CN107699529B - 一种异常嗜糖气单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株新的油脂降解菌种‑气单胞菌属，异常嗜糖气单胞菌CY01(Aeromonas allosaccharophila CY01)及其该菌株应用。本发明的菌株能够在污水处理设备的好氧池迅速繁殖，成为优势菌，持续分泌脂肪酶，降解动植物油脂。

Description

一种异常嗜糖气单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株新的菌种——异常嗜糖气单胞菌CY01(AllosaccharophilaCY01)，及利用该菌株降解污水中的油脂的方法。

背景技术

随着我国经济的发展和居民生活水平的提高，日常饮食中动植物油的含量越来越高，大量含油餐饮废水未经处理直接排入城市污水管网和就近水体中，增加了城市污水处理厂的污染负荷，造成了环境水体的严重富营养化，一些农家乐和旅游区餐厅的餐饮废水如果不达标排放，将严重破坏景区生态环境。目前国内外采用的餐饮废水处理技术大致可分三类：物理、化学和生物技术。只依靠物理、化学等技术处理餐饮废水是远远不够的，存在处理能力有限、处理运转周期长、运行费用高、易造成二次污染等不足，而生物技术法处理餐饮废水是因为微生物利用餐饮废油作为正常生长所需的碳源和能源，在脂肪酶和其他多种酶的作用下将废油水解成甘油和脂肪酸，最后分解为C0₂、H₂0、CH₄，具有安全无毒、效率高、成本低、不产生二次污染且易繁衍驯化等优点。

然而普通污水处理设备中无油脂降解菌或油脂降解菌的含量过低，不能有效繁殖成优势菌，致使分解的脂肪酶不够多，大量油脂未被分解就排出，出水COD严重超标。

发明内容

本发明为了克服现有技术的至少一个不足，提供一株新的菌种——异常嗜糖气单胞菌CY01(Allosaccharophila CY01)，及利用该菌株降解污水中的油脂的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

异常嗜糖气单胞菌CY01(Allosaccharophila CY01)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO:M 2017543，保藏日期2017年09月25日。

该新菌株特征如下：

菌落形态：30℃在LB平板培养12h，菌落呈光滑圆形，直径2～3mm，饱满隆起，菌落呈淡黄色，边缘整齐，光滑湿润有光泽。菌落随时间的延长而增大，数天后直径可达4mm以上。

细胞形态：16h培养物的细胞具有圆端的直杆菌或细胞接近球状，直径0.3-1.0μm。单个，成对或短链，无芽胞，无动力。

生理生化特征：革兰氏阴性，兼性厌氧，化能异养，最适生长温度为30℃。接触酶阳性，氧化酶、过氧化氢酶阳性。可降解脂肪酶底物，在橄榄油以及短链油脂类底物培养基上形成透明圈。利用细菌16S rDNA序列测序的方法对其进行种属鉴定，序列为SEQ NO:1。

本发明所涉及的微生物是通过以下方法筛选得到的：步骤a，分离纯化：从食堂污水井取含油污水样，加入LB液体培养基，配制成悬浮液，然后将其梯度稀释后涂布在LB固体培养基平板中培养；

步骤b，初筛：用接种针挑选单菌落点接到筛选培养基平板中，培养后，选取产生透明圈的菌株接入液体培养基，摇床培养；取培养结束的菌液梯度稀释涂布在LB平板中，单菌落仍然产生透明圈的作为初筛菌株；

步骤c，复筛：将初筛菌株的菌液接入含大豆油的LB培养基，培养后，测动植物油脂浓度，选取除油率最高的一株，命名为CY01。

异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01的菌剂制备方法，将异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01接入液体LB培养基，摇床培养后，再用发酵罐扩大培养；将发酵罐培养好的菌剂和LB混合后，密封冷藏。

进一步，所述发酵罐扩大培养时的培养基按下述比例配制：5000L水中，蛋白胨50kg，酵母粉25kg，氯化钠50kg，大豆油20kg，pH 7.2，121℃湿热灭菌20min。

本发明还提供一种上述的异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01在油脂降解中的应用。

本发明还提供一种上述的异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01在污水处理中的应用。

异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01的菌剂的应用方法，其特征在于，取污水处理站的进水与菌剂按1:1进行混合，在室温下曝气24h，然后将此混合液体按污水处理站好氧池容积的1‰(v/v)量进行投加。

本发明的有益效果主要体现在：本发明的油脂降解菌能够在污水处理设备的好氧池迅速繁殖，成为优势菌，持续分泌脂肪酶，降解动植物油脂，保证污水处理出水COD达标。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为菌株异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01初筛时产生透明圈的单菌落示意图；

