CN103194381B - 反硝化细菌筛选鉴定试剂盒及筛选鉴定方法 - Google Patents

Abstract

一种反硝化细菌筛选鉴定试剂盒及反销化细菌筛选鉴定方法，试剂盒包括反硝化鉴定预制管；菌株富集管；菌种保藏液；筛选鉴定方法是将待检测菌株经菌株富集管富集后接种到反硝化鉴定预制管培养，同时用菌株保藏液将富集菌液保存；反硝化鉴定管经静止培养后，根据培养基颜色变化和产气情况判断菌种反硝化能力。本发明的优点是实现反硝化细菌便捷、定量的鉴定效果，实现菌株培养、鉴定、保藏一站式操作。

Description

反硝化细菌筛选鉴定试剂盒及筛选鉴定方法

技术领域：

本发明属于一种细菌筛选鉴定方法及试剂盒，特别涉及一种用于污水处理的反硝化细菌筛选鉴定方法及试剂盒。

背景技术：

氨氮是引起水体污染的重要物质之一。目前城市污水中含有大量的氨氮，若直接排放到自然环境中会造成严重的环境污染，导致河流、湖泊的富营养化，使水体自净能力减弱。生物脱氮是目前废水脱氮中最经济有效的方法之一，而污水生物脱氮包括硝化阶段和反硝化阶段。其中硝化阶段包括两个阶段：将NH⁴⁺-N氧化为NO^2--N的氨氧化菌；将NO^2--N氧化为NO^3--N的亚硝酸盐氧化菌。反硝化阶段是在反硝化细菌的作用下，以硝酸盐作为最终电子受体而进行的无氧呼吸过程，结果使硝酸盐逐渐还原为NO₃ ^-、NO₂ ^-、NO、N₂O，最终变为N₂从而将含氮物质从污水处理系统中排出。反硝化过程是整个脱氮反应的关键步骤，对于控制水体富营养化，处理污水和净化水域有着极大的利用价值。

目前有大量针对反硝化细菌的筛选、分离培养的研究。其中比较经典的方法是采用Giltay培养基结合德汉氏小管方法对反硝化细菌进行筛选。专利CN101402990A描述了一种厌氧反硝化细菌筛选用培养基及筛选厌氧反硝化细菌的方法，筛选过程包括固体培养基分离、液体富集和功能验证。专利CN102041291A描述了一种反硝化菌的筛选方法，该方法直接用含氨污水对污泥进行富集、分离，并用含目标污染物的水对分离所得细菌进行驯化。目前各种筛选反硝化细菌的方法均取得了不错的结果，但是对于反硝化细菌的筛选鉴定一般均采用人工培养基进行间接验证，没有在污水环境下进行验证，或将结果与污水环境进行拟合对比。并且采用传统的验证方法存在工作量大、效率低的问题。

发明内容：

本发明的目的在于克服上述的缺陷，提供一种针对水处理的反硝化细菌筛选鉴定试剂盒及利用该试剂盒进行反销化细菌筛选鉴定的方法；该试剂盒是通过实验，配制了一系列人工反硝化鉴定培养基对微生物进行反硝化能力鉴定，鉴定结果与微生物在市政污水、医疗污水中的反硝化结果进行对比拟合，最终设计出了1种人工反硝化鉴定培养基，可以模拟微生物在真实污水环境下的反硝化效果，其结果可以百分之百覆盖、模拟微生物在污水中的反硝化作用，无漏检可以得到较高的阳性率；该试剂盒和筛选方法是将筛选出的人工鉴定培养基制备成无菌预制管，并结合菌株富集管、菌种保藏液的一种操作简单、可以定量检测的一站式反硝化细菌筛选鉴定试剂盒，利用该试剂盒进行反销化细菌的筛选鉴定效率高，工作量小。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种反硝化细菌筛选鉴定试剂盒，它是由菌株富集管、反硝化鉴定预制管、菌株保藏液组成；其中:

