CN102465106B - 一种短程反硝化脱氮菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种短程反硝化脱氮菌株及其应用。短程反硝化脱氮的菌株为水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)FDN-2，2010年3月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.3659。该菌株可以直接利用亚硝酸盐氮作为底物，完成短程反硝化过程。本发明的水氏黄杆菌FDN-2在处理含氨废水时，工艺简单，能够耐受高浓度有机碳源。投入使用后系统启动快，在各类废水脱氮处理过程中具有非常广阔的应用前景。

Description

一种短程反硝化脱氮菌株及其应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种高效亚硝酸型(短程脱氮)反硝化菌株。本发明的脱氮菌株能以亚硝氮为氮源进行反硝化，特别适用于含氨废水短程硝化反硝化过程中的脱氮。

背景技术

传统的生物脱氮工艺主要包括硝化和反硝化两个过程，硝化是反硝化过程的前提，反硝化过程才能真正脱除废水中的含氮化合物。由于硝化菌有强烈的好氧性，硝化过程是好氧的；而反硝化菌一般为兼性细菌，在有氧条件下即以氧作为电子受体，进行有氧呼吸，只有无氧状态时才以硝酸盐或亚硝酸盐作为电子受体，获取合成细胞体的能量。一般认为在好氧条件下，硝酸或亚硝酸还原酶不能表达或氧分子会对这些酶产生抑制。如当溶解氧分别大于4.05mg/L、2.15mg/L、0.25mg/L时Pseudomonas nautica硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氮氧化物还原酶完全失活。

传统的脱氮工艺大多是将硝化和反硝化设置在两个构筑物中进行分级脱氮，存在污水处理工艺流程较长，基建投资高，需要向硝化池补充碱度等不足。所以一些新型的、效果更好的脱氮微生物，如异养硝化细菌、好氧反硝化细菌、厌氧氨氧化细菌等相继被发现。

目前为止已分离出60多种反硝化菌，主要分布于假单胞属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligeneas)、泛养硫球菌属(Thiosphera pantotroph)、动胶菌属(Zoogloeas)和芽孢杆菌属(Bacillus)等，大多数为兼性厌氧菌。Lukow从垃圾渗滤液的硝化工段分离出属于Zoogloeas一株菌TL1(Aerobic denitrification bya newly isolated heterotrophic bacterium strain TL 1[J].Biotechnology Letters，199711(19)：1157～1159)，该菌可以同时利用氧和降解硝酸盐。Naokia筛得两株反硝化菌，分别为Pseudomonas stutzeri TR2和Pseudomonas sp.K50(Aerobic Denitrifying Bacteria that Produce low Levels of Nitrous Oxide[J].Applied and Environmental Microbiology，2003，69(6)：3152-3157)。张光亚(华侨大学学报，2004，25(1))从土壤中分离出一株以硝酸钠为氮源的好氧反硝化菌HN，经鉴定为Rhodococcus sp.，王琳等(环境科学，2009，(30)1)以硝酸盐氮为电子受体、以柠檬酸钠为碳源、从河流沉积物中分离到一株粪产碱杆菌(Acaligenes faecalis)。王晓宇等(环境科学学报，2009，(29)1)从活性污泥中分离到假单胞产碱杆菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)和假单胞菌属门多萨菌(Pseudomonas mendocina)。以上对反硝化微生物的研究主要集中在以硝酸盐氮为电子受体的反硝化菌。张小玲等(微生物学通报，2008，35(10))从池塘底泥中分离到一株好氧反硝化菌株H2，经初步鉴定属于芽孢杆菌属，该菌株对亚硝酸盐最高降解速率为0.885mg/(L·d)；李兵等(水生生态杂志，2009，2(3))从土壤中筛选到芽孢杆菌D5，该菌株的最大降解速率为2.22mg/(L·h)。安健等(环境科学研究，2010，23(1))从对虾养殖池塘中筛选到一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)YX-6，该菌株能够在14h内将亚硝酸盐氮由10mg/L降至0。以上分离到的降解亚硝酸盐氮菌株都属于芽孢杆菌属(Bacillus)，这些菌株能以亚硝氮为电子受体进行反硝化脱氮，且降解速率可达10mg/(L·h)，所处理废水的亚硝酸盐氮浓度也达到了100mg/L。

