CN102443550B

CN102443550B - 一种脱氮细菌的筛选方法

Info

Publication number: CN102443550B
Application number: CN201010510855.0A
Authority: CN
Inventors: 高会杰; 黎元生; 李志瑞; 许谦; 刘忠生
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Priority date: 2010-10-12
Filing date: 2010-10-12
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2030-10-12
Also published as: CN102443550A

Abstract

本发明公开了一种脱氮细菌的筛选方法，过程包括：(1)用含氨污水对好氧活性污泥进行脱氮菌群的富集培养；(2)在低溶解氧条件下进行异养菌群的培养；(3)从富集的异养菌群中分离纯化异养硝化细菌；(4)对纯化的异养硝化细菌进行生长能力驯化；(5)用含氨污水对纯化的菌体进行脱氮能力驯化。本发明方法筛选到的脱氮细菌应用于污水脱氮处理，除了能够克服传统生物脱氮技术存在的不足外，还能在不同的环境条件下作为生物修复剂补加到受冲击的污水处理系统中，快速恢复系统的处理能力，具有硝化脱氨氮能力的同时还具有反硝化脱总氮的能力，为同步硝化反硝化脱氮准备了条件。

Description

一种脱氮细菌的筛选方法

技术领域

本发明属于环境微生物技术领域，具体地说涉及一种既具有硝化生物学活性又具有反硝化能力脱氮细菌的筛选方法。

背景技术

传统生物脱氮工艺大多是由两类细菌在两个不同的反应器内进行，因此导致系统占地面积大，抗冲击能力弱。同步硝化反硝化(SND)脱氮可以在同一反应器中同时进行硝化脱氨氮和反硝化脱总氮，这一新型生物脱氮工艺不仅克服了传统生物脱氮过程存在的一些问题，而且在降低能耗和物耗等方面具有突出的优势：能有效地保持反应器中pH稳定，减少或取消碱度的投加；减少传统反应器的容积、节省基建费用；仅由一个反应池组成的序批式反应器来讲，SND能够降低实现硝化反硝化所需的时间；节省曝气量、进一步降低能耗。这一工艺符合目前大力提倡的节能减排要求，成为污水处理领域的研究热点。

国外有研究者将硝化菌和反硝化菌置于同一反应器中混合培养，虽可以达到单个反应器的同步硝化反硝化，但是反硝化结果不尽人意，离实际应用还有一定的距离。国内也进行了一些相关的研究工作，耿金菊等利用好氧反硝化菌群和自养硝化菌群组合脱氮(应用与环境生物学报，2002，8(1)：78-82)，虽然具有较好的氨氮脱除能力，但抗冲击能力较弱，高于300mg/L的高浓度氨氮能抑制菌体的生长，并且氨氮浓度高于200mg/L时，脱氮后氨氮残余量较多，同时不耐受高浓度有机碳，500mg/L的有机碳浓度抑制菌体生长并降低脱氮效果。

目前对同步硝化反硝化生物脱氮机理已经形成了三种解释，即宏观环境解释、微观环境理论和生物学解释，他们已经在大量的研究中得到证实并被普遍接受。无论是哪种机理，负责脱氮的微生物都是完成生物脱氮过程的主要参与者。20世纪80年代以来，生物科学家研究发现许多硝化菌如荧光假单胞菌(Pseudomonas flurescens)、粪产杆菌(Alcaligenes facealis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos)等都可以对有机或无机氨化合物进行异养硝化。与自养型硝化菌比较，虽然单位生物量的异养菌氧化铵盐的速率比自养菌要慢2-3个数量级，但异养硝化细菌的生长速度快、细胞产率高；要求溶解氧浓度低；对环境的适应能力也强，能忍受更酸性环境，其总体的氧化铵盐的速率并不比自养菌慢。国外有研究者就是利用某些微生物种群在好氧条件下具有反硝化的特性来实现同步硝化与反硝化。

