、初濃度が３０ｍｇ／３０ｍｌのものについては、０日目から１０日置きに５０日目まで分解活性を測定し、初濃度が１０ｍｇ／３０ｍｌ濃度のものについては、０日目から５日おきに２５日目まで、初濃度が５ｍｇ／３０ｍｌ濃度のものについては、０日目から４日置きに２０日目まで分解活性を測定した。分解活性の測定は実施例１と同様に行った。
【００３８】
結果を図２に示す。図２は、ＡＲＩ−１^T株による、エストラジオール分解活性の分解の時間経過を示すグラフである。図２において、白丸は初濃度が３０ｍｇ／３０ｍｌ濃度、二重丸は初濃度が１０ｍｇ／３０ｍｌ濃度、黒丸は初濃度が５ｍｇ／３０ｍｌ濃度の場合の結果を示す。図２から明らかなように、初濃度が５ｍｇ／３０ｍｌの場合は２０日でほぼ全てが分解され、１０ｍｇ／３０ｍｌの場合は２５日で約９０％が分解され、３０ｍｇ／３０ｍｌ濃度の場合は５０日で約９０％が分解された。
【００３９】
実施例４
代謝産物の分析
ＡＲＩ−１^TによるＥ２の代謝産物を以下のようにして調べた。すなわち、ＡＲＩ−１^Tの培養を、１０ｍｇ／３０ｍｌのＥ２を含有するＹＮＢ寒天培地を用いて行い、０日、５日、１０日、１５日、２０日及び２５日培養後の代謝産物を分析した。分析は以下のように行った。
【００４０】
培養物をヘキサン又はクロロホルムを用いて抽出した。ヘキサン又はクロロホルムを用いたのは、それらが異なるオクタノール−水分配係数を有しており、それらが疎水性の指標として用いられるからである。抽出物をVarian3800ガスクロマトグラフ−質量スペクトル（ＧＣＭＳ）により分析した。分析条件は以下の通りである。
カラム：ＢＰＸ−５キャピラリーカラム（内径：２５ｍ×０．２２ｍｍ、ＳＧＥから購入）
注入量：３μｌ
キャリアーガス：ヘリウム（１．０ｍｌ／分）
温度勾配：５０℃で３．４分、５０〜３７０℃で１０℃／分、３７０℃で１０分。
また、電子衝撃イオン化のイオン化エネルギーは７０ｅＶであった。
【００４１】
図３に、０日及び３０日培養物のクロロホルム抽出物の全イオンガスクロマトグラムを示す。図３は、培養物のクロロホルム抽出物の全イオンクロマトグラムである。図３において、（Ａ）は０日培養物、（Ｂ）は３０日培養物のクロロホルム抽出物の全イオンクロマトグラムである。図３に示すように、０日、３０日培養物のいずれにおいても、Ｅ２のピークのみが検出され、代謝産物と考えられるピークはいっさい検出されなかった。また、培養が進むにつれ、ピークの減少が観察された。
【００４２】
次に、¹H-NMRを用いてＥ２の代謝運命について検討した。ＧＣＭＳに用いた試料（０日培養物及び３０日培養物）を２５℃の温度の下で濃縮乾固し、重メタノール(CD₃OD)に再溶解したものを試料として測定した。測定は、JEOL JNM-EX400 NMRスペクトロメーターを用い、400MHZにおいて5mmの直径の試験管に入れたサンプル溶液を用いて測定した。測定の結果を図４に示す。図４は、培養物のクロロホルム抽出物のNMRスペクトルであり、(a)は０日培養物、(b)は３０日培養物のNMRスペクトルであり、(c)はＥ２の化学構造を示す。図に示すように、３０日培養物においては、Ｅ２の芳香族及び非芳香族部分のプロトンのシグナルがほとんど完全に消失していた。このことから、Ｅ２の代謝産物は、二酸化炭素や有機酸等の低分子量化合物にまで分解されていることがわかる。
【００４３】
実施例５
形態学的特性
ＡＲＩ−１^Tを透過型電子顕微鏡により観察した。電子顕微鏡写真の作製において、３日間培養した細胞を遠心分離して集め、生理食塩水にて洗浄した後、formvarでコーティングしたグリッドに細胞を載せ、オスミウム蒸気により数分間固定を行った。次いで、グリッドを蒸留水で洗浄した後、酢酸ウラニル溶液でネガティブに染色し、Hitachi H-300透過型電子顕微鏡で観察を行った。グラム染色は、Yokota(1999)、「微生物学実験法」の「グラム染色」の章、 199. Edited by Sugiyama J., Watanabe S., Oowada K., Kuroiwa T., Takahashi H. & Tokuda G., Tokyo: Kodansha Scientific に記載された方法により行った。
【００４４】
ＡＲＩ−１^T株はグラム陰性、及び桿状（長さ長さ１．２μｍ；直径０．８μｍ）であった。図５はＡＲＩ−１^T株の電子顕微鏡写真を示す。この株は、Nutrient Agar、Brain Heart Infusion Agar又はTryptic Soy Agar上で２５℃６〜７日間で淡褐色のコロニーを形成した。コロニーは円形、凸状、不透明であった。コロニーの生育は４℃及び４２℃では観察されなかった。
【００４５】
実施例６
生理学的及び生化学的特徴
本実施例でＡＲＩ−１^Tとともに使用した細菌株を以下に記載する。これらは、the Japan Collection of Microorganisms (JCM)及びAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手した。