图2为实施例5中油脂降解效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：油脂降解菌筛选

1、分离纯化：从江南大学蠡溪苑食堂污水井取含油污水样，加入LB液体培养基，配制成20wt％的悬浮液，然后将其梯度稀释到适当浓度后涂布在LB固体培养基平板中，37℃培养24h。

2、初筛：用接种针挑选单菌落点接到筛选培养基平板中，37℃培养24h，选取产生透明圈的菌株接入50mlLB液体培养基，37℃、200rpm摇床培养8h。取培养结束的菌液梯度稀释到适当浓度涂布在LB平板中，单菌落仍然产生透明圈的作为初筛菌株，如图1所示。

3、复筛：按10％(v/v)的量将上述初筛菌株的菌液接入含大豆油5000ppm的LB培养基，于37℃，200rpm摇床培养72h，测动植物油脂浓度，选取除油率最高的一株，命名为CY01，转入LB斜面2～8℃冷藏。

其中所述LB液体培养基按下述比例配制：1000ml水中，蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，pH 7.2，121℃湿热灭菌20min。

所述LB固体培养基在LB液体培养基的基础上加入2％(w/v)的琼脂。

所述筛选培养基按下述比例配制：1000ml水中，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，K₂HPO₄0.3g，NaCl0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，酵母粉0.5g，30ml油脂底物，琼脂20.0g，pH 7.2，121℃湿热灭菌20min。

所述油脂底物按下述比例配制：0.9g聚乙烯醇加入30ml水中，95℃加热1h充分溶解，加入10ml甘油三丁酸酯，用漩涡振荡器充分混匀乳化。

所述油脂浓度按HJ 637-2012《水质石油类和动植物油类的测定红外分光光度法》测定，仪器为华夏科技OIL 460红外分光测油仪。

实施例2：菌株的鉴定

采用16Sr DNA分析，鉴定该油脂降解菌为：气单胞菌属，异常嗜糖气单胞菌；学名Aeromonas allosaccarophila。

提取细菌基因组DNA，设计引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ IDNo.1)，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No.2)，RCR条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30循环，72℃延伸10min，12℃保温。

测序结果为SEQ ID No.3：

AAGGTTAAGCTATCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCA

CCGCAACATTCTGATTTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGGAGTCGAGTTGCAGACTCCGATCCGGACTACGACGC

GCTTTTTGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTTGCAGCCCTCTGTACGCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCGTA

AGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCCTTGAGTTCCCACCATTACGT

GCTGGCAACAAAGGACAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGC

AGCACCTGTGTTCTGATTCCCGAAGGCACTCCCCAATCTCTTAGGGATTCCAGACATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTC

GCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCG

TACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGTCTCAAGGACACAGCCTCCAAATCGACATCGTTTA

CGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCC

GCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCT

AGCTGGACAGTTTTAAATGCAATTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCTAACTTATCCAACCGCCTGCGTGCGCTT

TACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCT

GCGAGTAACGTCACAGCTGGCAGTTATTCGCTACCAACCTTTCCTCCTCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTC

TTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGGTTTCCCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGA

CCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCA

ACTAGCTAATCCCACCTGGGTTCATCCAATCGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCCCCCGTAGGGCGTATGCGGTA

TTAGCAGTCGTTTCCAACTGTTATCCCCCTCGACTGGGCAGATCCCCAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGCCGGCA

AAAGTAGCAAGCTACTTTCCCGCTGCCGCT

实施例3：菌剂的制备

将异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01接入液体LB培养基，37℃、200rpm摇床培养24h，再用发酵罐扩大培养，接种量为5％(v/v)。将发酵罐培养好的菌剂和营养剂按1:1混合，装桶，密封，2～8℃冷藏。

所述发酵罐扩大培养时的培养基按下述比例配制：5000L水中，蛋白胨50kg，酵母粉25kg，氯化钠50kg，大豆油20kg，pH 7.2，121℃湿热灭菌20min。

实施例4：菌剂活化和污水处理池除油应用

为在污水处理池中更好发挥油脂降解菌的性能，低温保藏的除油菌剂在使用前需进行简单活化处理。现场在塑料桶中加入污水处理站的进水与菌剂按1:1进行混合，在室温下曝气24h，然后将此混合液体按污水处理站好养池容积的1‰(v/v)量转接进污水处理池中，每隔12h取出水口的水质检测油脂含量。经现场取样检测，转接油脂降解菌24h后，污水处理池中的油脂类物质基本降解完全，出水口基本检测不到油脂，出水指标完全符合要求。