黄杆菌属作为一种环境微生物，已经分离筛选到具有降解多芳烃、产生絮凝剂和对溴氨酸脱色等能力的多株菌。王蕾等(环境科学学报，2009，29(5))研究了一株芽胞杆菌CN2和一株黄杆菌CN4在初始pH＝6.00的条件下对芘的降解过程；王兆慧等(安徽农业科学，2009，35)分离到一株产絮凝剂的黄杆菌属菌株B2；徐新阳等(东北大学学报，2005，08)从河水底泥中筛选出一株能有效去除COD_Cr的黄杆菌(Flavobacterium sp.)，其固定化颗粒对污染地表水中COD_Cr的去除率为86.27％，明显高于游离菌对CODCr的去除率59.65％；聂麦茜等(微生物学通报，2001，05)分离出两株降解多环芳烃(蒽、菲、芘)的黄杆菌FCN1及FCN2。辛保平等(中国环境科学，2000，04)从受污土壤中筛选出对溴氨酸具有高效脱色能力的黄杆菌BX 26。上述黄杆菌属菌株不涉及降解废水中的亚硝氮。CN200710065133.7公开了一株多食黄杆菌(Flavobacterium omnivorum)AS 1.2747在低温污水处理中的应用，本发明多食黄杆菌在较低的温度下可以有效去除污水中淀粉、蛋白、脂肪和BOD、COD；CN200810060637.4公开了一种产角蛋白酶的粘金黄杆菌Chryseobacterium L99及其分离方法；CN200910085651.4公开了一种分解木质纤维素的菌剂中涉及水生黄杆菌(Flavobacterium aquatile)；CN200910039089.1公开的一种低浓度挥发性混合有机废气生物净化菌种的培育方法中涉及黄杆菌属；CN200510068342.8公开了治理油污土壤的方法及其专用菌群中涉及一株黄杆菌(Flavobacterium sp.)dn2；CN200710057625.1公开的一种微污染原水富氧生物预处理除污染工艺中涉及黄杆菌。尚未见水氏黄杆菌用于处理工业废水中亚硝酸盐氮的报道。

因此获得高效的降解亚硝酸盐氮菌株，并使其真正应用于实际废水处理过程中、成为反应体系中的优势种群而发挥反硝化作用仍然是研究的方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有天然生长优势的、直接以亚硝酸盐作为电子受体的新菌株水氏黄杆菌，本发明提供的水氏黄杆菌亚硝酸还原酶活性高，在有氧和无氧条件下均能够表达。新菌株的发现有利于促进短程硝化反硝化工艺和同步硝化反硝化工艺在实际污水处理过程中的应用。

本发明提供一种用于短程反硝化脱氮的新菌株：水氏黄杆菌(Flavobacteriummizutaii)FDN-2，2010年3月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.3659。

本发明提供的水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)FDN-2主要形态特征为：菌落颜色为白色、菌株个体呈杆状，无芽孢。

所述的水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)FDN-2的生理生化特征表现为：革兰氏染色为阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，能利用多种碳源。

本发明的水氏黄杆菌FDN-2能以亚硝氮为氮源进行反硝化脱氮，亚硝酸还原酶的表达不受溶解氧条件限制，在有氧和缺氧环境下均能进行反硝化。

本发明提供的水氏黄杆菌FDN-2的16SrRNA基因序列见序列表(其中的n表示未鉴别的)。

本发明提供的水氏黄杆菌FDN-2，主要应用于短程反硝化脱氮，该新菌株生长速度快、细胞产量高，要求C/N比低，无论是新鲜培养液还是超低温保藏的培养液均具有较高的脱氮活性。该菌株短程反硝化脱氮的条件为：温度15℃～35℃；pH6.5～10.0；碳氮质量比3∶1～10∶1。

本发明的水氏黄杆菌FDN-2在处理含氮废水时，能够耐受高浓度亚硝酸盐氮、最高可达400mg/L，降解速率能大于10mg/(L·h)。

本发明的水氏黄杆菌FDN-2能够耐受高浓度的有机碳源，在脱氮的同时能去除COD。

本发明的水氏黄杆菌在处理含氮废水时，工艺简单，能够耐受高浓度有机碳源。投入使用后系统启动快，在各类废水脱氮处理过程中具有非常广阔的应用前景，特别适合短程硝化反硝化或者同步硝化反硝化过程中，在脱氮效果不理想的情况下可以作为生物修复剂进行补加。还可以制备脱氮菌剂。

生物材料保藏说明

本发明提供的水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)FDN-2菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC NO.3659；保藏日期：2010年3月11日。

附图说明

图1是Flavobacterium mizutaii FDN-2在平板上的生长状态。

图2是Flavobacterium mizutaii FDN-2的脱氮效果。

具体实施方式

本发明的水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)FDN-2是从抚顺石油三厂污水处理厂活性污泥中筛选得到，能够以亚硝氮为氮源进行反硝化脱氮，其生理生化试验结果见表1。

表1水氏黄杆菌FDN-2的生理生化试验结果

经“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”鉴定，该菌株属于水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)命名为FDN-2。图1为该水氏黄杆菌在琼脂平板上的生长状态，该菌落为白色、乳状、色纯。

