CN108865920A - 一株耐镉、铅离子的有机物降解菌及其应用 - Google Patents

一株耐镉、铅离子的有机物降解菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了耐镉、铅离子的有机物降解菌，分类命名为：类芽孢杆菌(Paenibacillus sp)GRINM L4，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：CGMCC No.13066。该菌株可将富含重金属离子废水中的有机物高效去除，未来将在富含重金属浮选废水以及电厂废水的COD去除方面有大量的应用空间，极具市场发展前景。

Description

一株耐镉、铅离子的有机物降解菌及其应用
技术领域
本发明属于应用微生物学科领域，涉及一株用于降解有机物的菌株，具体涉及一株耐镉，铅离子的有机物降解菌株。
背景技术
有机废水一般是指由造纸、皮革及食品等行业排出的富含大量碳水化合物、脂肪、蛋白、纤维素等有机物的废水。这些废水中如果直接排放，会造成严重污染。这一类简单的有机废水处理方法较多，技术较为成熟。但是，有色金属行业和电力行业会产生含高浓度重金属离子同时含高浓度有机物的废水处理相对困难。一些企业含重金属有机废水排放量大，重金属浓度，化学需氧量(COD) 和生物需氧量(BOD)等主要指标均严重超出国家标准，这一类废水的排放严重破坏水体，污染生态环境。目前针对含高浓度重金属离子有机废水的处理方法多采用铁盐混凝/沉淀法、漂白粉氧化、Fenton氧化降解法、人工湿地技术，这些方法往往存在成本高，易二次污染等问题。随着国家环保法律法规的日益严格，有些地方政府要求企业必须废水零排放，中国众多的企业面临越来越大的环保压力。因此寻找一种清洁高效的去除富含重金属离子废水中有机物的方法势在必行。
有机废水的微生物处理方法是一种不错的选择，不仅处理成本低，而且能大大减少废渣的产生，减少产生二次污染的可能。但是大部分有机物降解微生物难以耐受工业废水中高浓度的有毒重金属离子，生长活性较低甚至逐渐死亡，失去有机物降解能力，因此，筛选能够耐受重金属离子的有机物降解微生物至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一株有机物降解菌，该菌株具有耐镉离子、耐铅离子的特性，可以耐受高浓度的有毒重金属离子，并保持有机物降解特性。
本发明的另一目的是提供富集和分离培养上述有机物降解菌的培养基。
本发明的又一目的是提供上述有机物降解菌的应用。
为了实现上述目的，本发明提供一株有机物降解菌，分类命名为：类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：CGMCC No.13066。
该类芽孢杆菌(Paenibacillus sp)GRINM L4菌落特征为：在固体培养基上 31℃生长较快，3天后菌落直径为3mm，菌落呈不规则圆形，边缘较粗糙，颜色为乳黄色，生长后期表面有褶皱。
本发明提供富集上述有机物降解菌的培养基，该培养基配方为：1g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，300mg/L选矿黑药，300mg/L选矿黄药，0.3g/L七水硫酸镁，0.5g/L硫酸铵，100mg/L醋酸铅，100mg/L硫酸镉，0.3g/L氯化钾，0.002g/L 硫酸锰，pH7.0～7.5。高压灭菌锅中115℃灭菌30min备用。
本发明提供分离上述有机物降解菌的培养基，该培养基配方为：固体培养基：1g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，300mg/L选矿黑药，300mg/L选矿黄药， 0.3g/L七水硫酸镁，0.5g/L硫酸铵，100mg/L醋酸铅，100mg/L硫酸镉，0.3g/L 氯化钾，0.002g/L硫酸锰，琼脂20g，0.4％的溴酚蓝6mL，pH7.0～7.5。高压灭菌锅中115℃灭菌30min备用
本发明所提供的上述有机物降解菌在富含重金属离子的废水中降低COD 的应用。
本发明所用提取细菌的样品来自于广西某矿产周边的河流底泥，经筛选分离后，得到一株高效的耐镉，铅离子的有机物降解菌株，编号为4#菌株。经过形态学鉴定、菌株的16S rDNA序列鉴定，将其鉴定为类芽孢杆菌属，命名为类芽孢杆菌GRINML4菌株。实验结果表明：原始菌株在富含重金属离子的液体培养基中(镉53.8mg/L，铅63.7mg/L)：温度31℃，摇床转速160r/min的条件下培养2天，其COD可由280mg/L降到76mg/L，低于污水排放二级标准 (100-120mg/L)。
具体实施方式
本发明的工艺包括耐镉，铅离子的有机物降解菌株的富集分离、筛选纯化、降解能力检测以及鉴定，具体说明如下：
本发明提供的一株耐镉、铅离子的有机物降解菌，分类命名为：类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：CGMCC No.13066。
实施例1耐镉，铅离子的有机物降解菌株的富集分离及纯化
(1)培养基
固体培养基：1g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，300mg/L选矿黑药，300mg/L 选矿黄药，0.3g/L七水硫酸镁，0.5g/L硫酸铵，100mg/L醋酸铅，100mg/L硫酸镉，0.3g/L氯化钾，0.002g/L硫酸锰，琼脂20g，0.4％的溴酚蓝6mL，pH7.0～7.5。
液体培养基：1g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，300mg/L选矿黑药，300mg/L 选矿黄药，0.3g/L七水硫酸镁，0.5g/L硫酸铵，100mg/L醋酸铅，100mg/L硫酸镉，0.3g/L氯化钾，0.002g/L硫酸锰，pH7.0～7.5。
上述培养基在高压灭菌锅中115℃灭菌30min备用。
(2)菌株的富集分离
本实施例所用提取细菌的样品来自于广西某矿产周边的河流底泥，在24h 内带回实验室在冰箱于4℃保存备用。
准确称量35g的污泥放入200mL的去离子水中于250mL的锥形瓶， 300r/min磁力搅拌40min，静置分层。
取20mL上清液于含有200mL上述液体培养基的250mL锥形瓶，在31℃条件下，160r/min的摇床富集培养三天，使菌液的浓度达到108个/mL，取出摇瓶，取上清液分别进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，六个梯度的稀释。然后取20μl涂布于事先倒好的固体平板上，每个浓度重复三次，于31℃恒温培养箱内培养三天，每天观察平板菌落的变化。
实施例2有机物降解菌株的筛选纯化和鉴定