尽管SND工艺具有明显的优点，具有很大的发展前景，但是影响该工艺的生态因素很多而且相互关联，如何根据各种不同废水的水质特点寻找其主要的控制因素，并综合考虑各种因素，使同步硝化反硝化稳定高效，还需要深入研究和探讨；同时，好氧颗粒污泥培养时间相当长，形成条件苛刻，阻碍了工业生产中的应用；许多微生物的特性还没有被全面了解，好氧反硝化和异养硝化的机理也不十分明确，对他们的研究大都是在纯的或混合的细菌培养中进行的。所以到目前为止，仅有荷兰、丹麦、意大利等污水厂利用同步硝化与反硝化脱氮工艺运行，还没有大规模推广应用。

随着同步硝化反硝化工艺的深入研究，具有好氧反硝化特性的异养硝化细菌的发现从理论上进一步增加了污水硝化与反硝化在一个单元内同步进行的可能性，同时克服传统处理工艺在处理效率与经济适用两方面的矛盾，实现废水高效而经济的脱氮。那么获得高效的降解菌株、使其成为反应体系中的优势种群而发挥脱氮作用、将会加快同步硝化反硝化工艺工业化应用的进程。

CN1884480A描述了一种利用牛肉膏培养基进行富集，然后从牛肉膏蛋白胨固体培养基中挑取单菌落，再顺序接种于氨化培养基和亚硝化培养基中进行培养纯化获得异养硝化菌的过程。CN1786184A公开了一种分离筛选异养硝化细菌的方法，该方法是将混合微生物菌群涂布于牛肉膏蛋白胨平板，挑取单菌落进行划线纯化得到纯菌，然后将纯菌菌苔接种于氨氧化能力鉴定培养液，采用格利斯试剂直接点滴入适量培养液中进行硝化活性鉴定。以上方法获得的异养硝化细菌在遇到高浓度氨氮污水冲击时，总氮去除能力显得不足。CN101434905A描述了一种分离筛选异养硝化菌的方法，该方法获得的异养硝化细菌从牛肉膏蛋白胨培养基中分离得到，没有经过其他碳源的驯化过程，在处理不同的污水时受到限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选具有天然生长优势的脱氮细菌的方法，该方法筛选到的异养硝化细菌同时具有好氧反硝化特性，应用于污水脱氮处理时，除了能够克服传统生物脱氮技术存在的不足外，还能在不同的环境条件下作为生物修复剂补加到受冲击的污水处理系统中，快速恢复系统的处理能力，为同步硝化反硝化脱氮准备了条件。

本发明脱氮细菌的筛选方法包括以下内容：

(1)用含氨污水对好氧活性污泥进行脱氮菌群的富集培养；

(2)在低溶解氧条件下进行异养菌群的培养；

(3)从富集的异养菌群中分离纯化异养硝化细菌；

(4)对纯化的异养硝化细菌进行生长能力驯化；

(5)用含氨污水对生长能力驯化后的菌体进行脱氮能力驯化。

步骤(1)富集好氧脱氨氮活性污泥可以为本领域现有任何方法。优选逐渐提高基质氨氮浓度的方式进行富集，培养过程培养液氨氮初始浓度为100～600mg/L，最终氨氮浓度为700～2000mg/L，优选1000～1500mg/L，培养液COD值低于400mg/L，优选为低于200mg/L，一般为100～400mg/L，优选100～200mg/L。当氨氮浓度降低至为150mg/L以下时，提高基质氨氮浓度同时补加碳源保证培养液COD浓度不低于100mg/L，每次提高氨氮浓度50～400mg/L(比上批次初始氨氮浓度)。接种污泥可以选取本领域常用的具有硝化作用的活性污泥，优选取自炼油和炼油催化剂污水处理厂的活性污泥。所述富集培养条件为：温度20～40℃；pH 6.0～9.0，优选6.5～8.0；DO(溶解氧)大于2mg·L^-1，优选2～10mg·L^- ¹。

步骤(2)异养菌群的培养过程中，培养液COD值大于400mg/L，优选大于800mg/L，一般为400～5000mg/L，培养液氨氮浓度为700～2000mg/L，优选1000～1500mg/L，培养至氨氮浓度降低至150mg/L以下。所述培养条件DO(溶解氧)低于0.5mg·L^-1，温度20～40℃；pH 6.0～9.0，优选6.5～8.0。

