CN114854605B - 一株白地霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株白地霉及其应用，所述白地霉保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山中国典型培养物保藏中心，所述白地霉的保藏编号为CCTCCNO：M2018309，该株白地霉在低碳氮比条件下，具有较强的降氨氮作用；白地霉在高氨氮低碳源条件下能快速降解氨氮，如应用于污水处理中，可减少设备投入，降低处理成本。

Description

一株白地霉及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株白地霉及其应用。
背景技术
污水处理中对氨氮去除是一大重点研究方向，尤其是对低C/N污水处理更是一个热门研究。在我国受污染河水、地下水、垃圾渗滤液以及石油化工、化肥、味精等行业的生产废水都具有低碳氮比的特点。传统生物污水处理需耗费大量的能源与碳源才能完成脱氮过程。因此，找到低碳条件下高效降氨氮菌株能在一定程度上解决低C/N废水脱氮问题。不同的真菌对碳氮比有不同的要求，且一般碳氮比＞10，现有技术中，厌氧氨氧化菌与反硝化菌两种自养细菌针对低碳氮比污水的脱氮处理效果比较好。还发现了发现在低碳氮比营养条件下高效率去除氨氮的菌株，如好氧脱氮海洋菌Vibrio sp.Y1-5和耐冷菌Janthinobacterium sp.M-11。
白地霉(Galactomyces candidum)的形态特征介于酵母菌与霉菌之间，广泛存在于环境中的一类真核微生物。常应用于奶酪，啤酒，白酒，腐乳等食品酿造中。能够生产果胶酶、辅酶Q和脂肪酶，提高中链脂肪酸含量和抗微生物活性等。在污水处理方面，白地霉也有报道可降低废水中COD的作用。
发明内容
本申请提供了一株白地霉及其应用，以解决低C/N污水处理的技术问题。
第一方面，本申请提供了一株白地霉(Galactomyces candidum GC-1)，所述白地霉保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山中国典型培养物保藏中心，所述白地霉的保藏编号为CCTCC NO：M2018309。
具体的，白地霉(Galactomyces candidum GC-1)于2018年5月25日保藏于中国武汉、武汉大学。
可选的，所述白地霉的16SrRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。
第二方面，本申请提供了含白地霉(Galactomyces candidum GC-1)的工程菌剂，其特征在于，所述工程菌剂包括：保藏编号为CCTCC NO：M2018309的白地霉或/和其培养物。
可选的，所述白地霉的16SrRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。
第三方面，本申请提供了第一方面所述的白地霉，或第二方面所述的工程菌剂在去除氨氮中的应用，所述应用包括：所述白地霉在C/N为1-4：1中的氨氮环境中的应用。
可选的，所述应用包括：所述白地霉在10-42℃的氨氮环境中的应用。
可选的，所述应用包括：所述白地霉的应用环境的pH为6.5-16。
可选的，所述应用包括在污水处理中的应用。
可选的，所述白地霉去除氨氮的环境包括：所述白地霉去除氨氮的环境包括：PH为8.0，C/N为1.4-1.5，温度为30℃。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的白地霉，保藏编号为CCTCCNO：M2018309，该株白地霉在低碳氮比条件下，具有较强的降氨氮作用；白地霉在高氨氮低碳源条件下能快速降解氨氮，如应用于污水处理中，可减少设备投入，降低处理成本，同时在短时间内完成氨氮去除，且培养过程简单，无需增加过多碳源。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的GC菌在YPD培养基上的菌落形态；
图2为本申请实施例提供的GC菌的基因电泳图和GC菌ITS序列扩增检测图；
图3为本申请实施例提供的ITS基因序列构建系统发育树；
图4为本申请实施例提供的GC菌与Galactomyces candidum strain WM 04.493KP132255.1和Galactomyces candidum LC317625.1序列差异；
图5为本申请实施例提供的白地霉菌在YPD培养基中生长曲线；
图6为本申请实施例提供的不同PH对白地霉生长影响；
图7为本申请实施例提供的不同PH对白地霉氨氮去除率的影响；
图8为本申请实施例提供的不同温度对白地霉生长影响；
图9为本申请实施例提供的不同温度对白地霉氨氮去除率的影响；
图10为本申请实施例提供的不同C/N对白地霉生长影响；
图11为本申请实施例提供的不同C/N对白地霉氨氮去除率的影响。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本发明的方法进行详细说明。
实施例1菌种分离筛选
制备培养基：
矿质培养基(g/L)：NH4Cl：0.246g、MgSO4·7H2O：0.039g、CaCl2：0.055g、FeSO4·7H2O：0.010g、CuSO4·5H2O：0.000024g、K2HPO4：0.348g、琼脂：20g溶于500mL蒸馏水中。葡萄糖：3.603g加入500ml蒸馏水中。在115℃环境中，灭菌30min后过滤混合。
