CN110511975A - 一种含溴废水处理高效菌筛选培养实验方法 - Google Patents

一种含溴废水处理高效菌筛选培养实验方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物污水处理技术领域，尤其涉及一种含溴废水处理高效菌筛选培养实验方法，包括如下步骤：实验菌源样品的预处理；将预处理得到的实验菌源样品接种到液体富集培养基中培养24h，初步得到含有目标降解功能的混合微生物菌悬液；采用逐步提高原水质量浓度的定时定量方法对得到的菌悬液进行驯化筛选，得到对含溴废水降解效率较高的混合微生物菌悬液；采用富集培养法将得到的新鲜菌悬液中各菌株分离出来。本发明的有益效果是：通过对某盐场含溴废水水质分析，利用含溴废水选择性的驯化，经过对菌群筛选、分离、提纯、培养得到适应某盐场含溴废水的高效降解菌种，对废水实现有效处理，达到工业废水三级排放标准。

Description

一种含溴废水处理高效菌筛选培养实验方法
技术领域
本发明属于生物污水处理技术领域，尤其涉及一种含溴废水处理高效菌筛选培养实验方法。
背景技术
目前我国工业废水排放总量已超过250亿吨，且具有成分复杂、高COD、高含盐量、毒性大及难降解等特点。溴及其化合物作为原料被广泛用于阻燃剂、净水剂、杀虫剂、染料等的制造过程当中，并广泛应用于石油化工、医药加工、喷涂印染、垃圾处理等行业。在促进工业生产的过程当中，也产生了大量的高浓度、难降解的含溴有机废水。含溴废水的处理对整个水处理系统起到至关重要的作用，对整个系统能否连续、稳定的运行、后期系统维护及整个项目的投资成本均有重要影响。
工业废水处理常用方法包括物理处理法、化学处理法、物理化学处理法和生物处理法，生物处理法包括厌氧法和好氧法。生物处理法相比其他处理方法，具有工艺成熟、处理效果好且稳定，投资运营成本低等优点，在国内外受到十分广泛的应用。
然而针对一些特殊的化工生产废水，例如天津某盐场来水含溴量大、导致COD含量偏高，且伴随较大的含盐量，pH呈酸性，易对设备造成严重腐蚀，并对整个系统的正常运行及水质达标造成影响，投资成本大。采用生物处理方法时为了能够最大程度的处理此类废水，需要驯化、筛选出针对废水的高效降解COD的菌种，从而需要寻求一种筛选高效降解菌种的方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种含溴废水处理高效菌筛选培养实验方法，通过对某盐场含溴废水水质分析，利用含溴废水选择性的驯化，经过对菌群筛选、分离、提纯、培养得到适应某盐场含溴废水的高效降解菌种，对废水实现有效处理，达到工业废水三级排放标准。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种含溴废水处理高效菌筛选培养实验方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)实验菌源样品的预处理：即曝气池中活性污泥的预处理；
(2)菌种的富集培养：将步骤(1)预处理得到的实验菌源样品接种到液体富集培养基中培养24h，初步得到含有目标降解功能的混合微生物菌悬液。
(3)菌种的驯化筛选：采用逐步提高原水质量浓度的定时定量方法对步骤(2)得到的菌悬液进行驯化筛选，得到对含溴废水降解效率较高的混合微生物菌悬液；
(4)菌株的纯化分离：采用富集培养法对步骤(3)菌悬液菌群进行分离，将步骤(3)得到的菌悬液制成浓度梯度为10-1的稀释菌悬液，接种在原水与无菌水混合而成的培养基中，并在37℃的恒温摇床中培养一个周期，如此反复驯化培养5个周期后，进行菌株分离，得到目标群。
步骤(1)中，菌库中菌源的预处理过程为：从冷冻菌库中取出细菌样品，在30℃恒温箱中保存，备用；
步骤(1)中，曝气池中活性污泥的预处理过程为：采集曝气池中的活性污泥到容器中，在活性污泥中加入浓度为0.02％的焦磷酸钠和玻璃珠，打破活性污泥中的菌胶团解絮，解絮后的菌悬液离心分离后取菌源沉淀备用；
优选地，解絮后的菌悬液在30℃，150r/min的恒温摇床中振荡30min充分混匀后，再在6000r/min的转速下离心10min，弃上清液，得到混合均匀的菌源沉淀，备用。
步骤(3)中菌种的驯化和筛选过程为：取步骤(2)得到的菌悬液接种到选择培养基中生长培养一个周期，再取新鲜菌悬液接种到下一级含原水浓度较高的新的选择培养基中驯化培养一个周期，新的选择培养基中原水浓度逐渐递增，如此反复驯化培养10个周期后，得到对含溴废水降解效率较高的混合微生物菌悬液。