步骤(3)采用平板稀释法或平板划线法对异养菌群进行分离纯化，培养基可以是本领域常用的培养基。具体操作：取一定量的泥水混合物稀释不同的倍数后接种于含有硝酸盐氮的固体培养基平板中，以甲基蓝做指示剂进行初筛；选取变蓝色的单菌落稀释不同的倍数后接种于含有氨氮的固体平板进行复筛，重复上述操作2～6次直到获得纯化菌株。培养条件为25～35℃恒温静置培养，培养液中除了含有硝酸盐外，还含有Fe²⁺、Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺等金属离子和磷酸根离子。

步骤(4)采用不同碳源对纯化出的菌株进行生长能力驯化，使得该菌株既能够在营养丰富价格高的优质碳源(如琥珀酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠、乙醇等)条件下生长，也能够在廉价的劣质碳源(如工业甲醇、工业废乙醇、高浓度COD污水等)条件下生长。具体方法：采取逐渐降低优质碳源逐渐提高劣质碳源的方式进行梯度驯化，梯度驯化可以分3～20次进行，从固体平板上用接菌环挑取部分菌落接入装有一定量培养液的反应器中培养，初始氮源浓度(以NO₃ ^--N计)为50～200mg/L，初始碳源浓度(以COD计)为500～5000mg/L，定期检测培养液中氮源和碳源浓度，控制生长能力驯化过程中反应系统的碳源和氮源的质量比为3∶1～20∶1，如果碳源不足补加碳源，如果碳源过剩则补加氮源，直到总氮和COD浓度分别低于15mg/L和60mg/L时终止反应。培养条件为：温度为20～35℃；pH为6.5～9.8，优选7.0～8.5；DO(溶解氧)为0.5～5mg·L^-1，优选为0.2～1mg·L^-1。

步骤(5)采取不同的溶解氧条件进行脱氮能力驯化。具体过程：将步骤(4)获得的菌悬液按照一定的接种量接入含有氨氮的液体培养液中进行驯化，碳源可以是任何微生物能够利用的有机碳源。驯化过程中采取菌体转接、批次换水或者批次补料的方式，并逐渐提高氮源和碳源浓度，最终达到欲处理废水中氮和碳的浓度。如果欲处理废水氮浓度较低，可以直接用欲处理废水进行脱氮能力驯化。驯化过程中，温度为20～35℃；pH为6.5～9.8，优选7.0～8.5，给予不同的溶解氧和COD浓度条件进行菌体驯化。

本发明方法从高氨氮、低COD废水驯化的好氧污泥中培养利用低溶解氧的异养菌群，再进行异养硝化细菌的分离筛选，获得在苛刻环境条件下能够存活、在适宜环境条件能够脱氮的菌株。

本发明方法获得的异养硝化细菌可以直接将氨氮转化为氮气，也可以在硝酸盐存在的情况下进行反硝化脱氮，在溶解氧充足的情况下可以利用高浓度的碳源完成反硝化脱氮反应，在溶解氧不足的情况下可以利用低浓度的碳源完成反硝化脱氮反应。溶解氧浓度不同可以获得不同的脱氮和除COD效果。所以该异养硝化细菌在一定程度上不受碳源浓度的限制，可以适应不同溶解氧浓度和不同碳源浓度，因此对环境条件的适应能力强，耐受性好，适用于各种含氮和COD的污水处理。当污水处理厂受到冲击时还可以作为生物修复剂进行补加。

本发明脱氮菌株的筛选方法首先在好氧污泥这种群体内分离出适应能力和耐受冲击能力强的脱氮菌群，然后在低溶解氧条件下进行异养菌群的培养，再进行异养硝化细菌的分离纯化。对纯化的异养硝化细菌进行碳源利用驯化和不同溶解氧条件驯化，可以使该生物能够适用于各种含有COD和氮素的污水处理；同时根据不同的COD浓度和总氮浓度，可以提供不同的溶解氧条件，以保证处理后污水中的COD和总氮浓度均能满足达标排放要求。不同的培养驯化阶段优化生物对不同培养条件的适应性，获得了综合优化效果，得到的微生物菌群适应范围广、使用性能好。

