CN109402029B - 氨氮降解菌的分离纯化方法、氨氮降解菌种及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种氨氮降解菌的分离纯化方法、分离得到的氨氮降解菌种及应用。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:15930；保藏时间为：2018年06月11日。该菌株具有优异的氨氮降解效果，而且对于COD和总磷等指标均具有一定降解作用。故该菌株在底泥生物修复工程中具备巨大潜能，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种氨氮降解菌的分离纯化方法、分离得到的氨氮降解菌种及应用。
背景技术
随着我国经济的发展和人们生活水平的提高，由于工业污水排放、畜禽业养殖污水排放、水产养殖污水排放、生活污水排放等引起的水体氨氮污染有加重的趋势，不仅会引起水体中藻类及其它微生物大量繁殖，形成富营养化污染，严重时会引起水中溶解氧的大量消耗，导致水生动物大量死亡，造成生态破坏和一定程度的经济损失。在氨的致死、半致死浓度下，氨可引起养殖动物的肾、脾、甲状腺和血液组织的变化；亚硝酸盐对养殖动物有很强的毒性，严重影响养殖动物的生长、发育。水体中存在的氨氮对养殖的水产品具有一定的毒性，影响了水产品的品质，限制了水产养殖的可持续发展，特别是随着高密度工厂化养殖技术的推广，氨氮污染治理的需求日益突出。
尤其是近些年来，城市河道与开放水域水体黑臭问题已严重影响人们正常的经济社会生活，其引发的一系列生态环境问题，不仅会对人体健康、居住环境构成威胁，也严重损坏城市形象。2015年，国务院发布的《水污染防治行动计划》(简称“水十条”)对黑臭水体问题提出明确要求，到2020年，我国地级及以上城市建成区黑臭水体均控制在10％以内；到2030年，城市建成区黑臭水体总体得到消除。由此可见，解决和治理城市水体黑臭问题迫在眉睫。
截止目前，黑臭水体的形成机制与污染特点已初步明确，但治理技术仍在不断发展更新中。黑臭水体除氮方法，近些年来国内外主要采用物理、化学和生物方法。在应用物理和化学方法解决黑臭水体脱氮的实践中通常治标不治本，并且费用较高，同时引发了其它生态环境问题，无法实现长期治理目标。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明通过提供新的氨氮降解菌株、该氨氮降解菌的分离纯化方法，以及可用于氨氮降解来解决前述需求，尤其是对于城市污染中的黑臭水体具有很好的治理作用，该方法绿色环保，成本低，耗时时间短，操作方便，通过这种采用生物治理的方法，48小时氨氮降解率可高达80.67％，黑臭水体中的氨氮浓度可以降到非常低，同时对COD和总磷等指标均具有一定降解作用，可见该菌株在底泥生物修复工程中具备巨大潜能，应用前景非常广阔。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种分离的氨氮降解菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:15930；保藏时间为：2018年06月11日。
该菌株的菌落形态描述特征为：直或稍弯的革兰氏阴性杆菌，菌落小短杆状，菌落呈圆形、表面光滑、边缘整齐，颜色呈浅乳黄色，中央略凸起。
本申请提供的革兰氏阴性杆菌，菌株名为BNN-1，从黑臭底泥中分离得到，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No:15930；保藏时间为：2018年06月11日，检测为存活菌株并保藏。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1的氨氮降解菌在LB培养基上的生产曲线的测定结果。
本申请提供的氨氮降解菌，菌株名为BNN-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No:15930；保藏时间为：2018年06月11日，检测为存活菌株并保藏。
具体实施方式
本发明涉及一种分离的氨氮降解菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:15930；保藏时间为：2018年06月11日。
该菌株具有很强的氨氮降解能力，尤其是对于城市污染中的黑臭水体具有很好的治理作用，48小时氨氮降解率可高达80.67％，氨氮浓度可以降到非常低，同时对COD和总磷等指标均具有一定降解作用，可见该菌株在底泥生物修复工程中具备巨大潜能，应用前景非常广阔。