菌株富集管：

菌株富集管为装有富集培养基的螺口冻存管，其中每升富集培养基所含成分如下：牛肉膏1-3g，蛋白胨1-3g，葡萄糖0.8-2.1g，磷酸二氢钾480-890mg，磷酸氢二钠0.7-1.5g，硫酸镁100-200mg，氯化钙20-50mg，碳酸氢钠20-120mg，微量元素母液A1ml，微量元素母液B1ml，以上培养基用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7.00-7.50；富集培养基配制完成并调完pH后，将富集培养基分装到1.8ml螺口冻存管中，每支冻存管加入富集培养基1ml，分装完毕后，115℃灭菌25-30min；

反硝化鉴定预制管：

反硝化鉴定预制管中装有反硝化鉴定培养基，每升反硝化鉴定培养基所含成分如下：牛肉膏0.1-0.5g，蛋白胨0.1-0.5g，琥珀酸钠1-3g，醋酸钠0.1-0.8g，磷酸二氢钾480-890mg，磷酸氢二钠0.5-1.5g，硫酸镁100-200mg，氯化钙5-50mg，EDTA二钠10-100mg，硝酸钾1-2g，亚硝酸钠0.1-1g，1%溴百里酚蓝乙醇溶液1ml，微量元素母液A1ml，微量元素母液B1ml，以上培养基用浓度10%的氢氧化钠和HCl调pH至7.00-7.50；反硝化鉴定培养基配制完成并调完pH后，将反硝化鉴定培养基分装到反硝化鉴定预制管中，115℃灭菌25-30min；

菌株保藏液：

菌株保藏液成分如下：甘油40-60ml，去离子水40-60ml，115℃灭菌25-30min；

其中：

每升微量元素母液A所含成分如下：硫酸亚铁5g，EDTA二钠5g；

其中：

每升微量元素母液B所含成分如下：EDTA二钠1.5g，ZnSO₄.7H₂O430mg，CoCl₂.6H₂O240mg，MnCl₂629mg，CuSO₄.5H₂O250mg，Na₂MoO₄.2H₂O220mg，NiCl₂.6H₂O190mg，H₃BO₃14mg；其特征在于：所述的反硝化鉴定预制管，包括鉴定管主体、气体收集管、支撑杆、密封盖和接种针头；所述的鉴定管主体的顶部设有顶部管口，顶部管口与气体收集管连接，所述的支撑杆自气体收集管的顶部插装于气体收集管内，支撑杆的底部与气体收集管的底部活动连接，鉴定管主体的底部设有底部管口，底部管口上安装密封盖，接种针头的末端设有连接帽，与鉴定管主体底部管口连接。

所述的支撑杆的底部设有密封外螺纹，与气体收集管底部设置的密封内螺纹旋接。

所述的气体收集管上设有刻度。

所述的支撑杆的底部密封外螺纹上方套装密封橡胶垫。

所述的支撑杆的顶部设有旋转手柄。

所述的鉴定管主体与气体收集管为一体结构。

所述的鉴定管主体、气体收集管、支撑杆和接种针头为PP或PE材料。

一种反硝化细菌筛选鉴定方法，其特征在于：按如下的步骤进行：

步骤1：菌株富集

将待测菌样接种到菌株富集管中，将菌株富集管盖拧紧，培养条件选择28-35℃温度下静止培养24-48小时，或将菌株富集管平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；

步骤2：鉴定培养

将步骤1富集的菌株接种至反硝化鉴定预制管中，接种完毕后，在25-35℃条件下静止培养；

步骤3：菌种保藏

向菌株富集管中残留的菌液中加入0.5ml菌株保藏液，震荡混匀，放入-20℃冰箱保存；

步骤4：结果观察

步骤2的反硝化鉴定预制管中的菌株经培养12-48h后，记录管中培养基的颜色变化和产气量，此后，根据实验需要，每隔一段时间连续记录观察结果，培养基颜色由绿色变成蓝色并且有气体产生，为反硝化阳性细菌。