具体实施方式

本发明的特点是：首先采用好氧脱氨氮活性污泥进行富集，以获得在好氧、低碳源的环境中能够生存的菌群，利用含COD的废水对富集污泥进行培养以获得在低浓度溶解氧条件下具有脱氮功能的异养硝化菌，然后采用不同碳源的污水在不同溶氧条件下进行对环境的耐受性驯化，最终获得在复杂环境下能够生存、在适宜条件下即可高效处理同时含有氨氮和COD污水的异养硝化细菌。

本发明异养硝化细菌具有较强的耐受性和适应性，具有较好的抗冲击性，能同时脱氮和除COD，具有较好的去处效果；可以实现同时硝化和反硝化工艺在工业污水处理中的应用。

实施例一

(1)富集培养：从中国石化镇海炼油厂污水处理厂好氧曝气池内取一定量的活性污泥，接入好氧反应器中，在温度为25℃、pH 7.5、DO(溶解氧)2.5mg·L^- ¹条件下，采用逐渐提高基质氨氮浓度的方式进行富集，污水的初始氨氮浓度为100mg/L、COD浓度为150mg/L，培养过程中当氨氮浓度低于10mg/L时，补加氮源，使氨氮浓度比上一次提高100mg/L，直到提高到1000mg/L。然后取一定量富集污泥接入兼氧反应器中，在温度为25℃、pH 7.5、DO(溶解氧)0.1mg·L^-1条件下进行异养菌体的培养，培养液中的COD浓度为1800mg/L，氨氮浓度为800mg/L。培养至氨氮浓度低于150mg/L。

(2)筛选纯化：取步骤(1)中得到的一定量的泥水混合物稀释不同的倍数后涂布于固体培养基平板中培养，培养液中硝酸盐氮浓度为100mg/L，还含有少量的Fe²⁺、Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺等金属离子以及磷酸根离子等，30℃恒温静置培养，以丁二酸钠为碳源，按照碳氮质量比10∶1配置，以溴百里芬兰做指示剂进行分离和纯化。培养2-3天后，选取变蓝色的单菌落再稀释不同的倍数后涂布于氨氮浓度为100mg/L的固体平板进行复选，重复上述操作3次后取纯化菌株。

(3)生长能力驯化：从固体平板上用接菌环挑取部分菌落接入装有一定量培养液的反应器中培养，培养液中初始氮源浓度为100mg/L，分别加入一定量的琥珀酸钠和甲醇作为碳源，初始碳源浓度(以COD计)为1200mg/L，两种碳源按照质量比10∶1、5∶1、1∶1、和单纯以甲醇为碳源对筛选出的菌株进行梯度驯化。7～9天后获得去除碳氮比为3∶1～20∶1的菌株。培养条件为：温度25℃，pH 7.5，DO(溶解氧)小于2mg·L^-1。

(4)脱氮能力驯化：将步骤(3)获得的菌悬液按照一定的接种量接入含有150mL培养液的500mL摇瓶中，以纱布封口置溶解氧浓度控制为5.0mg/L的空气振动器中进行梯度驯化。初始培养液中总氮浓度为100mg/L。当总氮去除率达到90％以上时，取一定量的菌悬液接种到浓度提高100mg/L的新鲜培养液中，重复操作直到培养液中总氮浓度提高到600mg/L。培养过程中，以甲醇为碳源，碳氮质量比为15∶1，温度为25℃；pH为7.5，驯化一定时间后即可获得总氮去除率达到90％以上的异养硝化菌。

