CN103103141B - 一株考克氏菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株考克氏菌株及其应用。该菌株为沼泽考克氏菌（Kocuriapalustris）FSDN-A，2011年7月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.5061。该菌株既可以利用亚硝酸盐氮也可以利用硝酸盐氮作为底物完成反硝化过程。本发明的沼泽考克氏菌FSDN-A在处理含氨废水时，工艺简单，脱氮活性高，同时能够耐受高浓度有机碳源。投入使用后系统启动快，在废水脱氮处理过程中具有广阔的应用前景，特别适合处理既含有氮氧化物又含有有机污染物的废水。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种脱氮菌株及其应用。本发明脱氮菌株能以亚硝氮为氮源进行反硝化，同时还能去除COD，特别适用于含氨废水短程硝化反硝化过程中的脱氮。
背景技术
传统的生物脱氮工艺主要包括硝化和反硝化两个过程，硝化是反硝化过程的前提，反硝化过程才能真正脱除废水中的含氮化合物。由于硝化菌有强烈的好氧性，硝化过程是好氧的；而反硝化菌一般为兼性细菌，在有氧条件下即以氧作为电子受体，进行有氧呼吸，只有无氧状态时才以硝酸盐或亚硝酸盐作为电子受体，获取合成细胞体的能量。一般认为在好氧条件下，硝酸或亚硝酸还原酶不能表达或氧分子会对这些酶产生抑制。如当溶解氧分别大于4.05mg/L、2.15 mg/L、0.25mg/L时Pseudomonas nautica硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氮氧化物还原酶完全失活。
传统的脱氮工艺大多是将硝化和反硝化设置在两个构筑物中进行分级脱氮，存在污水处理工艺流程较长，基建投资高，需要向硝化池补充碱度等不足。所以一些新型的、效果更好的脱氮微生物，如异养硝化细菌、好氧反硝化细菌、厌氧氨氧化细菌等相继被发现。
目前为止已分离出60多种反硝化菌，主要分布于假单胞属(Pseudomonas )、产碱杆菌属(Alcaligeneas)、泛养硫球菌属（Thiosphera pantotroph）、动胶菌属（Zoogloeas）和芽孢杆菌属（Bacillus）等，大多数为兼性厌氧菌。Lukow从垃圾渗滤液的硝化工段分离出属于Zoogloeas一株菌TL1（Aerobic denitrification by a newly isolated heterotrophic bacterium strain TL1[J].Biotechnology Letters ,1997,11(19) : 1 157～1 159），该菌可以同时利用氧和降解硝酸盐。Naokia筛得两株反硝化菌，分别为Pseudomonas stutzeri TR2和Pseudomonas sp.K50（AerobicDenitrifying Bacteria that Produce low Levels of Nitrous Oxide [ J] .Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69 ( 6) : 3152-3157）。张光亚（华侨大学学报，2004，25(1)）从土壤中分离出一株以硝酸钠为氮源的好氧反硝化菌HN，经鉴定为Rhodococcus sp.，王琳等（环境科学，2009，(30)1）以硝酸盐氮为电子受体、以柠檬酸钠为碳源、从河流沉积物中分离到一株粪产碱杆菌(Acaligenes faecalis)。王晓宇等（环境科学学报，2009，(29)1）从活性污泥中分离到假单胞产碱杆菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）和假单胞菌属门多萨菌（Pseudomonas mendocina）。张小玲等（微生物学通报，2008，35(10)）从池塘底泥中分离到一株好氧反硝化菌株H2，经初步鉴定属于芽孢杆菌属，该菌株对亚硝酸盐最高降解速率为0.885mg/(L·d)；李兵等（水生生态杂志，2009，2(3)）从土壤中筛选到芽孢杆菌D5，该菌株的最大降解速率为2.22mg/(L·h)。安健等（环境科学研究，2010，23(1)）从对虾养殖池塘中筛选到一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)YX-6，该菌株能够在14h内将亚硝酸盐氮由10mg/L降至0。以上分离到的降解亚硝酸盐氮菌株都属于芽孢杆菌属（Bacillus），这些菌株能以亚硝氮为电子受体进行反硝化脱氮，且降解速率可达10mg/(L·h)，所处理废水的亚硝酸盐氮浓度也达到了100mg/L。
