CN102041291B - 一种反硝化菌的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种反硝化菌的筛选方法，过程包括：(1)用含氨污水对好氧活性污泥进行富集培养；(2)从富集菌群中分离纯化反硝化菌；(3)用含有目标污染物的水对纯化的反硝化菌进行生长能力驯化；(4)在不同溶解氧条件下对驯化的反硝化菌进行脱氮能力驯化。本发明方法筛选到的反硝化菌应用于污水脱氮处理，除了能够克服传统生物脱氮技术存在的不足外，还能在不同的环境条件下作为生物修复剂补加到受冲击的污水处理系统中，快速恢复系统的处理能力，为同步硝化反硝化脱氮准备了条件。

Description

一种反硝化菌的筛选方法

技术领域

本发明属于污水生物处理技术领域，具体地说涉及一种利用硝酸盐氮为唯一氮源筛选高效好氧反硝化菌的方法。

背景技术

在污水处理领域，生物脱氮被认为是经济有效的污水脱氮方法之一。传统的生物脱氮工艺将硝化和反硝化作为两个相互独立的过程，分别在不同反应器中进行，如A/A/O、A/O等；或者用间歇的好氧和厌氧条件来运行，如SBR、氧化沟等，即硝化反应发生在好氧条件下，反硝化反应发生在严格的缺氧或者厌氧条件下，使二者在时间或空间上分离。这就使得工艺流程较长、基建投资高，处理效果有限；同时，硝化池需要补充碱度、反硝化池需要补充碳源，这同样增加了运行成本。

硝化和反硝化过程由两类不同的生物来完成。一般认为，将氨氮(NH₃-N)氧化成硝态氮的硝化菌需要在好氧条件下才能完成硝化反应；而进行硝酸盐呼吸的反硝化菌只有在无氧条件下，才能诱导出反硝化作用所需要的硝酸盐还原酶A和亚硝酸还原酶，以硝酸盐和亚硝酸盐为电子受体进行反硝化脱氮，该细菌属于兼性厌氧微生物。由于微生物所需环境条件的不同，因此整个脱氮过程无论是在两个反应器中进行还是在同一反应器中进行，系统的抗冲击能力均比较差，高浓度的氨氮、硝态氮等会抑制硝化菌生长；同样，高浓度的溶解氧(DO)和碳源不足也会抑制反硝化菌生长，从而影响生物脱氮总体效果。

近年来，在许多实际运行中的好氧反硝化池中，常常发现有总氮的损失(冯叶成等，同时硝化反硝化的实验研究.上海环境科学，2002，21)。国内外不少研究和报道也证实了好氧反硝化的存在(丁爱中等.好氧生物反硝化反应的实验证据[J]科学通报，2000，45)。因此利用好氧反硝化菌开发脱氮技术，具有以下优点(1)使脱氮过程在同一个反应器中进行，可以大大减少占地面积和建设投资；(2)可以减少调节系统pH的化学物质和碳源的用量，节省药剂费用，降低运转成本；(3)在脱氮的同时还能脱除COD(化学需氧量)；(4)在处理过程中，系统的抗冲击能力增强，处理效果好。

CN1594591A公开了一种筛选好氧反硝化菌的方法，该方法采取驯化厌氧脱氮污泥的方法富集生物菌群，将驯化后得到的活性污泥内的生物菌群采用平板系数法与平板划线法分离和纯化。对分离、纯化后得到的纯菌进行初筛，得到对TN去除率达50％以上的菌株，对初筛后的菌株进行复筛，得到好氧反硝化菌。该方法获得的菌株由于采用驯化厌氧脱氮污泥的方法富集生物菌群，使得筛选菌株来源于厌氧环境，没有经历高浓度氨氮污水的好氧驯化过程，在遇到高浓度氨氮污水冲击时，总氮去除能力显得不足；该方法要求进水COD控制在4500～5500mg/L范围内，在处理不同的污水时受到了限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选具有天然生长优势的好氧反硝化菌的方法，该方法筛选到的反硝化菌应用于污水脱氮处理，除了能够克服传统生物脱氮技术存在的不足外，还能在不同的环境条件下作为生物修复剂补加到受冲击的污水处理系统中，快速恢复系统的处理能力，为同步硝化反硝化脱氮准备了条件。

