CN106987547A

CN106987547A - 一株鲍曼不动杆菌及其应用

Info

Publication number: CN106987547A
Application number: CN201710434226.6A
Authority: CN
Inventors: 赵彬; 安强; 程丹阳; 丁雪松; 黄晓龙
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2017-06-09
Publication date: 2017-07-28
Anticipated expiration: 2037-06-09
Also published as: CN106987547B

Abstract

本发明公开一株鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)AL‑6及其应用。该菌株于2016年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.13248。发明所述菌株能够通过异养硝化‑好氧反硝化脱氮。在好氧条件下，以CH₃COONa为碳源，NH₄ ⁺‑N为氮源，可实现81.9~99.9%的NH₄ ⁺‑N去除，59.7~90.8%的TN去除；以NO₃ ^‑‑N为氮源，NO₃ ^‑‑N去除率为50.2%，TN去除率为48.2%；以NO₂ ^‑‑N为氮源，NO₂ ^‑‑N去除率为50.3%，TN去除率为48.8%。菌株AL‑6在高浓度氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮废水处理领域有良好的应用前景。

Description

一株鲍曼不动杆菌及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株具有异养硝化-好氧反硝化脱氮能力的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）AL-6，及其在高浓度氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮废水处理中的应用。

背景技术

随着城市化进程的快速推进，水资源短缺与污染的问题日益尖锐，其中，氨氮污染问题尤为突出。据《中国环境状况公报》显示，2014年我国氨氮总排放量达到238.5万吨。氨氮直接排入水体后不仅会造成水体富营养化、水体黑臭；还会加大水处理的难度及成本，影响生活用水及工业供水，造成直接经济损失；更会对人类和动物产生毒害作用。因此，水体中氨氮的有效去除是污水处理关注的重点之一。

生物脱氮是目前应用最为广泛的脱氮技术之一。传统的生物脱氮是基于自养硝化菌和异养反硝化细菌的联合作用实现的。自养硝化细菌是以无机碳和氨氮为底物，在好氧条件下进行硝化反应；异养反硝化细菌是以有机碳和硝酸盐为底物，在厌（缺）氧条件下进行反硝化。两者反应体系不同，很难在同一构筑物中共存，因此处理工艺难以缩减，维护管理繁琐，经济性差，且在运行过程中易产生各种问题。研发新型的脱氮处理工艺以提高污水脱氮效率刻不容缓。

20世纪80年代，Robertson等 (Aerobic denitrification: a controversyrevived, Archives of Microbiology, 1984, 139)在好氧条件下对菌株Thiosphaera pantotropha进行反硝化测试，证明了好氧反硝化菌株的存在。1985年，Robertson等(Aerobic denitrification and heterotrophic nitrification by Thiosphaera pantotropha, Antonie van Leeuwenhoek, 1985, 51) 再次以菌株Thiosphaera pantotropha为实验对象，证明该菌株可以在好氧情况下，以有机物为碳源和能量来源，同步进行硝化和反硝化作用，将氨氮转化为气态产物排出水体，以达到脱氮目的，即异养硝化-好氧反硝化。这类菌株的存在使得传统脱氮工艺中硝化作用和反硝化作用同时在好氧条件下进行成为可能，而且还能够避免脱氮过程中硝氮和亚硝氮的积累，防止中间产物对水体生物及人类造成危害。这一技术相比于传统的脱氮工艺，大幅度地简化了处理工艺，提高了处理效率，降低了运行维护成本。因此，筛选和分离出能够高效脱除氨氮的异养硝化-好氧反硝化菌株，并将其应用于高氨氮浓度废水的处理，具有重要意义。

发明内容

针对现有生物脱氮技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一株鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）AL-6，解决目前生物脱除氨氮处理工艺复杂，并且异养硝化-好氧反硝化菌株选择受限等问题；本发明还提供将其应用于高氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮浓度的废水处理，在好氧条件下同步而高效地进行硝化和反硝化处理。