考克氏菌是一类适应能力极强的微生物，目前，已鉴定了12 个种，其中K.marina 具有极强的耐盐性能，K. aegyptia 能在碱性条件下良好生长，其最适pH 值在10～10.5之间，拥有非常特殊的生理机制和遗传基因，K. varians能产生抗菌活性很高的肽类抗生素(羊毛硫抗生素)，在有效控制冷冻乳制品中蜡质芽孢杆菌的数量方面显示出良好的研发价值，K. rhizophila 除了具有耐盐能力外，还被指定为各种抗生素敏感性检测及质量控制菌株，唐然（核农学报，2010，24(2)）等分离到一株耐辐射的菌株K. rosea。尚未见沼泽考克氏菌用于处理工业废水的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有天然生长优势的、可以优先利用亚硝酸盐作为电子受体的新菌株沼泽考克氏菌。新菌株的发现有利于促进短程硝化反硝化工艺和同步硝化反硝化工艺在实际污水处理过程中的应用。
本发明提供一株考克氏菌株：沼泽考克氏菌（Kocuria palustris）FSDN-A，2011年7月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.5061。
本发明提供的沼泽考克氏菌（Kocuria palustris）FSDN-A，主要形态特征为：菌落颜色为黄色、菌株个体呈球状，无芽孢，能运动。
本发明所述的沼泽考克氏菌FSDN-A生理生化特征表现为：革兰氏染色为阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性。
本发明的沼泽考克氏菌FSDN-A能够优先以亚硝氮为氮源进行反硝化脱氮，同时还能够以硝氮为氮源进行反硝化脱氮。
本发明提供的反硝化菌16SrRNA基因序列见序列表。
本发明提供的沼泽考克氏菌FSDN-A，主要应用于短程反硝化脱氮。该菌株生长速度快、细胞产量高，要求C/N比低，无论是新鲜培养液还是超低温保藏的培养液均具有较高的脱氮活性。该菌株短程反硝化脱氮的条件为：温度15℃～35℃；pH6.5～10.0；碳氮质量比2：1~5：1；溶解氧为0.2~1.5mg/L。
本发明的沼泽考克氏菌节杆菌在处理含氮废水时，能够耐受高浓度亚硝酸盐氮、最高可达500mg/L，降解速率能大于20mg/(L·h)；能够耐受总氮浓度最高可达800mg/L。
本发明的沼泽考克氏菌FSDN-A能够利用低浓度碳源进行反硝化，节省反硝化所需要的碳源，同时能够耐受高浓度的有机碳源。
本发明的沼泽考克氏菌在处理含氮废水时，工艺简单，在低浓度有机碳源存在的情况下仍然具有较高的脱氮活性，同时能够耐受高浓度有机碳源。投入使用后系统启动快，在各类废水脱氮处理过程中具有非常广阔的应用前景，特别适合短程硝化反硝化或者同步硝化反硝化过程中，在脱氮效果不理想的情况下可以作为生物修复剂进行补加。还可以制备生物菌剂。
生物材料保藏说明
本发明提供的沼泽考克氏菌（Kocuria palustris）FSDN-A菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC NO.5061；保藏日期：2011年7月14日。
具体实施方式
本发明的考克氏菌FSDN-A是从中国石油抚顺石油三厂污水处理厂活性污泥中筛选得到，能够以亚硝氮和硝氮为氮源进行反硝化脱氮，其生理生化试验结果见表1。
表1 考克氏菌FSDN-A的生理生化试验结果
| 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 |
| 细胞形态 | 球状 | 革兰氏染色 | 阳性 | 接触酶 | ＋ |
| 硝酸盐还原 | ＋ | VP反应 | － | 15%NaCl | － |
| 对照 | － | a-D-乳糖 | － | 塔格糖 | － |