实施例1细菌的富集培养和分离纯化

1.反硝化细菌的富集培养

取硝化池内的活性污泥，利用含有亚硝酸盐的培养基在低溶解氧条件下进行富集培养一定时间，获得反硝化活性污泥。富集过程中适时补充新鲜培养液。

富集培养液配方：NaNO₂，甲醇，还含有包含Fe²⁺、Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺四种金属阳离子。培养条件为：温度30℃；pH为8.2，DO(溶解氧)为0.2-1.0mg·L^-1。

四种金属阳离子的摩尔配置比例为1∶(4-8)∶(5-15)∶(1-5)。培养过程中每天补加金属阳离子总浓度为0.15mol/L的生长促进剂，补加量为反应器内物料体积的0.1％。

2反硝化细菌的筛选

吸取1ml上述富集培养液，用蒸馏水重悬并尽可能将颗粒打散，取菌悬液稀释不同的倍数后涂布已经渗透反硝化培养液的牛肉膏蛋白胨平板，30℃培养进行反硝化细菌的筛选，培养过程中定期观察菌体的生长状况，重复上述操作直到获得单菌落。挑取平板上的单菌落划线进行单株纯化，转接两次，即获得纯化的菌株FDN-2。

分离培养基配方：牛肉膏：5g/L，蛋白胨：10g/L，NaNO₂：1g/L，平板加入2％的琼脂。

实施例2本发明菌株脱氮能力考察

首先从平板上挑取单菌落FDN-2接种到牛肉膏蛋白胨培养基中30℃、120r/min摇床培养48h后菌体浓度最大，结束培养。将菌悬液离心后转入亚硝酸钠-甲醇培养液中在同样条件下采取批式换水和批次补料两种方式进行脱氮能力考察。表1是批式换水情况下本发明菌株对亚硝氮和COD的同时去除效果。从表中的数据来看，进水总氮浓度由241mg/L提高到361mg/L过程中，总氮去除率始终大于90％，在COD/TN为13.2～10.0∶1情况下，COD去除率大于78％。可见该菌株在处理总氮的同时还能够去除高浓度COD。

表1FDN-2菌株脱氮能力驯化结果

图2是批次补料条件下转接菌体对亚硝氮的去除效果。从亚硝氮浓度随时间的变化趋势可以看到，转接的菌悬液仍然具有较好的脱氮能力。在批次补料并逐渐提高浓度的过程中，亚硝氮去除速率由2.0mg/(L·h)逐渐提高到16.33mg/(L·h)。由此可见该菌株具有较高的反硝化能力，在批次补料并在一定范围内逐渐提高浓度的过程中，菌株的脱氮能力会逐渐增强。

实施例3本发明菌株在味精废水脱氮过程中的应用

取一定量实施例2获得的菌悬液按照15％的接种量进行接种，在温度28℃、pH为7.7、DO(溶解氧)为0.8mg·L^-1条件下，处理味精生产过程中产生的含氨废水的短程硝化反应出水，该水中：NO₂ ^--N平均为200mg/L，COD平均为800mg/L。经过处理后出水NO₂ ^--N和COD平均浓度分别为5.7mg/L和46mg/L，NO₂ ^--N和COD平均去除率分别为97％和87％。

实施例4本发明菌株在催化剂废水脱氮过程中的应用

取一定量实施例2获得的菌悬液按照15％的接种量进行接种，在温度30℃、pH为8.0、DO(溶解氧)为0.3mg·L^-1条件下，对催化剂生产过程中产生的含氨废水短程硝化出水进行反硝化处理，该水中COD为800mg/L～1200mg/L，NO₂ ^--N为500mg/L～780mg/L，NO₃ ^--N为10mg/L。经过处理后废水中总氮去除率达92％以上。

Claims (8)

1.一种短程反硝化脱氮菌株：水氏黄杆菌(Flavobacterium mizutaii)FDN-2，2010年3月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.3659。

2.按照权利要求1所述的菌株，其特征在于水氏黄杆菌FDN-2的形态特征为：菌落颜色为白色、菌株个体呈杆状，无芽孢。

3.按照权利要求1所述的菌株，其特征在于水氏黄杆菌FDN-2的生理生化特征表现为：革兰氏染色为阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，能利用多种碳源。

4.按照权利要求1所述的菌株，其特征在于水氏黄杆菌FDN-2能以亚硝氮为氮源进行反硝化脱氮，在脱氮的同时能去除COD。

5.按照权利要求1或4所述的菌株，其特征在于水氏黄杆菌FDN-2亚硝酸还原酶的表达不受溶解氧条件限制，在有氧和缺氧环境下均能进行反硝化。

6.按照权利要求1所述的菌株，其特征在于水氏黄杆菌FDN-2能够耐受亚硝酸盐氮达400mg/L。

7.权利要求1～6任一权利要求所述水氏黄杆菌FDN-2应用于短程反硝化脱氮。

8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于水氏黄杆菌FDN-2用于短程反硝化脱氮的操作条件为温度28℃～30℃；pH7.7～8.0；碳氮质量比3∶1～10∶1。

Images