观察固体培养基平板上的菌落形态，并用光学显微镜观察菌株的形态，将所得的菌株的形态学特征《真菌鉴定手册对比(魏景超著)》，得到所要菌株的初步鉴定结果。用牙签粘经初步鉴定的单个菌落到装有3ml液体培养基的试管中，在31℃条件下，160r/min的摇床中培养三天得到单个的纯菌。然后再用 PCR扩增菌株的16S rDNA序列并进行测序分析分析，序列如Seq ID No.1所示，将测序获得的16S序列到NCBI公共数据库 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝Blast Search&LINK_LOC＝blasthome)进行比对，比对结果为Paenibacillus sp，属于类芽孢杆菌，命名为GRINM L4。
实施例3有机物降解菌株去除富含重金属离子废水中的有机物高效能力的检测
一、液体培养基摇瓶培养
将初筛的GRINM L4菌株按3％的接种量接种到含100mL富含重金属离子选矿废水的250mL锥形瓶中，菌株设置两个重复摇瓶并设不加菌对照，于31℃， 160r/min的摇床上培养2天，处理前后分别取样，处理前为空白样品，处理后为实验样品，测定溶液COD。
该废水中含镉53.8mg/L，铅63.7mg/L，地表水环境质量标准基本项目标准限值规定V类地表水(最大限值)镉的限值为0.01mg/L，铅的限值为0.1mg/L，本实施例中所用废水中镉，铅含量远远大于地表水标准，属于富含重金属离子的废水。
二、COD测定
测量使用MERCK多参数水质分析仪NOVA60和标准试剂(德国merck) 按照使用说明书进行操作：
反应原理为：待测水样在热硫酸的环境中，在硫酸汞的催化下被重铬酸钾氧化。氯离子能影响催化剂硫酸汞的催化作用。没有消耗完的重铬酸根显示出黄色或者是已经被氧化的Cr3+显示出绿色，该黄色或绿色能够用光度计进行检测。
COD测定步骤：
1.根据表1的要求，按照需要测试的COD量程，用移液管或移液枪吸取合适体积的溶液A和溶液B到一个空的消解管中并混合均匀。请注意严格按照下表中的移液量移取。
表1
如果消解管中有沉淀产生，在测试前请振荡使沉淀物悬浮。
2.分别取空白样品和实验样品各3mL，将消解管倾斜，将样品小心的顺着消解管壁注入到消解管中(注意安全，反应管会变得非常热)。
3.旋紧消解管的盖子，后面所有得步骤必须在紧闭消解管盖子得情况下操作。
4.激烈振荡反应管使完全混合。
5.将消解管放到消解器(科诺科仪KN-COD11型)中消解，148℃下消解 120分钟。
6.消解完成后，将反应管取出，放到试管架上冷却，注意不能用水冷。
冷却10分钟后，振荡试管，然后重新放回试管架上冷却到室温。整个过程至少要冷却30分钟。
7.将消解管放到光度计中测量。
三、测定结果
样品COD实验起始时280mg/L，48h后实验组样品COD降为76mg/L，对照组变化不大。
从上述实施例可以看出，本发明提供的有机物降解菌可以在高隔、铅离子存在的条件下大幅降解废水中的有机物，降低COD，方法简单，成本低，为后续废水的进一步处理创造了条件。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京有色金属研究总院
<120> 一株耐镉、铅离子的有机物降解菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1351
<212> DNA
<213> Paenibacillus sp.
<400> 1
gctctcctga tggttagcgg cggacgggtg agtaacacgt aggcaacctg cctgcaagac 60
cgggataacc cacggaaacg tgagctaata ccggatatct catttcctct cctgagggga 120
tgatgaaaga cggagcaatc tgtcacttgc ggatgggcct gcggcgcatt agctagttgg 180
tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg aacggccaca 240
ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat 300
gggcgaaagc ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct 360
ctgttgccag ggaagaacgt ccggtagagt aactgctatc ggagtgacgg tacctgagaa 420
gaaagccccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggggc aagcgttgtc 480
cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtcattta agtctggtgt ttaaggccaa 540
ggctcaacct tggttcgcac tggaaactgg gtgacttgag tgcagaagag gagagtggaa 600
ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact 660
ctctgggctg taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc 720
ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgc taggtgttag gggtttcgat acccttggtg 780
ccgaagttaa cacattaagc attccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 840
ggaattgacg gggacccgca caagcagtgg agtatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 900
gaaccttacc aggtcttgac atccctctga ccggtctaga gatagacctt tccttcggga 960
cagaggagac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1020
cccgcaacga gcgcaaccct tgattttagt tgccagcact tcgggtgggc actctagaat 1080
gactgccggt gacaaaccgg aggaaggcgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg 1140
acctgggcta cacacgtact acaatggcca gtacaacggg aagcgaagcc gcgaggtgga 1200
gccaatccta tcaaagctgg tctcagttcg gattgcaggc tgcaactcgc ctgcatgaag 1260
tcggaattgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggtcttgta 1320
cacaccgccc gtcacaccac gagagtttac a 1351