实施例二

(1)富集培养：从中国石化催化剂公司抚顺催化剂厂污水处理厂好氧曝气池内取一定量的活性污泥，接入好氧反应器中，在温度为30℃，pH 7.8，DO(溶解氧)5mg·L^-1条件下，采用逐渐提高基质氨氮浓度的方式进行富集，污水的初始氨氮浓度为200mg/L、COD浓度为200mg/L，培养过程中当氨氮浓度低于50mg/L时，补加氨氮浓度比上一次提高150mg/L，直到提高到1500mg/L。然后取一定量富集污泥接入兼氧反应器中，在温度为30℃、pH 7.8、DO(溶解氧)0.15mg·L^-1条件下进行异养菌体的培养，培养液中的COD浓度为2500mg/L，氨氮浓度为1000mg/L。培养至氨氮浓度低于150mg/L。

(2)筛选纯化：取一定量的泥水混合物稀释不同的倍数后涂布于固体培养基平板中培养，培养液中硝酸盐氮浓度为100mg/L，还含有少量的Fe²⁺、Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺等金属离子以及磷酸根离子等，28℃恒温静置培养，以丁二酸钠为碳源，按照碳氮质量比6∶1配置，以溴百里芬兰做指示剂进行分离和纯化。培养2-3天后，选取变蓝色的单菌落再稀释不同的倍数后涂布于氨氮浓度为100mg/L的固体平板进行分离，重复上述操作6次取纯化菌株。

(3)生长能力驯化：从固体平板上用接菌环挑取部分菌落接入装有一定量培养液的反应器中培养，培养液中初始氮源浓度为150mg/L，以琥珀酸钠、柠檬酸钠和甲醇作为碳源，三种碳源按照质量比10∶5∶1、5∶3∶1、1∶1∶1、和单纯以甲醇为碳源对筛选出的菌株进行梯度驯化，总COD值为2000mg/L。7～9天后获得去除碳氮比为3∶1～20∶1的菌株。培养条件为：温度30℃，pH 7.8，DO(溶解氧)3mg·L^-1。

(4)脱氮能力驯化：将步骤(3)获得的菌悬液按照一定的接种量接入含有150mL异养菌体培养液的500mL摇瓶中，以封口膜封口置溶解氧浓度低于1.0mg/L的空气振动器中进行梯度驯化。初始培养液中总氮浓度为130mg/L。当总氮去除率达到90％以上时，补加氮源使得补加后培养液中总氮浓度提高100mg/L，重复上述操作直到培养液中总氮浓度提高到某一需要的水平。培养过程中，以甲醇为碳源，碳氮质量比为6∶1，温度为30℃，pH为7.8，驯化一定时间后即可获得碳氮比低于10∶1、总氮去除率达90％以上的异养硝化菌。

实施例三

从中国石化广州石化公司炼油污水处理厂好氧曝气池内取一定量的活性污泥，接入温度：28℃、pH：8.0、DO：4mg·L^-1的好氧反应器中进行富集，污水的初始氨氮浓度为150mg/L、COD浓度为300mg/L，培养过程中当氨氮浓度低于25mg/L时，补加氨氮浓度比上一次提高100mg/L，直到提高到1200mg/L。然后取一定量富集污泥接入兼氧反应器中，在温度为28℃、pH 7.8、DO(溶解氧)0.2mg·L^-1条件下进行异养菌体的培养，培养液中的COD浓度为2500mg/L，氨氮浓度为1200mg/L。培养至氨氮浓度低于150mg/L。

取一定量的上述泥水混合物稀释不同的倍数后涂布于固体培养基平板中培养，培养液中硝酸盐氮浓度为80mg/L，还含有少量的Fe²⁺、Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺等金属离子以及磷酸根离子等，28℃恒温静置培养，以柠檬酸钠为碳源，按照碳氮质量比12∶1配置，以溴百里芬兰做指示剂进行分离和纯化。培养2-3天后，选取变蓝色的单菌落再稀释不同的倍数后涂布于氨氮浓度为150mg/L的固体平板进行分离。

从固体平板上用接菌环挑取部分菌落接入装有一定量培养液的反应器中培养，培养液中初始氮源浓度为150mg/L，以甲醇作为碳源，对筛选出的菌株进行梯度驯化。培养条件：温度28℃，pH 8.0，DO(溶解氧)4mg·L^-1。