| a-环糊精 | － | Lactulose | － | D-海藻糖 | － |
| b-糊精 | ＋ | 麦芽糖 | － | 松二糖 | － |
| 糊精 | － | 麦芽三糖 | ＋ | 木糖醇 | － |
| 糖原 | － | D-甘露醇 | － | D-木糖 | － |
| 菊粉 | － | D-甘露糖 | － | 乙酸 | － |
| 甘露聚糖 | － | 松三糖 | ＋ | a-羟基丁酸 | － |
| Tween40 | ＋ | D-蜜二糖 | － | b-羟基丁酸 | － |
| Tween80 | ＋ | a-甲基半乳糖苷 | － | g-羟基丁酸 | － |
| N-乙酰葡萄糖胺 | － | b-甲基半乳糖苷 | － | 扁桃酸 | － |
| N-乙酰甘露糖胺 | － | 3-甲基-D-葡萄糖 | － | a-氧代戊二酸 | － |
| 苦杏仁苷 | － | a-甲基葡糖苷 | ＋ | a-酮戊酸 | － |
| L-阿拉伯糖 | － | b-甲基葡糖苷 | － | 乳酰胺 | － |
| D-阿糖醇 | ＋ | a-甲基甘露糖苷 | － | 乳酸甲酯 | － |
| 熊果苷 | － | palatinose | ＋ | L-乳酸 | － |
| D-纤维二糖 | ＋ | D-阿洛酮糖 | ＋ | D-苹果酸 | － |
| D-果糖 | ＋ | D-棉子糖 | ＋ | L-苹果酸 | － |
| 岩藻糖 | － | L-鼠李糖 | － | 丙酮酸甲酯 | － |
| D-半乳糖 | ＋ | D-核糖 | ＋ | 丁二酸一甲酯 | － |
| 半乳糖醛酸 | － | 水杨苷 | － | 丙酸 | － |
| 龙胆二糖 | － | 景天庚酮聚糖 | － | 丙酮酸 | － |
| D-葡糖酸 | － | D-山梨醇 | － | 琥珀酰胺酸 | － |
| a-D-葡萄糖 | ＋ | 水苏糖 | － | 丁二酸 | － |
| m-肌醇 | － | 蔗糖 | ＋ | N-乙酰谷氨酸 | － |
| 氧化酶 | － | 焦谷氨酸 | － | 尿苷 | － |
| pH4.5生长 | － | L-丝氨酸 | － | 酰苷酸 | － |
| L丙氨酰胺 | ＋ | 腐胺 | － | 胸苷酸 | － |
| D-丙氨酸 | － | 2,3-丁二醇 | － | 尿苷酸 | － |
| L-丙氨酸 | － | 甘油 | － | D-果糖糖-6-磷酸 | － |
| L-丙氨酰甘氨酸 | － | 腺苷 | － | D-葡糖-1-磷酸 | － |
| L-天冬酰胺 | － | 2-脱氧腺苷 | － | D-葡糖-6-磷酸 | － |
| L-谷氨酸 | － | 肌苷 | ＋ | D,L-甘油磷酸盐 | － |
| 甘氨酰谷氨酸 | － | 胸苷 | － |
经“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”鉴定，该菌株属于沼泽考克氏菌（Kocuria palustris），命名为FSDN-A。
实施例1 细菌的富集培养和分离纯化
1. 反硝化细菌的富集培养
取污水处理场硝化池内的活性污泥，利用含有亚硝酸盐的培养基在低溶解氧条件下进行富集培养一定时间，获得反硝化活性污泥。富集过程中适时补充新鲜培养液。
富集培养液配方：NaNO2，甲醇，还含有包含Fe2＋、Mg2＋、K＋、Ca2＋四种金属阳离子。培养条件为：温度30℃；pH 为 8.2， DO（溶解氧）为0.2-1.0 mg·L–1。
四种金属阳离子摩尔配置比例为1:(4-8):(5-15):(1-5)。培养过程中每天补加金属阳离子总浓度为0.15mol/L的生长促进剂，补加量为反应器内物料体积的0.1%。
2 反硝化细菌的筛选
吸取1ml上述富集培养液，用蒸馏水重悬并尽可能将颗粒打散，取菌悬液稀释不同的倍数后涂布已经渗透反硝化培养液的牛肉膏蛋白胨平板，30℃培养进行反硝化细菌的筛选，培养过程中定期观察菌体的生长状况，重复上述操作直到获得单菌落。挑取平板上的单菌落划线进行单株纯化，转接两次，即获得纯化的菌株FSDN-A。
分离培养基配方：牛肉膏：5g/L，蛋白胨：10g/L，NaNO2：1g/L，平板加入2%的琼脂。
实施例2 本发明菌株脱氮能力考察