本发明好氧反硝化菌的筛选方法包括以下内容：

(1)用含氨污水对好氧活性污泥进行富集培养；

(2)从富集菌群中分离纯化反硝化菌；

(3)用含有目标污染物的水对纯化的反硝化菌进行生长能力驯化；

(4)在不同溶解氧条件下对驯化的反硝化菌进行脱氮能力驯化。

步骤(1)富集好氧脱氨氮活性污泥可以为本领域现有任何方法。优选逐渐提高基质氨氮浓度的方式进行富集，培养过程培养液氨氮初始浓度为100～600mg/L，最终氨氮浓度为700～2000mg/L，优选1000～1500mg/L，培养液COD值低于400mg/L，优选低于200mg/L。当氨氮初始浓度降低至为150mg/L以下时，提高基质氨氮浓度同时补加碳源保证培养液COD浓度不低于100mg/L，每次提高氨氮浓度50～400mg/L。接种污泥可以选取本领域常用的具有硝化作用的活性污泥，优选取自炼油和炼油催化剂污水处理厂的活性污泥。所述富集培养条件为：温度20～40℃；pH 6.0～9.0，优选6.5～8.0；DO(溶解氧)大于2mg·L^-1，优选2～10mg·L^-1。

步骤(2)采用平板稀释法或平板划线法对富集活性污泥内的菌群进行分离纯化，培养基可以是本领域常用的培养基。具体操作：取一定量的泥水混合物稀释不同的倍数后接种于含有硝酸盐氮的固体培养基平板中，25～35℃恒温静置培养，培养液中除了含有硝酸盐外，还含有Fe²⁺、Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺等金属离子以及磷酸根离子等，以溴百里芬兰做指示剂进行分离和纯化。选取变蓝色的单菌落稀释不同的倍数后接种于同样的固体平板进行分离，重复上述操作直到获得纯化菌株。

步骤(3)采用不同碳源对纯化出的菌株进行生长能力驯化，使得该菌株既能够在营养丰富价格高的优质碳源(如琥珀酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠、乙醇等)条件下生长，也能够在廉价的劣质碳源(如工业甲醇、工业废乙醇、高浓度COD污水等)条件下生长。具体方法：采取逐渐降低优质碳源逐渐提高劣质碳源的方式进行梯度驯化，从固体平板上用接菌环挑取部分菌落接入装有一定量培养液的反应器中培养，初始氮源浓度(以NO₃ ^--N计)为50～200mg/L，初始碳源浓度(以COD计)为500～2000mg/L，定期检测培养液中氮源和碳源浓度，控制生长能力驯化过程中反应系统的碳源和氮源的质量比为3∶1～20∶1，如果碳源不足补加碳源，如果碳源过剩则补加氮源，直到总氮和COD浓度分别低于15mg/L和60mg/L时终止反应。培养条件为：温度为20～35℃；pH为6.5～9.8，优选7.0～8.5；DO(溶解氧)为2～10mg·L^-1，优选为3～5mg·L^-1。

步骤(4)采取不同的溶解氧条件进行脱氮能力驯化。具体过程：将步骤(3)获得的菌悬液按照一定的接种量接入含有硝酸盐氮的液体培养液中进行驯化，碳源可以是任何微生物能够利用的有机碳源。驯化过程中采取菌体转接、批次换水或者批次补料的方式，并逐渐提高氮源和碳源浓度，最终达到欲处理废水中氮和碳的浓度。如果欲处理废水氮浓度较低，可以直接用欲处理废水进行脱氮能力驯化。驯化过程中，温度为20～35℃；pH为6.5～9.8，优选7.0～8.5，给予不同的溶解氧和COD浓度条件进行菌体驯化，可以获得两种不同的脱氮路径，第一种脱氮路径控制溶解氧浓度5mg/L以上，初始培养液中氮源浓度(以NO₃ ^--N计)为50～200mg/L，碳源浓度(以COD计)为1000～2000mg/L，菌株去除的碳源和氮源质量比10∶1以上，优选为10∶1～20∶1；第二种脱氮路径控制溶解氧浓度＜5mg/L，初始培养液中氮源浓度(以NO₃ ^--N计)为50～200mg/L，初始碳源浓度(以COD计)为400～1000mg/L，菌株去除的碳源和氮源质量比＜10∶1，优选为3∶1至＜10∶1。第一种是pH上升幅度大、碳氮比高的路径，第二种是pH上升幅度小、碳氮比低的路径。