实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一株鲍曼不动杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC No. 13248，经16S rDNA鉴定具有序列表SEQ ID NO. 1所示基因序列。

本发明还提供一株鲍曼不动杆菌的分离及纯化方法，采用污水厂曝气池活性污泥为原料，通过液体培养基驯化培养和固体培养基平板划线筛选反复交替所得；包括如下步骤：

1）移取1 mL污水厂所取泥水混合液到80 mL的氨氮液体培养基中，在120 rpm、30 ℃下，恒温驯化72 h，取培养所得菌液1 mL移至80 mL氨氮液体培养基进行第二次驯化培养，此次培养时长为48 h；

2）将富集驯化培养后的菌液进行稀释，稀释倍数为10^-1-10^-6，将稀释后的菌液涂布于含氨氮固体培养基的平板上，30℃倒置培养48 h；用接种环挑取单个菌落分别接种于氨氮液体培养基，培养48 h后测定培养基中NH₄ ⁺-N和TN的去除效果，选取对NH₄ ⁺-N和TN去除效果均较好的培养液；

3）取适量菌液用接种环在含氨氮固体培养基的平板上划线，然后倒置培养48 h；用接种环挑取氨氮固体培养基上的单个菌落，接种于氨氮液体培养基，培养48 h后测定氨氮液体培养基中NH₄ ⁺-N和TN的去除效果；

4）重复步骤3），直到NH₄ ⁺-N和TN的去除效果达到稳定为止；

5）将NH₄ ⁺-N、TN去除效果最优的菌株进行16S rDNA基因测序鉴定，将测序结果与GenBank中已有细菌的序列进行比对，比对结果与Acinetobacter baumannii相似度最高，故该菌株命名为鲍曼不动杆菌AL-6；

其中涉及的培养基为：

氨氮固体培养基：10.2 g/L乙酸钠，1.0 g/L氯化铵，4.8 g/L磷酸氢二钠（十二水），1.2g/L磷酸二氢钠（二水），4.0 g/L氯化钠，15.0 g/L琼脂粉，以及3.0 ml/L微量元素，调节pH至7~8；

氨氮液体培养基：10.2 g/L乙酸钠，1.0 g/L氯化铵，4.8 g/L磷酸氢二钠（十二水），1.2g/L磷酸二氢钠（二水），4.0 g/L氯化钠，以及3.0 ml/L微量元素，调节pH至7~8；

所述微量元素溶液为：3.0 g/L硫酸镁（七水），3.4 g/L硫酸锰（一水），1.1 g/L硼酸，3.0 g/L硫酸锌（七水），0.3 g/L硫酸亚铁（七水），0.6 g/L氯化钙；

所有培养基在使用前需要在121 ℃下，灭菌30 min。

进一步，还提供鲍曼不动杆菌应用于高氨氮的废水处理。在好氧条件下，以有机碳为碳源和能源，完成废水中氨氮的去除，实现异养硝化-好氧反硝化脱氮。

在处理高浓度氨氮废水时，所述废水氨氮浓度为80~210 mg/L。在处理高浓度氨氮废水时，所述废水碳氮比为10，所述废水pH值为5~9。在处理高氨氮有机废水时，所述废水碳氮比为10，氨氮浓度为80 mg/L，pH为7，温度为30℃。

进一步所述鲍曼不动杆菌应用于高硝酸盐氮、亚硝酸盐氮的废水处理。在好氧条件下，以乙酸钠为碳源，以硝酸盐或亚硝酸盐为氮源进行好氧反硝化脱氮。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、所述鲍曼不动杆菌AL-6是异养硝化-好氧反硝化菌株，即能够在好氧条件下，以有机物为底物（以有机碳为碳源），同步进行硝化作用和反硝化作用脱氮，适用于含氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐有机废水的去除。