步骤(3)中菌种的驯化和筛选过程为：将1ml步骤(2)得到的菌悬液，接种到150ml由原水、无菌水、LB培养基组成的选择培养基中生长4天，再用移液枪取0.5ml新鲜菌悬液接种到下一级含原水浓度较高的新的选择培养基中驯化培养一个周期，新的选择培养基中原水浓度逐渐递增，如此反复驯化培养10个周期后，得到对含溴废水降解效率较高的混合微生物菌悬液。
步骤(3)菌种的驯化和筛选的培养条件是：在恒温摇床内进行好氧振荡培养，恒温摇床转速150r/min，温度35℃。
步骤(4)中，当选择培养基中的原水培养基增加到100mL时，采用富集培养法将选择培养基中的各菌株分离出来，具体为：
在无菌操作条件下，移取1ml步骤(3)驯化筛选后的新鲜菌悬液到10ml已灭菌的EP管中，再加入9ml的无菌水，振荡、混合均匀，制成浓度梯度为10-1的稀释菌液；
取上述稀释菌液0.2ml，接种在50ml的原水与50ml无菌水混合而成的培养基中，并放入37℃的恒温摇床，培养4天，再取得到的新鲜菌液0.2ml，接种在50ml的原水与50ml无菌水混合而成的新培养基中，放入37℃的恒温摇床培养4天，如此反复驯化培养5个周期后，进行菌株分离，得到目标菌群。
还包括菌群的保种，将分离完成后的单一菌株接种至确定未染菌的LB固体培养基上，菌液用甘油封存在-20℃下以备用，保种的菌种每两个月需更新一次，以保持菌株的活性。
所述步骤(3)中设置对照组，对照组的选择培养基组成为LB液体培养基50ml、无菌水100ml。
液体富集培养基各组成成分及重量含量为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、无菌水1000g；
LB液体培养基各成分及重量含量为：氯化钠10g、酵母提纯物10g、蛋白胨5g、无菌水1000g；
LB固体培养基各成分及重量含量为：氯化钠10g、酵母提纯物10g、蛋白胨5g、无菌水1000g，琼脂15～20g，pH 7.2-7.6，0.56kg/cm2，112.6℃灭菌30min；
原水培养基为盐场废水水样，直接取该废水水样使用，不进行过滤。
本发明的有益效果是：
一、本发明的实验方法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH值、渗透压、氧气、碳源、氮源等，通过人为控制微生物生长的条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势，从而达到快速分离纯化的目的，进而得到所需菌种；
二、本发明通过对某盐场含溴废水水质分析、对菌群进行含溴废水选择性的驯化，经过对菌群筛选、分离、提纯、培养得到适应某盐场含溴废水的高效降解菌种，对废水实现有效处理，满足了生化后出水水质达到工业废水三级排放标准(COD小于500ppm)，为工程改造施工提供可靠的参考；
三、本发明的实验方法环保、简单、可靠且适用性强，可用于不同废水菌种的筛选实验；通过此方法筛选出了针对含溴废水的高效降解菌种，生物处理方法中加入此类高效降解菌种能够确保含溴废水处理达标，解决了含溴废水的污染问题和难降解问题；为某盐场现有的生化设施工程改造提供了可靠的参考依据。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做出说明。
本发明的实验方法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH值、渗透压、氧气、碳源、氮源等，通过人为控制微生物生长的条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势，从而达到快速分离纯化的目的。本发明的方法不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
实施例：
1、本发明的菌种来源为：某盐场废水生物处理方法工艺段曝气池内的活性污泥。
2、本发明的实验使用的主要实验仪器有：
超净工作台：BBS-SDC，济南鑫贝西有限公司；生化培养箱：SPX-250B-Z，上海博讯实业医疗设备厂；电子天平：AL104，METTLER TOLEDO；恒温摇床：HZ200LB，武汉瑞华有限公司；高压灭菌锅：YX280A，上海三申有限公司；实验室超纯水系统：ASW-0501-U，Aquapro；冰箱：BCD-236H，青岛海尔股份有限公司；超声波清洗器：KQ-100E，昆山市超声仪器有限公司；超低温冰箱：DW-HL238，中科美菱。
3、本发明的实验使用的主要化学试剂有：
氯化钠，分析纯(AR)；焦磷酸钠，分析纯(AR)；甘油，分析纯(AR)；酵母提纯物，生物试剂(BR)；蛋白胨，生物试剂(BR)；琼脂，生物试剂(BR)；牛肉膏，生物试剂(BR)。