本发明方法从高氨氮、低COD废水驯化的好氧污泥中筛选好氧反硝化菌，获得在苛刻环境条件下能够存活、在适宜环境条件能够脱氮的好氧反硝化菌株。

本发明方法获得的好氧反硝化菌以硝酸盐为唯一氮源，在溶解氧充足的情况下可以利用高浓度的碳源完成反硝化脱氮反应，在溶解氧不足的情况下可以利用低浓度的碳源完成反硝化脱氮反应。溶解氧浓度不同可以获得不同的脱氮和除COD效果。所以该反硝化菌在一定程度上不受碳源浓度的限制，可以适应不同溶解氧浓度和不同碳源浓度，因此对环境条件的适应能力强，耐受性好，适用于各种含氮和COD的污水处理。当污水处理厂受到冲击时还可以作为生物修复剂进行补加。

本发明好氧反硝化菌的筛选方法首先在好氧污泥这种群体内分离出适应能力和耐受冲击能力强的反硝化菌。对筛选纯化的反硝化菌进行碳源利用驯化和不同溶解氧条件驯化，可以使该生物能够适用于各种含有COD和氮素的污水处理；同时根据不同的COD浓度和总氮浓度，可以提供不同的溶解氧条件，以保证处理后污水中的COD和总氮浓度均能满足达标排放要求。不同的培养驯化阶段优化生物对不同培养条件的适应性，获得了综合优化效果，得到的微生物菌群适应范围广、使用性能好。

具体实施方式

本发明的特点是：首先采用好氧脱氨氮活性污泥进行富集，以获得在好氧、低碳源的环境中能够生存的反硝化菌，然后采用不同碳源的污水在不同溶氧条件下进行对环境的耐受性驯化，最终获得在复杂环境下能够生存、在适宜条件下即可高效处理同时含有硝酸盐氮和COD污水的好氧反硝化菌。

本发明好氧反硝化菌具有较强的耐受性和适应性，具有较好的抗冲击性，能同时脱氮和除COD；可以实现同时硝化和反硝化工艺在工业污水处理中的应用。

实施例一

(1)富集培养：从某炼油污水处理厂好氧曝气池内取一定量的活性污泥，接入好氧反应器中，采用逐渐提高基质氨氮浓度的方式进行富集，污水的初始氨氮浓度为100mg/L、COD浓度为350mg/L，培养过程中当氨氮浓度低于10mg/L时，补加氮源，使氨氮浓度比上一次提高100mg/L，直到提高到1000mg/L。富集过程中：温度为25℃；pH 7.5，DO(溶解氧)2.5mg·L^-1左右。

(2)筛选纯化：取步骤(1)中得到的一定量的泥水混合物稀释不同的倍数后涂布于固体培养基平板中培养，培养液中硝酸盐氮浓度为100mg/L，还含有少量的Fe²⁺、Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺等金属离子以及磷酸根离子等，30℃恒温静置培养，以丁二酸钠为碳源，按照碳氮质量比10∶1配置，以溴百里芬兰做指示剂进行分离和纯化。培养2-3天后，选取变蓝色的单菌落再稀释不同的倍数后涂布于同样的固体平板进行分离，重复上述操作直到获得纯化菌株。

(3)生长能力驯化：从固体平板上用接菌环挑取部分菌落接入装有一定量培养液的反应器中培养，培养液中初始氮源浓度为100mg/L，分别加入一定量的琥珀酸钠和甲醇作为碳源，两种碳源按照质量比10∶1、5∶1、1∶1、和单纯以甲醇为碳源对筛选出的菌株进行梯度驯化。7～9天后获得去除碳氮比为3∶1～20∶1的菌株。培养条件为：温度25℃，pH 7.5，DO(溶解氧)小于5mg·L^-1。