实施例5：油脂降解

将驯化后的异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01接入液体LB培养基，37℃、200rpm摇床培养48h。培养结束后加入2‰(v/v)的大豆油，继续37℃、200rpm振荡培养8h。每隔2h取样，离心后测上清液的动植物油浓度，结果如图2所示。可见随着培养时间的增加，油脂浓度逐渐减小，至6h已经无法检测到大豆油，因此本发明的新菌株对油脂降解效果很好。

虽然本发明已由较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟知此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求书所要求保护的范围为准。

序列表

<110> 浙江双良商达环保有限公司

<120> 一种异常嗜糖气单胞菌及其应用

<130> 2017

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1390

<212> DNA

<213> 异常嗜糖气单胞菌CY01(Aeromonas allosaccarophila)

<400> 1

aaggttaagc tatctacttc tggtgcaacc cactcccatg gtgtgacggg cggtgtgtac 60

aaggcccggg aacgtattca ccgcaacatt ctgatttgcg attactagcg attccgactt 120

cacggagtcg agttgcagac tccgatccgg actacgacgc gctttttggg attcgctcac 180

tatcgctagc ttgcagccct ctgtacgcgc cattgtagca cgtgtgtagc cctggccgta 240

agggccatga tgacttgacg tcatccccac cttcctccgg tttatcaccg gcagtctccc 300

ttgagttccc accattacgt gctggcaaca aaggacaggg gttgcgctcg ttgcgggact 360

taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acagccatgc agcacctgtg ttctgattcc 420

cgaaggcact ccccaatctc ttagggattc cagacatgtc aaggccaggt aaggttcttc 480

gcgttgcatc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattcattt 540

gagttttaac cttgcggccg tactccccag gcggtcgatt taacgcgtta gctccggaag 600

ccacgtctca aggacacagc ctccaaatcg acatcgttta cggcgtggac taccagggta 660

tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc acctgagcgt cagtctttgt ccagggggcc 720

gccttcgcca ccggtattcc tccagatctc tacgcatttc accgctacac ctggaattct 780

acccccctct acaagactct agctggacag ttttaaatgc aattcccagg ttgagcccgg 840

ggctttcaca tctaacttat ccaaccgcct gcgtgcgctt tacgcccagt aattccgatt 900

aacgcttgca ccctccgtat taccgcggct gctggcacgg agttagccgg tgcttcttct 960

gcgagtaacg tcacagctgg cagttattcg ctaccaacct ttcctcctcg ctgaaagtgc 1020

tttacaaccc gaaggccttc ttcacacacg cggcatggct gcatcagggt ttcccccatt 1080

gtgcaatatt ccccactgct gcctcccgta ggagtctgga ccgtgtctca gttccagtgt 1140

ggctgatcat cctctcagac cagctaggga tcgtcgcctt ggtgagccat tacctcacca 1200

actagctaat cccacctggg ttcatccaat cgcgcaaggc ccgaaggtcc cctgctttcc 1260

cccgtagggc gtatgcggta ttagcagtcg tttccaactg ttatccccct cgactgggca 1320

gatccccagg cattactcac ccgtccgccg ctcgccggca aaagtagcaa gctactttcc 1380

cgctgccgct 1390

Claims (6)

1.异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 2017543；

该异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01的筛选方法包括以下步骤：

步骤a，分离纯化：从食堂污水井取含油污水样，加入LB液体培养基，配制成悬浮液，然后将其梯度稀释后涂布在LB固体培养基平板中培养；

步骤b，初筛：用接种针挑选单菌落点接到筛选培养基平板中，培养后，选取产生透明圈的菌株接入液体培养基，摇床培养；取培养结束的菌液梯度稀释涂布在LB平板中，单菌落仍然产生透明圈的作为初筛菌株；

步骤c，复筛：将初筛菌株的菌液接入含大豆油的LB培养基，培养后，测动植物油脂浓度，选取除油率最高的一株，命名为CY01。

2.一种如权利要求1所述的异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01在油脂降解中的应用。

3.一种如权利要求1所述的异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01在污水处理中的应用。

4.一种如权利要求1所述的异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01的菌剂制备方法，其特征在于，将异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01接入液体LB培养基，摇床培养后，再用发酵罐扩大培养；将发酵罐培养好的菌剂和培养基混合后，密封冷藏。

5.根据权利要求4所述的异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01的菌剂制备方法，其特征在于，所述发酵罐扩大培养时的培养基按下述比例配制：5000L水中，蛋白胨50kg，酵母粉25kg，氯化钠50kg，大豆油20kg，pH 7.2，121℃湿热灭菌20min。

6.一种如权利要求4所述的异常嗜糖气单胞菌Allosaccharophila CY01的菌剂的应用方法，其特征在于，取污水处理站的进水与菌剂按1:1进行混合，在室温下曝气24h进行菌剂活化，然后将此混合液体按污水处理站好氧池容积的1‰量进行投加。

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