生育のための酸素要求は、普通寒天及びBBL Gaspak Anaerobic System (Becton Dickinson, Cockeysville, MD)を用いて調べた。オキシダーゼ及びカタラーゼの試験は、poremediaオキシダーゼ試験指示薬（栄研化学（株）製）及び３．０％過酸化水素により実施した。ＡＰＩ２０ＮＥシステム（BioMerieux）を用いて試験微生物の生化学的特徴を調べた。
【００４６】
使用した細菌株
Novosphingobium subarcticum JCM 10398^T
Novosphingobium subterraneum ATCC 700279^T
Novosphingobium stygium ATCC 700280^T
Novosphingobium capsulatum ATCC 14666^T
Novosphingobium rosaATCC 51837^T
Novosphingobium aromaticivorans ATCC 700278^T
【００４７】
ＡＲＩ−１^T株は好気性の菌株であった。
ＡＲＩ−１^T株及びその他の使用した菌株の特徴を表１に示す。ＡＲＩ−１^T株は本実験で試験した、グルコース、アラビノース、マンノース、マンニトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、マルトース、グルコン酸、アジピン酸及びリンゴ酸のいずれも同化しなかった。これらの実験で用いた、他のNovosphingobiumに属する菌株は、多数の異なる種類の化合物を同一の実験条件下で同化したので、実験系は正常に機能していると考えられる。
なお、本実施例で用いた菌株は、全て、オキシダーゼ試験、インドール生成、グルコースから酸の生成、アルギニンジヒドロラーゼ活性、ウレアーゼ活性及びｎ−カプリン酸、クエン酸及び酢酸フェニルの同化が陰性であった。
【００４８】
【表１】

【００４９】
実施例７
１６Ｓ−ｒＤＮＡ及びＤＮＡ塩基組成の解析
ＤＮＡの調製
２５℃の温度で４８時間増殖させた培養物から菌株を集菌し、標準手段(Sambrook J, 他(1989) Molecular Cloning:a laboratory Manual, 2^nd edn. ColdSpring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory)によって染色体ＤＮＡを精製した。すなわち、細菌細胞をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾチーム（最終濃度：２ｍｇ／ml）及びドデシル硫酸ナトリウム（最終濃度：０．５％）に溶解し、細菌細胞を溶菌させた。溶菌液からフェノール−クロロホルム抽出によってＤＮＡを回収し、ＲＮａｓｅ処理、ＣＴＡＢ処理及びエタノール沈殿を行い、精製ＤＮＡを得た。なお、ＲＮａｓｅ処理、ＣＴＡＢ処理は２回行った。
【００５０】
ＤＮＡ塩基組成、すなわちグアニン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量は、Kumagai, M.(1980) J. Mol Biol 16,111-120に記載された方法に従って高速液体クロマトグラフィーにより測定した。
【００５１】
大腸菌１６Ｓ−ｒＤＮＡのナンバリングシステム８−２７及び１４９２−１５１０に対応するユニバーサルプライマーセット及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲにより、ほぼ完全な１６Ｓ−ｒＤＮＡを増幅した。温度プロフィールは２５サイクルを含み、９４℃で６０秒、５８℃で６０秒、及び７２℃で９０秒、最終のポリメリゼーションは７２℃で７分である。増幅されたＤＮＡフラグメントの直接配列決定は、
Satomi, M. et al., (1997) Int J Syst Bacteriol 47, 832-836に記載された方法により実施した。
【００５２】
ＡＲＩ−１^Tを、BLASTアルゴリズム(Altschul, S. F. et al., (1990) J Mol Biol 215, 403-410)を使用して、Genbank、EMBL、及びDDBJデータベース中の既知の全ての配列データと比較した。複合配列、Kimura, M. (1980) J Mol Biol 16, 111-120に記載されたヌクレオチド置換速度（Knuc値）の計算及びNeighbor-Joining法（Saitou, N. & Nei, M. (1987) Mol Biol Evol 4, 406-425）による系統樹の構築は、CLUSTAL Wコンピュータープログラム（Thompson, J. et al. (1994) Nucleic Acids Res 22, 4673-4680）を用いて行った。
【００５３】