2、相比于传统脱氮技术，大幅度地简化了处理工艺，提高了处理效率，降低了运行维护成本。

3、具有显著的氨氮脱除效果。鲍曼不动杆菌AL-6在初始浓度为80 mg/L的氨氮废水中，在温度30℃，转速120 rpm，pH为7条件下，TN去除率可以达到90.8%，NH₄ ⁺-N去除率可以达到99.9%，中间产物积累较少，氨氮脱除效果好。菌株AL-6在初始浓度为140 mg/L的氨氮废水中，在温度30 ℃，转速120 rpm，pH为7条件下，TN去除率可以达到78.2%，NH₄ ⁺-N去除率可以达到93.1%，中间产物积累较少，氨氮脱除效果好。菌株AL-6在初始浓度为210 mg/L的氨氮废水中，在温度30℃，转速120 rpm，pH为7条件下，TN去除率可以达到59.7%，NH₄ ⁺-N去除率可以达到81.9%，有少量中间产物积累。

此外，具有好氧反硝化能力。菌株AL-6在硝酸盐废水中，在温度30℃，转速120rpm，pH为7条件下，TN去除率可以达到48.2%，NO₃ ^--N去除率可以达到50.2%。菌株AL-6在亚硝酸盐废水中，在温度30℃，转速120 rpm，pH为7条件下，TN去除率可以达到48.8%，NO₂ ^--N去除率可以达到50.3%，好氧反硝化能力明显。

附图说明

图1菌株AL-6在初始浓度为80 mg/L的氨氮废水中的生长及脱氮能力；

图2菌株AL-6在初始浓度为140 mg/L的氨氮废水中的生长及脱氮能力；

图3菌株AL-6在初始浓度为210 mg/L的氨氮废水中的生长及脱氮能力；

图4菌株AL-6在硝酸盐废水中的好氧反硝化能力；

图5菌株AL-6在亚硝酸盐废水中的好氧反硝化能力。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1：细菌的分离及鉴定

1、细菌的分离及纯化

本发明所述鲍曼不动杆菌AL-6分离自重庆市鸡冠石污水厂曝气池活性污泥，通过液体培养基驯化培养和固体培养基平板划线筛选反复交替所得。具体实施步骤如下：

1）移取1 mL污水厂所取泥水混合液到80 mL的氨氮液体培养基中，在120 rpm、30 ℃下，恒温驯化72 h。取培养所得菌液1 mL移至80 mL氨氮液体培养基进行第二次驯化培养，此次培养时长为48 h。

2）将富集驯化培养后的菌液进行稀释，稀释倍数为10^-1-10^-6，将稀释后的菌液涂布于含氨氮固体培养基的平板上，30 ℃倒置培养48 h。用接种环挑取单个菌落分别接种于氨氮液体培养基，培养48 h后测定培养基中NH₄ ⁺-N和TN的去除效果，选取对NH₄ ⁺-N和TN去除效果均较好的培养液。

3）取适量菌液用接种环在含氨氮固体培养基的平板上划线，然后倒置培养48 h。用接种环挑取氨氮固体培养基上的单个菌落，接种于氨氮液体培养基，培养48 h后测定氨氮液体培养基中NH₄ ⁺-N和TN的去除效果。

4）多次重复步骤3），直到NH₄ ⁺-N和TN的去除效果达到稳定为止。

5）将NH₄ ⁺-N、TN去除效果最优的菌株进行16S rDNA基因测序鉴定。将测序结果与GenBank中已有细菌的序列进行比对，比对结果与Acinetobacter baumannii相似度最高，故该菌株命名为鲍曼不动杆菌AL-6。

上述涉及的培养基为：

氨氮固体培养基：10.2 g/L乙酸钠，1.0 g/L氯化铵，4.8 g/L磷酸氢二钠（十二水），1.2g/L磷酸二氢钠（二水），4.0 g/L氯化钠，15.0 g/L琼脂粉，以及3.0 ml/L微量元素，调节pH至7~8。

氨氮液体培养基：10.2 g/L乙酸钠，1.0 g/L氯化铵，4.8 g/L磷酸氢二钠（十二水），1.2 g/L磷酸二氢钠（二水），4.0 g/L氯化钠，以及3.0 ml/L微量元素，调节pH至7~8。