本发明的优点和有益效果是：

1、该试剂盒是通过实验，配制了一系列人工反硝化鉴定培养基对微生物进行反硝化能力鉴定，鉴定结果与微生物在市政污水、医疗污水中的反硝化结果进行对比拟合，最终设计出了1种人工反硝化鉴定培养基，模拟微生物在真实污水环境下的反硝化效果，其结果百分之百覆盖、模拟微生物在污水中的反硝化作用，无漏检，得到较高的阳性率；

2、该试剂盒和筛选方法是将筛选出的人工鉴定培养基制备成无菌预制管，并结合菌株富集管、菌种保藏液的一种操作简单、可以定量检测的一站式反硝化细菌筛选鉴定试剂盒，利用该试剂盒进行反销化细菌的筛选鉴定效率高，工作量小。

附图说明：

图1A为反硝化细菌鉴定预制管结构示意图。

图1B为反硝化细菌鉴定预制管成品图。

图1C为反硝化细菌鉴定预制管接种示意图。

图1D为反硝化细菌鉴定预制管产气示意图。

图中：1-鉴定管主体，2-气体收集管，3-气体收集管底部的密封内螺纹，4-支撑杆底部的密封外螺纹，5-密封橡胶垫，6-支撑杆，7-旋转手柄，8-带外螺纹的管口，9-带内螺纹的底部管口密封盖，10-塑料接种针头，11-培养基，12-带内螺纹的连接帽，13-顶部管口，14-刻度。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要说明的是：操作前应确保操作环境及相关器具已灭菌。本发明所说的原料如无特殊说明均为市售产品。

实施例1：一种反硝化鉴定预制管，包括鉴定管主体1、气体收集管2、支撑杆6、密封盖9和接种针头10；所说的鉴定管主体1的顶部为锥形，锥形顶部设有顶部管口13，顶部管口13上一体式连接气体收集管2，支撑杆6的底部自气体收集管2的顶部插装于气体收集管2内，支撑杆6的底部设有密封外螺纹4，与气体收集管底部设置的密封内螺纹3旋接，鉴定管主体1的底部设有带外螺纹的底部管口8，底部管口8上旋装带内螺纹的管口密封盖9，塑料接种针头10的末端设有带内螺纹的连接帽12，与底部管口8旋接；所说气体收集管2上设有刻度14；所说的支撑杆6的底部密封外螺纹4上方套装密封橡胶垫5；所说的支撑杆6的顶部设有旋转手柄7；所说的鉴定管主体1、气体收集管2、支撑杆6和接种针头10为PP或PE材料，鉴定管主体1可装培养基5ml,气体收集管2可收集气体2ml。

实施例2：

反硝化细菌筛选鉴定：

待测菌样来自本实验室从海河医院污水曝气池污泥中所分离纯化的菌株，共137株；并且本实施例采集海河医院污水为验证用污水对待测菌样反硝化能力进行验证，与试剂盒鉴定结果进行对比。

1.利用反硝化细菌筛选鉴定试剂盒对待测菌样进行反硝化功能鉴定：

步骤1：菌株富集

将待测菌样接种到菌株富集管中，拧紧菌株富集管盖，将菌株富集管平放入摇床30℃、150rpm震荡培养24小时；其中菌株富集管中的富集培养基成分如下：

每升富集培养基所含成分如下：牛肉膏3g，蛋白胨3g，葡萄糖0.8g，磷酸二氢钾480mg，磷酸氢二钠0.7g，硫酸镁100mg，氯化钙20mg，碳酸氢钠20mg，微量元素母液A1ml，微量元素母液B1ml，以上培养基用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7.00；富集培养基配制完成并调完pH后，将富集培养基分装到1.8ml螺口冻存管中，每支冻存管加入富集培养基1ml，分装完毕后，115℃灭菌25min；