本发明请求保护上述保藏编号的氨氮降解菌株，以及在适度范围内发生突变，且仍然具有很强的氨氮降解能力的突变菌株。
在实际应用的过程中，考虑到其可能需要运输等原因，有必要将氨氮降解菌株扩大培养制成组合物(特别是微生物菌剂)的形式以扩大其应用范围。
本发明的组合物(优选地，在用作发酵剂培养物时)可为纯培养物或混合培养物。所以，本发明将纯培养物限定为这样一种培养物，其中全部或基本上全部培养物由本发明的同一氨氮降解菌菌株组成。在替代形式中，将混合培养物限定为这样一种培养物，其包含若干种微生物，具体地讲包含若干种细菌菌株，包括本发明的氨氮降解菌株
所述组合物用于工业，可制成液体、冷冻或干燥粉末形式；或以本行业常用的制剂形式来表述，如颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、乳液或液剂。
任何载体都可使用，不论它们是固体或液体，只要它们是工业方面常常用的和生物学上惰性的即可。不限于任何特定的载体。
本发明还提供了一种氨氮降解菌的分离纯化方法，具体包括如下步骤：
(A)将黑臭底泥样品接种于富集培养基上，培养驯化得到混合菌液；
(B)将所述混合菌液接种到氨氮分离培养基上，采用稀释涂布的方法，多次划线直至得到形态单一的菌落。
优选地，所述步骤(A)中，培养温度为25-30℃之间，培养时间为20d以上。
优选地，所述步骤(A)中，培养温度为28℃恒温，培养时间为21d。
优选地，所述步骤(A)中，所述富集培养基的组成为：葡萄糖8g/L-12g/L、硫酸铵1g/L-3g/L、氯化钠0.5g/L-1.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L-1.5g/L、硫酸镁0.5g/L-1.5g/L、溶剂为水。
优选地，富集培养基的组成为：葡萄糖10g/L、硫酸铵2g/L、氯化钠1.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁1.0g/L、溶剂为水。
上述富集培养基可以为液体培养基，也可以为固体培养基(再添加10g/L～20g/L的琼脂)。
实际操作时，富集用培养基的组成为：葡萄糖10.0g，硫酸铵2.0g，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁1.0g，水1000ml。
优选地，氨氮分离培养基组成为：葡萄糖4g/L-7g/L、硫酸铵0.1g/L-0.3g/L、氯化钠0.5g/L-1.5g/L、磷酸氢二钾0.3g/L-0.7g/L、硫酸镁0.1g/L-0.3g/L、溶剂为水。
更优地，氨氮分离培养基组成为：葡萄糖5g/L、硫酸铵0.25g/L、氯化钠1.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.25g/L、溶剂为水。
实际操作时，氨氮降解用分离培养基的组成为：葡萄糖5.0g，硫酸铵0.25g，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，水1000ml。
上述氨氮分离培养基可以为液体培养基，也可以为固体培养基(再添加10g/L～20g/L的琼脂)。
优选地，所述步骤(B)中，培养温度为28-35℃之间，培养时间为24-48h。
更优地，培养温度为30℃恒温。
上述方法通过富集、分离纯化的方法从黑臭底泥中最终得到目标菌种，后续对该菌种进行了生长曲线的测定以及对其氨氮降解效果进行了评定，具体可见下述实施例以及实验例的具体过程。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
氨氮降解菌的分离纯化方法，具体包括如下步骤：
1)配制氨氮降解富集用培养基：葡萄糖8g/L、硫酸铵3g/L、氯化钠0.5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、硫酸镁0.5g/L、溶剂为水。
2)将黑臭底泥样品在上述高浓度的富集用培养基中进行耐受驯化，每一代驯化需要7天，共进行三代耐受培养得到混合菌液，培养温度为恒温30℃；
3)配制氨氮降解分离用培养基：葡萄糖4g/L、硫酸铵0.3g/L、氯化钠0.5g/L、磷酸氢二钾0.7g/L、硫酸镁0.1g/L、溶剂为水；
4)将菌液接种到上述氨氮分离用培养基上，从耐受驯化三次的液体样品中分离单菌株。采用稀释涂布的方法，在35℃恒温培养箱中恒温培养24-48h，挑取典型菌落，多次划线直至单菌落形成；
5)菌株鉴定：生理生化鉴定结合16s。
实施例2
氨氮降解菌的分离纯化方法，具体包括如下步骤：