(4)脱氮能力驯化：将步骤(3)获得的菌悬液按照一定的接种量接入含有150mL反硝化菌培养液的500mL摇瓶中，以纱布封口置溶解氧浓度控制为5.0mg/L的空气振动器中进行梯度驯化。初始培养液中总氮浓度为100mg/L。当总氮去除率达到90％以上时，取一定量的菌悬液接种到浓度提高100mg/L的新鲜培养液中，重复操作直到培养液中总氮浓度提高到600mg/L。培养过程中，以甲醇为碳源，碳氮质量比为15∶1，温度为25℃；pH为7.5，驯化一定时间后即可获得总氮去除率达到90％以上的反硝化菌。

实施例二

(1)富集培养：从某催化剂污水处理厂好氧曝气池内取一定量的活性污泥，接入好氧反应器中，采用逐渐提高基质氨氮浓度的方式进行富集，污水的初始氨氮浓度为200mg/L、COD浓度为200mg/L，培养过程中当氨氮浓度低于50mg/L时，补加氨氮浓度比上一次提高150mg/L，直到提高到1500mg/L。富集过程中：温度为30℃，pH 7.8，DO(溶解氧)5mg·L^-1左右。

(2)筛选纯化：取一定量的泥水混合物稀释不同的倍数后涂布于固体培养基平板中培养，培养液中硝酸盐氮浓度为100mg/L，还含有少量的Fe²⁺、Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺等金属离子以及磷酸根离子等，28℃恒温静置培养，以丁二酸钠为碳源，按照碳氮质量比6∶1配置，以溴百里芬兰做指示剂进行分离和纯化。培养2-3天后，选取变蓝色的单菌落再稀释不同的倍数后涂布于同样的固体平板进行分离，重复上述操作直到获得纯菌株。

(3)生长能力驯化：从固体平板上用接菌环挑取部分菌落接入装有一定量培养液的反应器中培养，培养液中初始氮源浓度为150mg/L，以琥珀酸钠、柠檬酸钠和甲醇作为碳源，三种碳源按照质量比10∶5∶1、5∶3∶1、1∶1∶1、和单纯以甲醇为碳源对筛选出的菌株进行梯度驯化。7～9天后获得去除碳氮比为3∶1～20∶1的菌株。培养条件为：温度30℃，pH 7.8，DO(溶解氧)3mg·L^-1。

(4)脱氮能力驯化：将步骤(3)获得的菌悬液按照一定的接种量接入含有150mL反硝化菌培养液的500mL摇瓶中，以封口膜封口置溶解氧浓度低于1.0mg/L的空气振动器中进行梯度驯化。初始培养液中总氮浓度为130mg/L。当总氮去除率达到90％以上时，补加氮源使得补加后培养液中总氮浓度提高100mg/L，重复上述操作直到培养液中总氮浓度提高到某一需要的水平。培养过程中，以甲醇为碳源，碳氮质量比为6∶1，温度为30℃，pH为7.8，驯化一定时间后即可获得碳氮比低于10∶1、总氮去除率达90％以上的反硝化菌。

实施例三

从某炼油污水处理厂好氧曝气池内取一定量的活性污泥，接入温度：28℃、pH：8.0、DO：4mg·L^-1的好氧反应器中进行富集，污水的初始氨氮浓度为150mg/L、COD浓度为300mg/L，培养过程中当氨氮浓度低于25mg/L时，补加氨氮浓度比上一次提高100mg/L，直到提高到1200mg/L。

取一定量的上述泥水混合物稀释不同的倍数后涂布于固体培养基平板中培养，培养液中硝酸盐氮浓度为80mg/L，还含有少量的Fe²⁺、Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺等金属离子以及磷酸根离子等，28℃恒温静置培养，以柠檬酸钠为碳源，按照碳氮质量比12∶1配置，以溴百里芬兰做指示剂进行分离和纯化。培养2-3天后，选取变蓝色的单菌落再稀释不同的倍数后涂布于同样的固体平板进行分离，重复上述操作直到获得纯菌株。

从固体平板上用接菌环挑取部分菌落接入装有一定量培养液的反应器中培养，培养液中初始氮源浓度为150mg/L，以甲醇作为碳源，对筛选出的菌株进行梯度驯化。一定时间后获得去除碳氮比为3∶1～15∶1的菌株。培养条件：温度28℃，pH 8.0，DO(溶解氧)4mg·L^-1。