步骤2：鉴定培养

将步骤1富集的菌种接种至反硝化细菌鉴定预制管，操作步骤如下：在无菌条件下将反硝化鉴定预制管密封盖9旋开，将塑料接种针头10末端连接帽12连接到管口8上，接种针头10的针尖浸入菌株富集管中细菌培养液液面以下，逆时针旋动旋转手柄7，此时支撑杆底部的密封外螺纹4向上旋松，当气体收集管底部的密封内螺纹3和支撑杆底部的密封外螺纹4完全旋开时，菌株富集管中的菌液已接种至反硝化鉴定预制管中；接种完毕后，将塑料接种针头10从反硝化鉴定预制管上拔下，用密封盖9将管口8旋紧密封，30℃条件下静止培养；

其中，反硝化鉴定预制管中的反硝化鉴定培养基11成分如下：

每升反硝化鉴定培养基所含成分如下：牛肉膏0.5g，蛋白胨0.5g，琥珀酸钠3g，醋酸钠0.8g，磷酸二氢钾480mg，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁100mg，氯化钙5mg，EDTA二钠10mg，硝酸钾2g，亚硝酸钠1g，1%溴百里酚蓝乙醇溶液1ml，微量元素母液A1ml，微量元素母液B1ml，以上培养基用浓度10%的氢氧化钠和HCl调pH至7.50；反硝化鉴定培养基配制完成并调完pH后，将反硝化鉴定培养基分装到反硝化鉴定预制管中，115℃灭菌25min；

步骤3：菌株保藏

向菌株富集管残留的菌液中加入0.5ml菌株保藏液，震荡混匀，放入-20℃冰箱保存；

其中：菌株保藏液成分如下：甘油60ml，去离子水40ml；115℃灭菌25min；

步骤4：结果观察

步骤2的反硝化鉴定预制管经培养48h后，记录管中培养基的颜色变化和产气量，结果见表1；

2.用污水对待测菌样反硝化性能进行验证：

将采集的验证用污水样品每升加入1%溴百里酚蓝乙醇溶液1ml，然后分装到玻璃试管，分装量约为玻璃试管容量的五分之一；将杜氏小管（别名德汉氏小管）中装满污水倒立放入玻璃试管中，确认杜氏小管中没有气泡后，将装有杜氏管的玻璃试管115℃灭菌25min；灭菌后将待测菌样接种到玻璃试管中，并在液面上加入0.2ml灭过菌的液体石蜡进行液封，35℃条件下静止培养48h，观察玻璃试管中污水的颜色变化和杜氏小管中气泡产生情况，颜色由绿色变成蓝色并且杜氏小管中有气泡产生的样品为反硝化阳性，结果见表1；

3.结果分析：

经过在反硝化细菌鉴定预制管和验证用污水培养后，137株单菌落中共有41株有颜色变蓝或产气现象，其中反硝化细菌鉴定预制管中鉴定反硝化阳性细菌共21株，验证用污水中有反硝化功能的菌种共15株，结果见表1：

表1：待测菌样反硝化鉴定结果表

通过与污水对比，所筛选的菌样在污水中呈反硝化阳性的菌株在反硝化鉴定管中均呈阳性，无漏检；通过反硝化鉴定管筛选出的21株反硝化细菌在污水环境下有15株有反硝化作用，阳性比例大于70%。

实施例3：

反硝化细菌筛选鉴定：

待测菌样来自本实验室从天津纪庄子污水处理厂曝气池污泥中所分离纯化的菌株，共96株；并且本实施例采集市政污水为验证用污水对待测菌样反硝化能力进行验证，与试剂盒鉴定结果进行对比。

1.利用反硝化鉴定试剂盒对待测菌样进行反硝化功能鉴定：

反硝化筛选鉴定试剂盒使用方法与实施例2中的步骤1至步骤4相同；

步骤1中菌株富集管中的富集培养基成分如下：

每升富集培养基含有：牛肉膏1g，蛋白胨1g，葡萄糖2.1g，磷酸二氢钾890mg，磷酸氢二钠1.5g，硫酸镁200mg，氯化钙50mg，碳酸氢钠120mg，微量元素母液A1ml，微量元素母液B1ml，以上培养基用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7.50；