ＡＲＩ−１^TのＧ＋Ｃ含量は６１％と測定された（表２）。この値はNovosphingobium属の他の菌株について測定される範囲内（すなわち６０〜６６％）である（Balkwill, D. L., Drake, G. R., Reeves, R. H., Fredrickson, J. K., White, D. C., Ringelberg, D. B, Chandler, D. P., Romine, M. F., Kennedy, D. W. & Spadoni, C. M. (1997) Taxonomic study of aromatic-degrading bacteria from deep-terrestrial-subsurface sediments and description of Sphingomonas aromaticivorans sp. nov., Sphingomonas subterranea sp nov., and Sphingomonas stygia sp. nov. Int J Syst Bacteriol 47, 191-201、Yabuuchi, E., Yano, I., Oyaizu, H., Hashimoto, Y., Ezaki, T. & Yamamoto, H. (1990) Proposals of Sphingomonas paucimobilis gen. nov. and comb. nov., Sphingomonas parapaucimobilis sp. nov., Sphingomonas yanoikuyae sp. nov., Sphingomonas adhaesiva sp. nov., Sphingomonas capsulata comb. nov., and two genospecies of the genus Sphingomonas. Microbiol Immunol 34, 99-119及びTakeuchi, M., Sawada, H., Yanagi, M., Yamasato, K., Hamana, K. & Yokota, A. (1995) Taxonomic study of bacteria isolated from plants: Proposal of Sphingomonas pruni sp. nov., Sphingomonas asaccharolytica sp. nov., and Sphingomonas mali sp. nov., Int J Syst Bacteriol 45, 334-341）。
表２は、ＡＲＩ−１^T株及び他のNovosphingobium種に属する菌株のＤＮＡのＧ＋Ｃ含量及びＤＮＡ−ＤＮＡ相同性の値を示す。
【００５４】
【表２】

【００５５】
図６に、ＡＲＩ−１^T株及び関連細菌の１６Ｓ−ｒＤＮＡ配列に基づく近隣結合法（Neighbor-Joining法）により構築した系統樹を示す。スケールを示す棒は、進化距離（Ｋ_nuc）０．０１を示す。
１６Ｓ−ｒＤＮＡ配列の分析の結果（図６）から、ＡＲＩ−１^T株は、 Novosphingobium aromaticivorans ATCC 700278^T、Novosphingobium subterraneum ATCC 700279^T、Novosphingobium subarcticum JCM 10398^T、Novosphingobium capsulatum ATCC 14666^T Novosphingobium stygium ATCC 700280^Tと類似性を示した。しかし、これらの菌種との１６Ｓ−ｒＤＮＡの配列類似性は最大でも９７％であったことから、ＡＲＩ−１^Tとは別種であるとみなすべきである。従って、ＡＲＩ−１^T及び他のNovosphingobium種との間の関係の確証的な情報を得るため、基質として１，２−フェニレンジアミン、比色酵素としてストレプタビジン−パーオキシダーゼコンジュゲートによるフォトビオチンラベル及び比色検出を用いたマイクロプレートハイブリダイゼーション法によってＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験を行った。表２は、これらの種の間におけるＤＮＡ−ＤＮＡ再会合値を示すが、比較的低レベルのハイブリダイゼーションが示される（最大３６％）。系統発生的に定義される菌種は、７０％以上のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション値を示す株からなることが決定されている（Wayne LG,他(1987) Int J Syst Bacteriol 37, 463-464）。従って、ＡＲＩ−１^T株は既知のNovosphingobium種とは別種である。
【００５６】
実施例８
脂肪酸組成及び極性脂質
全細胞の脂質を、Bligh, E. J. & Dyer, W. J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol 37, 911-917に記載の方法に従い抽出した。抽出した脂質を脂肪酸メチルエステルに転換し、脂肪酸メチルエステルはテフロンキャップ付きの試験管内で１００℃で２４時間、メタノール中の２N塩酸で抽出した脂質と反応することにより調製した。
【００５７】