所述微量元素溶液为：3.0 g/L硫酸镁（七水），3.4 g/L硫酸锰（一水），1.1 g/L硼酸，3.0 g/L硫酸锌（七水），0.3 g/L硫酸亚铁（七水），0.6 g/L氯化钙。

所有培养基在使用前需要在121 ℃下，灭菌30 min。

2、细菌的鉴定

本发明所述鲍曼不动杆菌AL-6已于2016年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No. 13248，地址为北京市北辰西路1号院3号。所述鲍曼不动杆菌AL-6的16S rDNA基因序列见序列表SEQ ID NO. 1，GenBank中基因序列登录号为KY930369。根据16S rDNA基因序列比对，该菌株与Acinetobacter baumannii相似度最高，因此命名该菌株为鲍曼不动杆菌AL-6。

实施2：鲍曼不动杆菌AL-6在不同氨氮浓度废水中对氨氮、总氮的去除能力

以NH₄ ⁺-N为氮源，CH₃COONa为碳源，在废水中NH₄ ⁺-N浓度分别为80 mg/L、140 mg/L和210 mg/L条件下，考察菌株AL-6的生长及对氨氮和总氮的去除能力。废水初始NH₄ ⁺-N浓度为80 mg/L，C/N为10，pH控制在7~8，在30℃、120 rpm摇床中培养。30 h时，菌株OD₆₀₀上升到1.2，此时TN去除率达到90.8%，NH₄ ⁺-N去除率达到99.9%，中间产物硝酸盐积累量为9.9 mg/L，亚硝酸盐积累量为0.1 mg/L。废水初始NH₄ ⁺-N浓度为140 mg/L，C/N为10，在30 ℃、120rpm条件下，培养53 h后，OD₆₀₀上升到1.6， TN去除率达到78.2%，NH₄ ⁺-N去除率达到93.1%，中间产物硝酸盐积累量为9.9 mg/L，亚硝酸盐积累量为0.1 mg/L。废水中初始NH₄ ⁺-N浓度为210 mg/L，C/N为10，在30℃、120 rpm条件下培养60 h，OD₆₀₀上升到1.8， TN去除率达到59.7%，NH₄ ⁺-N去除率达到81.9%，中间产物硝酸盐积累量为34.6 mg/L，亚硝酸盐积累量为0.1 mg/L。结果表明，菌株AL-6对含不同氨氮浓度废水均有较好的处理效果。详见附图1、2、3。

实施例3：鲍曼不动杆菌AL-6对废水中硝酸盐氮的去除能力

鲍曼不动杆菌AL-6以硝酸盐为氮源，通过检测废水中氮源的降解情况，考察该菌株的好氧反硝化能力。硝酸盐废水初始TN浓度为80.8 mg/L，初始NO₃ ^--N浓度为79.2 mg/L，初始C/N比为10，pH控制在7~8，在30 ℃，转速120 rpm条件下培养。48 h后TN去除48.2%，NO₃ ^--N去除50.2%。实验结果认为，菌株AL-6能够在好氧条件下，以硝氮为底物进行好氧反硝化作用。详见附图4。

实施例4：鲍曼不动杆菌AL-6对废水中亚硝酸盐氮的去除能力

鲍曼不动杆菌AL-6以亚硝酸盐为氮源，通过检测废水中氮源的降解情况，考察该菌株的好氧反硝化能力。亚硝酸盐废水初始TN浓度为81.8 mg/L，初始NO₂ ^--N浓度为79.2 mg/L，初始C/N比为10，pH控制在7~8，在30 ℃，转速120 rpm条件下培养。48 h后TN去除48.8%，NO₂ ^--N去除50.3%。实验结果认为，菌株AL-6能够在好氧条件下，以亚硝氮为底物进行好氧反硝化作用。详见附图5。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆大学