1)配制氨氮降解富集用培养基：葡萄糖12g/L、硫酸铵1g/L、氯化钠1.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁1.5g/L、溶剂为水。
2)将黑臭底泥样品在上述高浓度的富集用培养基中进行耐受驯化，每一代驯化需要7天，共进行四代耐受培养得到混合菌液，培养温度为恒温25℃；
3)配制氨氮降解分离用培养基：葡萄糖7g/L、硫酸铵0.1g/L、氯化钠1.5g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.3g/L、溶剂为水；
4)将菌液接种到上述氨氮分离用培养基上，从耐受驯化四次的液体样品中分离单菌株。采用稀释涂布的方法，在28℃恒温培养箱中恒温培养24-48h，挑取典型菌落，多次划线直至单菌落形成；
5)菌株鉴定：生理生化鉴定结合16s。
实施例3
氨氮降解菌的分离纯化方法，具体包括如下步骤：
1)配制氨氮降解富集用培养基：葡萄糖11g/L、硫酸铵1.5g/L、氯化钠1.2g/L、磷酸氢二钾1.2g/L、硫酸镁0.7g/L、溶剂为水。
2)将黑臭底泥样品在上述高浓度的富集用培养基中进行耐受驯化，每一代驯化需要7天，共进行四代耐受培养得到混合菌液，培养温度为恒温25℃；
3)配制氨氮降解分离用培养基：葡萄糖5g/L、硫酸铵0.2g/L、氯化钠1.2g/L、磷酸氢二钾0.6g/L、硫酸镁0.2g/L、溶剂为水；
4)将菌液接种到上述氨氮分离用培养基上，从耐受驯化四次的液体样品中分离单菌株。采用稀释涂布的方法，在28℃恒温培养箱中恒温培养24-48h，挑取典型菌落，多次划线直至单菌落形成；
5)菌株鉴定：生理生化鉴定结合16s。
实施例4
氨氮降解菌的分离纯化方法，具体包括如下步骤：
1)配制氨氮降解富集用培养基：葡萄糖10g/L、硫酸铵2g/L、氯化钠1.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁1.0g/L、溶剂为水。
2)将黑臭底泥样品在上述高浓度的富集用培养基中进行耐受驯化，每一代驯化需要7天，共进行三代耐受培养得到混合菌液，培养温度为恒温28℃；
3)配制氨氮降解分离用培养基：葡萄糖5g/L、硫酸铵0.25g/L、氯化钠1.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.25g/L、溶剂为水；
4)将菌液接种到上述氨氮分离用培养基上，从耐受驯化四次的液体样品中分离单菌株。采用稀释涂布的方法，在30℃恒温培养箱中恒温培养24-48h，挑取典型菌落，多次划线直至单菌落形成；
5)菌株鉴定：生理生化鉴定结合16s。
实验例1
对本发明实施例1的氨氮降解菌种在LB培养基中活化3代后，再进行生长曲线测定。活化跟生长曲线测定都在恒温摇床上进行，培养温度为30℃，摇床转速为150rpm，每2-4h取样，测在600nm条件下的吸光值。具体生长曲线的测定结果如图1所示，图中横坐标的单位为h。
实验例2
将本发明实施例3筛选得到的氨氮降解菌种按照5％的接种量接种到10个不同氮含量的污水污泥样品中，其中样品序号10的污水污泥样品不接菌，作为空白对照。恒温培养24-48h，结束培养，用布氏法测氨氮的残留量，根据公式氨氮降解率＝(空白中的氨态氮含量-污水污泥样品中氨态氮含量)/空白中的氨态氮的含量×100％，具体结果见下表1所示。
表1 不同样品降解程度
以上9个样品均来自污水污泥样品，降解率最高的达到了80％以上，最低的降解率也达到了50％，而且通过重复样品进行检测后，菌种的降解率最终都可以稳定在80％以上，降解效果优异，同时发现对污水污泥样品中的COD和总磷等指标也具有一定的降解作用。
通过将其他实施例的菌种进行上述试验也能够得到相同的试验结果。
本发明的方案具有以下优点：采用实验室可操作性强的分离手段，在实验室模拟现场的处理方式，并在实验室做了不同浓度的氨氮，设置的浓度高于实际的浓度，有利于今后的实际应用，另外该菌株采用的高效手段的驯化方法，增强了菌株在恶劣环境中的耐受程度，在今后的实际应用中，比没有经过驯化的菌种适应性更强。对今后的现实应用减少了使用风险。该菌株的降解效率比市场上现有的菌剂降解效率更高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (2)
1.一种氨氮降解菌株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No:15930；保藏时间为：2018年06月11日。
2.权利要求1所述的氨氮降解菌株在氨氮降解、COD和总磷的降解方面的应用。
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