取一定量的菌悬液离心后弃上清液，将菌体均匀分装到两个500mL摇瓶中，一瓶用总氮浓度200mg/L、COD浓度6000mg/L的炼油污水定容到150mL，以纱布封口置溶解氧浓度为5.0mg/L的空气振动器中进行脱氮和除COD，72h后总氮和COD去除率分别达到99％和97％；另一瓶用总氮浓度280mg/L、COD浓度1000mg/L的炼油污水定容到150mL，以封口膜封口置溶解氧浓度低于1.0mg/L的空气振动器中进行脱氮和除COD，48h后总氮和COD去除率均达到99％。

Claims (8)

1.一种反硝化菌的筛选方法，其特征在于包括如下过程：

(1)用含氨污水对好氧活性污泥进行富集培养；

(2)从富集菌群中分离纯化反硝化菌；

(3)用含有目标污染物的水对纯化的反硝化菌进行生长能力驯化；

(4)在不同溶解氧条件下对驯化的反硝化菌进行脱氮能力驯化；

步骤(3)用含有目标污染物的水对纯化的反硝化菌进行生长能力驯化过程如下：采取逐渐降低优质碳源逐渐提高劣质碳源的方式进行梯度驯化，从固体平板上用接菌环挑取部分菌落接入装有培养液的反应器中培养，以NO₃ ^--N计的初始氮源浓度为50～200mg/L，以COD计的初始碳源浓度为500～2000mg/L，检测培养液中氮源和碳源浓度，控制生长能力驯化过程中反应系统的碳源和氮源的质量比为3∶1～20∶1，如果碳源不足补加碳源，如果碳源过剩则补加氮源，直到总氮和COD浓度分别低于15mg/L和60mg/L时终止反应；

步骤(4)脱氮能力驯化采取菌体转接、批次换水或者批次补料的方式，并逐渐提高氮源和碳源浓度，最终达到欲处理废水中氮和碳的浓度；或者直接用欲处理废水进行脱氮能力驯化；驯化过程中，温度为20～35℃，pH为6.5～9.8，给予不同的溶解氧和COD浓度条件进行菌体驯化，获得两种不同的脱氮路径，第一种脱氮路径控制溶解氧浓度5mg/L以上，以NO₃ ^--N计的初始培养液中氮源浓度为50～200mg/L，以COD计的初始碳源浓度为1000～2000mg/L，菌株去除的碳源和氮源质量比10∶1以上；第二种脱氮路径控制溶解氧浓度＜5mg/L，以NO₃ ^--N计的初始培养液中氮源浓度为50～200mg/L，以COD计的初始碳源浓度为400～1000mg/L，菌株去除的碳源和氮源质量比＜10∶1。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)富集好氧脱氨氮活性污泥采用逐渐提高基质氨氮浓度的方式进行，培养过程培养液氨氮初始浓度为100～600mg/L，最终氨氮浓度为700～2000mg/L，培养液COD值低于400mg/L，当氨氮初始浓度降低至为150mg/L以下时，提高基质氨氮浓度，同时补加碳源保证培养液COD浓度不低于100mg/L，每次提高氨氮浓度50～400mg/L；富集培养条件为：温度20～40℃，pH6.0～9.0，溶解氧为2mg·L^-1以上。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)好氧活性污泥进行富集培养过程培养液最终氨氮浓度为1000～1500mg/L，培养液COD值低于200mg/L；富集培养条件为：pH6.5～8.0，溶解氧为2～10mg·L^-1。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)从富集菌群中分离纯化反硝化菌的方法采用平板稀释法或平板划线法。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：生长能力驯化培养条件为：温度为20～35℃，pH为6.5～9.8，溶解氧为2～10mg·L^-1。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：生长能力驯化培养条件为：pH为7.0～8.5，溶解氧为3～5mg·L^-1。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的优质碳源为琥珀酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠或乙醇；所述的劣质碳源为工业甲醇、工业废乙醇或高浓度COD污水。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：脱氮能力驯化过程的pH为7.0～8.5，第一种脱氮路径菌株去除的碳源和氮源质量比为10∶1～20∶1；第二种脱氮路径菌株去除的碳氮质量比为3∶1至＜10∶1。