Claims (5)

1.一株耐镉、铅离子的有机物降解菌，其特征在于，分类命名为：类芽孢杆菌(Paenibacillus sp)GRINM L4，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：CGMCC No.13066。
2.用于富集培养如权利要求1所述耐镉、铅离子的有机物降解菌的培养基，其特征在于，该培养基的配方为：1g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，300mg/L选矿黑药，300mg/L选矿黄药，0.3g/L七水硫酸镁，0.5g/L硫酸铵，100mg/L醋酸铅，100mg/L硫酸镉，0.3g/L氯化钾，0.002g/L硫酸锰，pH7.0～7.5，高压灭菌锅中115℃灭菌30min。
3.用于分离培养如权利要求1所述耐镉、铅离子的有机物降解菌的培养基，其特征在于，该培养基的配方为：1g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，300mg/L选矿黑药，300mg/L选矿黄药，0.3g/L七水硫酸镁，0.5g/L硫酸铵，100mg/L醋酸铅，100mg/L硫酸镉，0.3g/L氯化钾，0.002g/L硫酸锰，琼脂20g，0.4％的溴酚蓝6mL，pH7.0～7.5，高压灭菌锅中115℃灭菌30min。
4.一种富集培养权利要求1所述耐镉、铅离子的有机物降解菌的方法，其特征在于，将权利要求1所述有机物降解菌接种到权利要求2所述的培养基中，在30-33℃条件下，160r/min的摇床富集培养三天，使菌液的浓度达到108个/mL。
5.如权利要求1所述耐镉，铅离子的有机物降解菌在富含重金属离子的废水中降低COD的应用。
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