首先从平板上挑取单菌落FSDN-A接种到牛肉膏蛋白胨培养基中30℃、120r/min摇床培养42h后菌体浓度最大，结束培养。将菌悬液离心后转入亚硝酸钠培养液中在同样条件下采取批次补料的方式进行脱氮能力考察，以润滑油废水作为碳源。进水亚硝氮浓度为150~400mg/L，总氮浓度为200~780mg/L，COD浓度为300~800mg/L。在批次补料并逐渐提高浓度的过程中，反应进行24h，亚硝氮去除速率最高可达26.17mg/(L·h)，总氮和COD去除率均可达90%以上。由此可见该菌株具有较高的脱氮和去除有机污染物能力。
实施例3 本发明菌株在催化剂废水脱氮过程中的应用
取一定量实施例2获得的菌悬液按照15%（体积）的接种量进行接种，在温度30℃、pH 为 8.0、DO（溶解氧）为0.3mg·L– 1条件下，对催化剂生产过程中产生的含氨废水短程硝化出水进行反硝化处理，该水中COD为800 mg/L ~1200mg/L，NO2 --N为500 mg/L ~780mg/L，NO3 --N为10mg/L。经过处理后废水中总氮去除率达95%以上、COD去除率达90%以上。
实施例4 本发明菌株在某炼油废水处理过程中的应用
取一定量实施例2获得的菌悬液按照15%的接种量进行接种，在温度28℃、pH 为 7.7、DO（溶解氧）为0.5~1.5mg·L– 1条件下，处理某炼油废水，该水中： COD平均为800mg/L，TN（总氮）平均为400mg/L。经过处理后出水TN和COD浓度分别为9mg/L ~24.5mg/L和51mg/L~92mg/L，TN和COD去除率分别大于94%和88%。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国石油化工股份有限公司
中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院
<120> 一株考克氏菌株及其应用
<130> 新申请
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1392
<212> DNA
<213> Kocuria palustris
<400> 1
ggctcctcca caagggttgg gccaccggct tcgggtgtta ccgactttcg tgacttgacg 60
ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcagcg ttgctgatct gcgattacta 120
gcgactccga cttcatgagg tcgagttgca gacctcaatc cgaactgaga ccggcttttt 180
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cgtcaattcc tttgagtttt agccttgcgg ccgtactccc caggcggggc acttaatgcg 600
ttagctacgg cgcggaaaac gtggaatgtc ccccacacct agtgcccaac gtttacggca 660
tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccatgct ttcgctcctc agcgtcagta 720
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1.一株考克氏菌株：沼泽考克氏菌（Kocuria palustris）FSDN-A，2011年7月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.5061。
2.权利要求1所述沼泽考克氏菌FSDN-A应用于短程反硝化脱氮。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于沼泽考克氏菌FSDN-A用于短程反硝化脱氮的操作条件为温度15℃～35℃；pH6.5～10.0；溶解氧为0.2~1.5mg/L；碳氮质量比2:1~5:1。
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