<120> 一株鲍曼不动杆菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1281

<212> DNA

<213> Acinetobacter baumannii AL-6

<220>

<223> SEQIDNO.1核苷酸序列

<400> 1

gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat tctgatccgc gattactagc 60

gattccgact tcatggagtc gagttgcaga ctccaatccg gactacgatc ggctttttga 120

gattagcatc acatcgctgt gtagcaaccc tttgtaccga ccattgtagc acgtgtgtag 180

ccctggccgt aagggccatg atgacttgac gtcgtccccg ccttcctcca gtttgtcact 240

ggcagtatcc ttaaagttcc catccgaaat gctggcaagt aaggaaaagg gttgcgctcg 300

ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc agcacctgta 360

tctagattcc cgaaggcacc aatccatctc tggaaagttt ctagtatgtc aaggccaggt 420

aaggttcttc gcgttgcatc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 480

caattcattt gagttttagt cttgcgaccg tactccccag gcggtctact tatcgcgtta 540

gctgcgccac taaagcctca aaggccccaa cggctagtag acatcgttta cggcatggac 600

taccagggta tctaatcctg tttgctcccc atgctttcgt acctcagcgt cagtattagg 660

ccagatggct gccttcgcca tcggtattcc tccagatctc tacgcatttc accgctacac 720

ctggaattct accatcctct cccatactct agctcaccag tatcgaatgc aattcccaag 780

ttaagctcgg ggatttcaca tccgacttaa taagccgcct acgcacgctt tacgcccagt 840

aaatccgatt aacgctcgca ccctctgtat taccgcggct gctggcacag agttagccgg 900

tgcttattct gcgagtaacg tccactatct ctaggtatta actaaagtag cctcctcctc 960

gcttaaagtg ctttacaacc ataaggcctt cttcacacac gcggcatggc tggatcaggg 1020

ttccccccat tgtccaatat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc 1080

agtcccagtg tggcggatca tcctctcaga cccgctacag atcgtcgcct tggtaggcct 1140

ttaccccacc aactagctaa tccgacttag gctcatctat tagcgcaagg tccgaagatc 1200

ccctgctttc tcccgtagga cgtatgcggt attagcatcc ctttcgagat gttgtccccc 1260

actaataggc agattcctaa g 1281

Claims

1.一株鲍曼不动杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC No. 13248，经16S rDNA鉴定具有序列表SEQ ID NO. 1所示基因序列。

2.一株鲍曼不动杆菌的分离及纯化方法，其特征在于，采用污水厂曝气池活性污泥为原料，通过液体培养基驯化培养和固体培养基平板划线筛选反复交替所得；包括如下步骤：

重复步骤3），直到NH₄ ⁺-N和TN的去除效果达到稳定为止；

其中涉及的培养基为：

所有培养基在使用前需要在121 ℃下，灭菌30 min。

3.如权利要求1所述鲍曼不动杆菌应用于高氨氮废水的处理。

4.如权利要求1所述鲍曼不动杆菌应用于高硝酸盐氮、亚硝酸盐氮废水的处理。

5.如权利要求3所述鲍曼不动杆菌应用于高氨氮废水的处理，其特征在于，在好氧条件下，以有机碳为碳源和能源，完成废水中氨氮的去除，实现异养硝化-好氧反硝化脱氮。

6.如权利要求3所述鲍曼不动杆菌应用于高氨氮的废水处理，其特征在于，在处理高浓度氨氮废水时，所述废水氨氮浓度为80~210 mg/L。

7.如权利要求3所述鲍曼不动杆菌应用于高氨氮的废水处理，其特征在于，在处理高浓度氨氮废水时，所述废水碳氮比为10，所述废水pH值为5~9。

8.如权利要求3所述鲍曼不动杆菌应用于高氨氮的废水处理，其特征在于，在处理高氨氮有机废水时，所述废水碳氮比为10，氨氮浓度为80 mg/L，pH为7，温度为30℃。

9.如权利要求4所述鲍曼不动杆菌应用于高硝酸盐氮或亚硝酸盐氮废水的处理，其特征在于，在好氧条件下，以乙酸钠为碳源，以硝酸盐或亚硝氮为氮源进行好氧反硝化脱氮。