4、本发明实验过程中用到培养基主要有富集培养基、LB培养基、原水培养基。各培养基的组成和配比如下：
液体富集培养基各组成成分及重量含量为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、无菌水1000g；
LB液体培养基各成分及重量含量为：氯化钠10g、酵母提纯物10g、蛋白胨5g、无菌水1000g；
LB固体培养基各成分及重量含量为：氯化钠10g、酵母提纯物10g、蛋白胨5g、无菌水1000g，琼脂15～20g，pH 7.2-7.6，0.56kg/cm2，112.6℃灭菌30min；
原水培养基为盐场废水水样，直接取该废水水样使用，不进行过滤。
5、下面对对发明的具体实验过程进行进一步解释说明。
步骤1、实验菌源样品的预处理
曝气池中的活性污泥的预处理：量取100ml盐场处理系统中曝气池中的活性污泥到250ml三角瓶中，再加入几滴浓度为0.02％的焦磷酸钠和少量玻璃珠以打破活性污泥的菌胶团而解絮，菌悬液在30℃，150r/min的恒温摇床中振荡30min充分混匀后，再在6000r/min的转速下离心10min，弃上清液，得到混合均匀的菌源沉淀，备用；
步骤2、菌种的富集培养
将步骤1已预处理的活性污泥的混合均匀沉淀接种到100ml的液体富集培养基中培养24h。
步骤3、菌种的驯化和筛选
菌种驯化和筛选的进程采用逐步提高原水质量浓度的定时定量的方法。首先，取1ml在液体富集培养基中生长了24h的菌悬液到150ml的原水、无菌水、LB液体培养基组成的选择培养基中生长4天。再用移液枪取0.5ml新鲜菌悬液接种到下一级含较高原水浓度的新选择培养基中驯化培养一个周期。新的选择培养基中原水浓度逐渐递增，如此反复驯化培养10个周期后，得到对含溴废水降解效率较高的混合微生物菌悬液。
本实验的菌种驯化和筛选的培养条件是在恒温摇床在好氧振荡培养，温度35℃，转速150r/min，整个驯化和纯化过程都采用平行实验的方式进行，实验样品包括实验组、对照组；其中对照组培养基成分为50ml LB液体培养基和100ml无菌水。菌种的驯化和筛选实验进程如表1所示：
表1菌种的驯化和筛选实验进程
步骤4、菌株的分离
当实验组选择培养基中的原水培养基增加到100mL时，采用富集培养法将培养基中的各菌株分离出来。
在无菌操作条件下，用移液枪移取1ml的新鲜菌液到10ml已灭菌的EP管中，再加入9ml的无菌水，振荡、混合均匀，制成浓度梯度为10-1的稀释菌液。
取上述稀释菌液0.2ml，接种在50ml的原水与50ml无菌水混合而成的新培养基中，并放入37℃的恒温摇床，培养4天。再取新鲜菌液0.2ml，接种在50ml的原水与50ml无菌水混合而成的新培养基中，在37℃的恒温摇床培养4天。如此反复驯化培养5个周期后，进行菌株分离，得到目标菌群，所述菌群含有钟虫、轮虫、兼性厌氧菌Y8(形态：短杆菌，无芽孢；菌落颜色：呈乳白色，圆形，边缘整齐)、兼性厌氧菌Y2(形态：短杆菌，近球形，无芽孢；菌落颜色：呈淡黄色，圆形，边缘不太整齐)、好氧菌H2(形态：短杆菌，无芽孢，G+；菌落颜色：呈乳白色，圆形，半透明)、好氧菌H4(形态：短杆菌，无芽孢，G+；菌落颜色：呈乳白色，圆形，微透明)。
步骤5、菌株的保种
将分离完成后的菌群接种至确定未染菌的LB斜面培养基上，菌液用甘油封存在-20℃下以备用。保种的菌种每两个月需更新一次，以保持菌群的活性。
6、高效菌进行降解实验
将通过本发明得到的高效菌进行降解实验，降解COD界定物质质量浓度的高低将会影响着高效降解菌群的COD去除率和微生物的生长量。
本发明高效COD降解菌在温度25℃、溶解氧大于等于2mg/L水域环境中，在1L初始COD为1500mg/L的原水中投加0.1g该高效COD降解菌，24小时COD降解率达到70％，48小时COD降解率达到80％以上。
本发明通过对某盐场含溴废水水质分析，利用含溴废水选择性的驯化，经过对菌群筛选、分离、提纯、培养得到适应某盐场含溴废水的高效降解菌种，对废水实现有效处理。满足了生化后出水水质达到工业废水三级排放标准(COD小于500ppm)，为工程改造施工提供可靠的参考。
以上对本发明的一个实例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (9)

1.一种含溴废水处理高效菌筛选培养实验方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)实验菌源样品的预处理：将曝气池中活性污泥进行预处理；