步骤2中反硝化鉴定预制管中的反硝化鉴定培养基成分如下：

每升反硝化培养基含有：牛肉膏0.1g，蛋白胨0.1g，琥珀酸钠1g，醋酸钠0.1g，磷酸二氢钾890mg，磷酸氢二钠1.5g，硫酸镁200mg，氯化钙50mg，EDTA二钠100mg，硝酸钾1g，亚硝酸钠0.1g，1%溴百里酚蓝乙醇溶液1ml，微量元素母液A1ml，微量元素母液B1ml，以上培养基用浓度10%的氢氧化钠和HCl调pH至7.00；

2.用污水对菌种反硝化性能进行验证：

污水验证所采用的污水为市政污水；

污水验证操作方法与实施例2相同；

3.结果分析：

经过在反硝化鉴定预制管和验证用污水培养后，96株单菌落中共有18株有颜色变蓝或产气现象，其中反硝化鉴定预制管中鉴定反硝化阳性细菌共13株，验证用污水中有反硝化功能的菌样共8株，结果见表2：

表2：待测菌样反硝化鉴定结果表

通过与污水对比，所筛选的菌样在污水中呈反硝化阳性的菌样在反硝化鉴定管中均呈阳性,无漏检；通过反硝化鉴定管筛选出的13株反硝化细菌在污水环境下有8株有反硝化作用，阳性比例大于60%。

实施例4：

利用试剂盒对反硝化细菌的反硝化性能进行研究：

菌株来自本实验室已经筛选出的反硝化细菌，共6株；本实施例利用反硝化试剂盒对不同菌株的反硝化性能进行对比试验；

反硝化鉴定试剂盒使用方法与实施例2中的步骤1至步骤3相同；

步骤1中菌株富集管中的富集培养基成分如下：

每升富集培养基含有：牛肉膏2g，蛋白胨2g，葡萄糖1g，磷酸二氢钾700mg，磷酸氢二钠1g，硫酸镁150mg，氯化钙30mg，碳酸氢钠80mg，微量元素母液A1ml，微量元素母液B1ml，以上培养基用浓度5%的碳酸钠和HCl调pH至7.20；

步骤2中反硝化鉴定预制管中的反硝化鉴定培养基成分如下：

每升反硝化培养基含有：牛肉膏0.2g，蛋白胨0.2g，琥珀酸钠2g，醋酸钠0.4g，磷酸二氢钾700mg，磷酸氢二钠1g，硫酸镁150mg，氯化钙30mg，EDTA二钠50mg，硝酸钾1.5g，亚硝酸钠0.7g，1%溴百里酚蓝乙醇溶液1ml，微量元素母液A1ml，微量元素母液B1ml，以上培养基用浓度10%的氢氧化钠和HCl调pH至7.20；

步骤4：

步骤2的反硝化鉴定预制管经培养12h后，记录管中培养基的颜色变化和产气量，此后每12h记录观察结果，结果见表3；

表3：菌株反硝化性能试验结果表

通过试剂盒鉴定对比，从表3中可以看出，6株菌样的反硝化功能有所差别，其中5号菌样产气最多，反硝化性能最强。

Claims (8)

1.一种反硝化细菌筛选鉴定试剂盒，它是由菌株富集管、反硝化鉴定预制管、菌株保藏液组成；其中:

菌株富集管：

菌株富集管为装有富集培养基的螺口冻存管，其中每升富集培养基所含成分如下：牛肉膏1-3g，蛋白胨1-3g，葡萄糖0.8-2.1g，磷酸二氢钾480-890mg，磷酸氢二钠0.7-1.5g，硫酸镁100-200mg，氯化钙20-50mg，碳酸氢钠20-120mg，微量元素母液A1ml，微量元素母液B1ml，以上培养基用浓度5％的碳酸钠和HCl调pH至7.00-7.50；富集培养基配制完成并调完pH后，将富集培养基分装到1.8ml螺口冻存管中，每支冻存管加入富集培养基1ml，分装完毕后，115℃灭菌25-30min；