取一定量的菌悬液离心后弃上清液，将菌体均匀分装到两个500mL摇瓶中，一瓶用总氮浓度200mg/L、COD浓度1000mg/L的炼油污水定容到150mL，以纱布封口置溶解氧浓度为0.5mg/L的空气振动器中进行脱氮和除COD，72h后总氮和COD去除率分别达到99％和97％；另一瓶用总氮浓度280mg/L、COD浓度1000mg/L的炼油污水定容到150mL，以封口膜封口置溶解氧浓度低于1.0mg/L的空气振动器中进行脱氮和除COD，48h后总氮和COD去除率均达到99％。

实施例四

取一定量实施例二驯化后的菌体按照10％(体积)的接种量投加到曝气反应器中处理尿素生产含氨废水。该废水的氨氮浓度在300mg/L～600mg/L之间波动，按照碳氮质量比5∶1补加甲醇作为碳源，在溶解氧浓度为0.5mg/L～4.2mg/L条件下共处理10个批次，均获得良好的处理效果，氨氮和总氮去除率均达到95％以上。

Claims

1.一种脱氮细菌的筛选方法，其特征在于包括如下过程：

(1)用含氨污水对好氧活性污泥进行脱氮菌群的富集培养；

(2)在低溶解氧条件下进行异养菌群的培养；

(3)从富集的异养菌群中分离纯化异养硝化细菌；

(4)对纯化的异养硝化细菌进行生长能力驯化；

(5)用含氨污水对纯化的菌体进行脱氮能力驯化；

步骤(4)对纯化的异养硝化菌进行生长能力驯化过程如下：采取逐渐降低优质碳源逐渐提高劣质碳源的方式进行梯度驯化，从固体平板上用接菌环挑取部分菌落接入装有培养液的反应器中培养，以NO_x ^--N计的初始氮源浓度为50～200mg/L，以COD计的初始碳源浓度为500～5000mg/L，检测培养液中氮源和碳源浓度，控制生长能力驯化过程中反应系统的碳源和氮源的质量比为3∶1～20∶1，如果碳源不足补加碳源，如果碳源过剩则补加氮源，直到总氮和COD浓度分别低于15mg/L和60mg/L时终止反应；生长能力驯化培养条件为：温度为20～35℃，pH为6.5～9.8，溶解氧为0.5～5mg·L^-1；

步骤(5)脱氮能力驯化采取菌体转接、批次换水或者批次补料的方式，并逐渐提高氮源和碳源浓度，最终达到欲处理废水中氮和碳的浓度；或者直接用欲处理废水进行脱氮能力驯化；驯化过程中，温度为20～35℃，pH为6.5～9.8，给予不同的溶解氧和COD浓度条件进行菌体驯化。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)富集好氧脱氨氮活性污泥采用逐渐提高基质氨氮浓度的方式进行，培养过程培养液氨氮初始浓度为100～600mg/L，最终氨氮浓度为700～2000mg/L，培养液COD值低于400mg/L，当氨氮初始浓度降低至为150mg/L以下时，提高基质氨氮浓度，同时补加碳源保证培养液COD浓度不低于100mg/L，每次提高氨氮浓度50～400mg/L；富集培养条件为：温度20～40℃，pH6.0～9.0，溶解氧2mg·L^-1以上。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)好氧活性污泥进行富集培养过程培养液最终氨氮浓度为1000～1500mg/L，培养液COD值低于200mg/L；富集培养条件为：pH6.5～8.0，溶解氧为2～10mg·L^-1。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)异养菌群培养时溶解氧控制低于0.5mg/L，培养液COD值大于400mg/L，培养液氨氮浓度为700～2000mg/L。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)初筛时用含有硝酸盐氮的固体培养基，复筛时用含有氨氮的固体培养基。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：生长能力驯化培养条件为：pH为7.0～8.5，溶解氧为0.2～1mg·L^-1。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的优质碳源为琥珀酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠或乙醇；所述的劣质碳源为工业甲醇、工业废乙醇或高浓度COD污水。