得られた脂肪酸メチルエステルをヘキサンで３回抽出し、ヘキサン層を真空遠心分離により完全に蒸発させ、次いで脂肪酸メチルエステルを適当量のヘキサンに再溶解させた。BPX70キャピラリーカラムを備えるGC1700ガスクロマトグラフ（島津製作所製）により、脂肪酸メチルエステルの分析を行った。キャリアガスとしてはヘリウムを用いた（カラムヘッドの圧力は130kPaである）。インジェクター及び検出器を２６０℃に維持し、カラムオーブンを４℃／分の速度で１５５〜２３５℃に上昇するようにプログラムし、２３５℃に１０分間維持した。ピーク面積は、C-R8Aクロマトグラフィーレコーダー（島津製作所）によって定量した。化合物は、既知の標準物質との保持時間の比較により同定し、BPX70キャピラリーカラム（２５ｍ×０．２２ｍｍ）を備えるVarian 3800 ガスクロマトグラフに連結されたSaturn 2000イオントラップ質量分析計(Varian Inc.)を用いたガスクロマトグラフィー／質量分析（GC/MS）により確認した。オーブンは、４℃／分の速度で８０〜２４０℃まで上昇するようにプログラムされた。キャリアーガスとしてヘリウムを用いた（１ml／分）。GC/MSは、４０〜４００原子質量単位を有する、70eVの電離電圧及び２３０℃のトラップ温度で操作される。
【００５８】
ＡＲＩ−１^T株の全細胞脂肪酸プロフィールを表３に示す。検出された主要な非極性脂肪酸は１８：１であり、１４：０ ２−ＯＨが優勢なヒドロキシル化脂肪酸として存在している。しかし、３−ヒドロキシル化脂肪酸は検出されなかった。これらの結果は、Novosphingobium属の説明(Yabuuchi et al., 1990; Takeuchi et al., 1993, 1994, 2001; Kampfer et al., 1997)と一致する。
【００５９】
【表３】

【００６０】
また、極性脂質のプロフィールを、二次元TLCにより試験した。精製していない脂質を２種類の溶媒システムによるシリカゲル６０TLCプレート（２０×２０ｃｍ）上で分離した。溶媒システムは、１つはクロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４、ｖ／ｖ）であり、もう一方はクロロホルム−メタノール−酢酸−水（８０：１２：１５：４、ｖ／ｖ）である。全ての種類の脂質のスポットを検出するために、５０％溶液を用いた。糖、α−グリコール、リン酸塩及びフリーのアミノ基を検出するために、α−ナフトール／硫酸、過要素酸試薬、zinzadze（Dittmer試薬）、及びニンヒドリン試薬をそれぞれ用いた。試験の結果として、リン脂質、未同定の脂質及び色素に加えてNovosphingobium属に独特の脂質であるスフィンゴ糖脂質が検出された。
【００６１】
実施例９
イソプレノイドキノン組成
イソプレノイドキノン組成は、Yamada, Y. & Kuraishi, I. (1982) Gakkai Shuppan Centerによって記載された方法によって、一次元TLC及びHPLCによって測定した。全細胞の全アセトン溶解抽出物は溶出液としてベンゼンを用いた一次元TLCによって分離した。イソプレノイドの長さは、逆相カラム（Wako Handy ODS, 250mm×4.6mm、和光純薬）を用いたHPLCにより分析した。
主にQ−１０からなるユビキノンを含む（データは示さず）。優性なイソプレノイドキノンとしてのユビキノンQ−１０の存在は、Novosphingbium属を含むプロテオバクテリアのアルファブランチのメンバーとして典型的である(Yabuuchi et al., (1990) Microbiol Immunol 34, 99-119; Yrjala et al., (1998) Int J Syst Bacteriol 48, 1057-62; Stolz et al., (2000) Int J Syst Evol Miclobiol 50, 35-41; (2001) Int J Syst Evol Microbiol 51, 1405-1417)。
【００６２】
結論
Takeuchiら（Takeuchi, M., Hamana, K. & Hiraishi, A. (2001) Int J Syst Evol Microbiol 51, 1405-1417）は最近Sphingomonas属をSphingomonas, Sphingobium, Sphingopyxis及びNovosphingobiumの４つの新規な種に分離した。 Novosphingobiumは６種のメンバーからなり、この属のいくつかの菌種は芳香族化合物を分解することが知られている。例えば、N.aromaticivorans, N.stygium及びN.subterraneumはベンゾエート、クレオール、ナフタレン又はキシレンを分解することが報告されている（Balkwill, D. L. et al., (1997) Int J Syst Bacteriol 47, 191-201）。また、N.subarctiumはクロロフェノールを分解することができる(Nohynek, L. J. et al, (1996) Int J Syst Bacteriol 46, 1042-1055)。
【００６３】