(2)菌种的富集培养：将步骤(1)预处理得到的实验菌源样品接种到液体富集培养基中培养24h，初步得到含有目标降解功能的混合微生物菌悬液；
(3)菌种的驯化筛选：采用逐步提高原水质量浓度的定时定量方法对步骤(2)得到的菌悬液进行驯化筛选，得到对含溴废水降解效率较高的混合微生物菌悬液；
(4)菌群的纯化分离：采用富集培养法对步骤(3)菌悬液各菌株进行分离，将步骤(3)得到的菌悬液制成浓度梯度为10-1的稀释菌悬液，接种在原水与无菌水混合而成的培养基中，并在37℃的恒温摇床中培养一个周期，如此反复驯化培养5个周期后，进行菌株分离，得到目标菌群。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(1)中，曝气池中活性污泥的预处理过程为：采集曝气池中的活性污泥到容器中，在活性污泥中加入浓度为0.02％的焦磷酸钠和玻璃珠，打破活性污泥中的菌胶团解絮，解絮后的菌悬液离心分离后取菌源沉淀备用；
优选地，解絮后的菌悬液在30℃，150r/min的恒温摇床中振荡30min充分混匀后，再在6000r/min的转速下离心10min，弃上清液，得到混合均匀的菌源沉淀，备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中菌种的驯化和筛选过程为：取步骤(2)得到的菌悬液接种到选择培养基中生长培养一个周期，再取新鲜菌悬液接种到下一级含原水浓度较高的新的选择培养基中驯化培养一个周期，新的选择培养基中原水浓度逐渐递增，如此反复驯化培养10个周期后，得到对含溴废水降解效率较高的混合微生物菌悬液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中菌种的驯化和筛选过程为：将1ml步骤(2)得到的菌悬液，接种到150ml由原水、无菌水、LB液体培养基组成的选择培养基中生长4天，再用移液枪取0.5ml新鲜菌悬液接种到下一级含原水浓度较高的新的选择培养基中驯化培养一个周期，新的选择培养基中原水浓度逐渐递增，如此反复驯化培养10个周期后，得到对含溴废水降解效率较高的混合微生物菌悬液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)菌种的驯化和筛选的培养条件是：在恒温摇床内进行好氧振荡培养，恒温摇床转速150r/min，温度35℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，当选择培养基中的原水培养基增加到100mL时，采用富集培养法将选择培养基中的各菌株分离出来，具体为：
在无菌操作条件下，移取1ml步骤(3)驯化筛选后的新鲜菌悬液到10ml已灭菌的EP管中，再加入9ml的无菌水，振荡、混合均匀，制成浓度梯度为10-1的稀释菌液；
取上述稀释菌液0.2ml，接种在50ml的原水与50ml无菌水混合而成的液体培养基中，并放入37℃的恒温摇床，培养4天，再取得到的新鲜菌液0.2ml，接种在50ml的原水与50ml无菌水混合而成的新培养基中，放入37℃的恒温摇床培养4天，如此反复驯化培养5个周期后，进行菌株分离，得到目标菌株。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括菌株的保种，将分离完成后的菌群接种至确定未染菌的LB固体培养基上，菌液用甘油封存在-20℃下以备用，保种的菌种每两个月需更新一次，以保持菌株的活性。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述步骤(3)中设置对照组，对照组的选择培养基组成为LB液体培养基50ml、无菌水100ml。
9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：
液体富集培养基各组成成分及重量含量为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、无菌水1000g；
LB液体培养基各成分及重量含量为：氯化钠10g、酵母提纯物10g、蛋白胨5g、无菌水1000g；
LB固体培养基各成分及重量含量为：氯化钠10g、酵母提纯物10g、蛋白胨5g、无菌水1000g，琼脂15～20g，pH 7.2-7.6，0.56kg/cm2，112.6℃灭菌30min；
原水培养基为盐场废水水样，直接取该废水水样使用，不进行过滤。
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