反硝化鉴定预制管：

反硝化鉴定预制管中装有反硝化鉴定培养基，每升反硝化鉴定培养基所含成分如下：牛肉膏0.1-0.5g，蛋白胨0.1-0.5g，琥珀酸钠1-3g，醋酸钠0.1-0.8g，磷酸二氢钾480-890mg，磷酸氢二钠0.5-1.5g，硫酸镁100-200mg，氯化钙5-50mg，EDTA二钠10-100mg，硝酸钾1-2g，亚硝酸钠0.1-1g，1％溴百里酚蓝乙醇溶液1ml，微量元素母液A1ml，微量元素母液B1ml，以上培养基用浓度10％的氢氧化钠和HCl调pH至7.00-7.50；反硝化鉴定培养基配制完成并调完pH后，将反硝化鉴定培养基分装到反硝化鉴定预制管中，115℃灭菌25-30min；

菌株保藏液：

菌株保藏液成分如下：甘油40-60ml，去离子水40-60ml，115℃灭菌25-30min；

其中：

每升微量元素母液A所含成分如下：硫酸亚铁5g，EDTA二钠5g；

其中：

每升微量元素母液B所含成分如下：EDTA二钠1.5g，ZnSO₄.7H₂O430mg，CoCl₂.6H₂O240mg，MnCl₂629mg，CuSO₄.5H₂O250mg，Na₂MoO₄.2H₂O220mg，NiCl₂.6H₂O190mg，H₃BO₃14mg；其特征在于：所述的反硝化鉴定预制管，包括鉴定管主体、气体收集管、支撑杆、密封盖和接种针头；所述的鉴定管主体的顶部设有顶部管口，顶部管口与气体收集管连接，所述的支撑杆自气体收集管的顶部插装于气体收集管内，支撑杆的底部与气体收集管的底部活动连接，鉴定管主体的底部设有底部管口，底部管口上安装密封盖，接种针头的末端设有连接帽，与鉴定管主体底部管口连接。

2.如权利要求1所述的一种反硝化细菌筛选鉴定试剂盒，其特征在于：所述的支撑杆的底部设有密封外螺纹，与气体收集管底部设置的密封内螺纹旋接。

3.如权利要求1所述的一种反硝化细菌筛选鉴定试剂盒，其特征在于：所述的气体收集管上设有刻度。

4.如权利要求1所述的一种反硝化细菌筛选鉴定试剂盒，其特征在于：所述的支撑杆的底部密封外螺纹上方套装密封橡胶垫。

5.如权利要求1所述的一种反硝化细菌筛选鉴定试剂盒，其特征在于：所述的支撑杆的顶部设有旋转手柄。

6.如权利要求1所述的一种反硝化细菌筛选鉴定试剂盒，其特征在于：所述的鉴定管主体与气体收集管为一体结构。

7.如权利要求1所述的一种反硝化细菌筛选鉴定试剂盒，其特征在于：所述的鉴定管主体、气体收集管、支撑杆和接种针头为PP或PE材料。

8.一种采用权利要求1所述的反硝化细菌筛选鉴定试剂盒进行反硝化细菌筛选鉴定的方法，其特征在于：按如下的步骤进行：

步骤1：菌株富集

将待测菌样接种到菌株富集管中，将菌株富集管盖拧紧，培养条件选择28-35℃温度下静止培养24-48小时，或将菌株富集管平放入摇床28-35℃、150-200rpm震荡培养24-48小时；

步骤2：鉴定培养

将步骤1富集的菌株接种至反硝化鉴定预制管中，接种完毕后，在25-35℃条件下静止培养；

步骤3：菌种保藏

向菌株富集管中残留的菌液中加入0.5ml菌株保藏液，震荡混匀，放入-20℃冰箱保存；

步骤4：结果观察

步骤2的反硝化鉴定预制管中的菌株经培养12-48h后，记录管中培养基的颜色变化和产气量，此后，根据实验需要，每隔一段时间连续记录观察结果，培养基颜色由绿色变成蓝色并且有气体产生，为反硝化阳性细菌。