１６Ｓ−ｒＤＮＡ配列（図６）、ゲノムＤＮＡのＧ＋Ｃ含量（表２）、イソプレノイドキノン組成、全細胞脂肪酸プロフィール（表３）、及びスフィンゴ糖脂質の存在から、ＡＲＩ−１^T株はNovosphingobium属に属することが示唆される。また、ＡＲＩ−１^T株と他の既知のNovosphingobium属に属する菌株との間の１６Ｓ−ｒＤＮＡの類似性から（図６）、ＡＲＩ−１^T株は新種であることが示唆される。また、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験（表２）により、ＡＲＩ−１^T株がNovosphingobium属の新種であることが示唆される。
【００６４】
本発明で得られた菌株の表現型、遺伝型及び系統発生のデータから、ＡＲＩ−１^T株はNovosphingobium属の新種の分類されると結論付けられる。従って、この新規菌株をNovosphingobium tardaugensと命名する。
【００６５】
【発明の効果】
以上詳述した通り、本発明によれば、新規なNovosphingobiumの属する菌株が提供される。本発明によって提供される菌株は、エストラジオール、エストロン及びエストリオール等のステロイド骨格含有化合物を分解することができる。本発明の菌株を用いて排水処理を行なうことにより環境中のステロイド骨格含有化合物を分解することができ、これによりステロイド骨格含有化合物が環境に蓄積することによって生じる環境汚染を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡＲＩ−１^T株による各種のステロイド骨格含有化合物の分解の時間経過を示すグラフである。
【図２】ＡＲＩ−１^T株による、エストラジオール分解活性の分解の時間経過を示すグラフである。
【図３】培養物のクロロホルム抽出物の全イオンガスクロマトグラムである。
【図４】培養物のクロロホルム抽出物のNMRスペクトルである。
【図５】ＡＲＩ−１^T株の電子顕微鏡写真である。
【図６】ＡＲＩ−１^T株及び関連細菌の１６Ｓ−ｒＤＮＡ配列に基づく近隣結合法（Neighbor-Joining法）により構築した系統樹である。

Claims (14)

1. エストラジオール、エストロン及びエストリオールからなる群から選択されるステロイド骨格含有化合物を分解することができる、Novosphingobium tardaugens 種に属する菌株。
2. 上記ステロイド骨格含有化合物を二酸化炭素に分解する、請求項１に記載の菌株。
3. グラム陰性、好気性、桿状の細菌であり、コロニーが円形、凸状、不透明かつ淡褐色であり、２５℃で生育できるが、４℃又は４２℃では生育できない、請求項１又は２に記載の菌株。
4. グルコース、アラビノース、マンノース、マンニトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、マルトース、グルコン酸、アジピン酸及びリンゴ酸からなる群からなる化合物を同化しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の菌株。
5. カタラーゼ及びニトレートレダクターゼの酵素活性が陽性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の菌株。
6. β−グルコシダーゼ、ゼラチナーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの酵素活性が陰性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の菌株。
7. 唯一の炭素源としてエストラジオールを含む培地を用いたスクリーニングにより単離される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の菌株。
8. 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９２４を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の菌株。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の菌株を用いることを特徴とする、エストラジオール、エストロン及びエストリオールからなる群から選択されるステロイド骨格含有化合物分解方法。
10. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の菌株を用いることを特徴とする、排水処理方法。
11. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の菌株を用いることを特徴とする、ステロイド骨格含有化合物を分解するためのバイオリアクター。
12. 排水処理用に用いられる、請求項１１に記載のバイオリアクター。
13. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の菌株を用いることを特徴とする、ステロイド骨格含有化合物を検出するためのバイオセンサ。
14. 唯一の炭素源としてエストラジオールを含む培地を用いてスクリーニングを行うことを特徴とする、ステロイド骨格含有化合物を分解することができる、Novosphingobium属に属する菌株のスクリーニング方法。

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