LB培养基：胰蛋白胨：10.0g、酵母浸粉：5.0g、氯化钠：10.0g、琼脂：20.0g溶于1L蒸馏水中。在121℃环境中，灭菌15min。
YPD培养基：蛋白胨：10g、葡萄糖：20g、酵母粉：5g、(琼脂粉：20g固体).溶于1L蒸馏水中。在121℃环境中，灭菌15min。
MRS培养基：蛋白胨：10.0g、牛肉浸粉：5.0g、酵母浸粉：4.0g、葡萄糖：20.0g、磷酸氢二钾：2.0g、柠檬酸三铵：2.0g、醋酸钠：5.0g、硫酸镁：0.2g、硫酸锰：0.05g、琼脂：20.0g、吐温-80：1.0mL。在121℃环境中，灭菌15min。
利用无菌生理盐水把从垃圾填埋处理场取来的垃圾渗滤液稀释10倍。为使微生物细胞分散，形成均匀的菌悬液，在上述液体中加入数颗玻璃珠，充分震荡20-30min。在无菌条件下，将上述混合菌种的液体采用稀释平板法分别转接到LB、YPD、MRS固体培养基上，分别于37℃、30℃、30℃恒温培养箱倒置培养24-48h后，将有单个菌形成的菌种圈挑出，进一步通过划线法纯化，直到得到纯菌株。保存于-80℃冰箱。将分离纯化的菌种活化培养，挑单菌落于5mL灭菌LB、YPD、MRS液体培养基中，培养24h。取1％以12000rmp离心10分钟，弃去液体。加入生理盐水打散，混匀后离心。弃去液体，重复三次。将菌体加入100ml氨氧化选择培养基中，放入30℃，150rmp恒温培养箱中震荡培养。24h后，用比浊法(OD6OO)检测菌体数量。纳氏试剂法检测其菌体培养基氨氮浓度。以不接菌的培养基做对照，计算氨氮去除率及从中筛选出一株对氨氮去除效果最好的菌株GC。
实施例2菌种鉴定
从垃圾渗滤液筛选出降氨氮菌株可以在以NH4 +-N为唯一氮源的选择培养基生长，且降氨氮效果明显。在30℃固体YPD培养基中菌落呈灰白色圆形，直径约为2mm，表面粗糙，湿润，中央不隆起，边缘不整齐，如图1所示。
将GC菌ITS序列经琼脂糖凝胶电泳检测，GC菌基因组大小为20kb左右(图2中左图)。ITS序列大小在350bp左右(图2中右图)。
按照真菌试剂盒上方法提取DNA，试剂盒购自BIOMIGA。采用扩增ITS基因通用引物。前引物ITS1(5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’),后引物ITS4(5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’)。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸1min，经过30个循环后，72℃再延伸10min。将PCR产物送至公司测序(北京擎科新业生物技术有限公司，长沙)，得到的基因序列上传至NCBI网站进行序列比对。最后，用MEGA6.0软件通过邻接法构建系统发生树。
GC菌ITS序列长度为346bp，扩增序列在NCBI中进行BLAST比对分析，该菌与Galactomyces candidum strain WM 04.493 KP132255.1相似性99％，与Galactomycescandidum LC317625.1相似性98％。用MEGA6.0构建系统发育树，显示与Galactomycescandidum LC317625.1最近(如图3)。GC菌与Galactomyces candidum strain WM 04.493KP132255.1不同的是在第4、42、43、319、338、339、340碱基有差异。与Galactomycescandidum LC317625.1在第65、91、92、319、338、339、340碱基出现差异，如图4所示，图中，1为Galactomyces candidum strain KP132255.1 18S ribosomal RNA gene；2为Galactomyces candidum genes for 18S rRNA,ITS1,5.8S rRNA,ITS2,28S rRNA；3为GC菌ITS基因序列。
实施例3培养基单因素优化实验
将GC菌用YPD培养基扩培。离心后，将离心管底部菌体接种到氨氧化培养基中。在不同培养基初始pH、不同温度培养和培养基不同C/N比对氨氮去除能力的影响。第一组：将PH调节为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在30℃，150rmp摇床中进行培养。第二组：将温度选择10℃、20℃、25℃、30℃、37℃、42℃，在150rmp摇床培养24h。第三组：将C/N等于0、1、1.5、2、3、4(培养基固定NH4Cl为0.246g，葡萄糖为唯一碳源)，在30℃。以150rmp速度摇床进行培养。所有试验都以1％的接种量、以原培养基作对照。培养24h后，比较氨氮浓度及600nm光密度变化。所有试验重复三次。
为了了解白地霉生长浊度变化，测定白地霉菌OD600(600nm光密度)值。从图5可以看出白地霉0-2小时为生长延迟期，2小时后开始进入对数期，符合硝化菌世代周期短，生长速率快。24小时左右到达稳定期，细胞数量维持稳定。由于使用紫外分光光度计测量细菌浊度，细菌的死细胞也被计入，因此，在稳定期后没有出现衰亡期。
培养24h后白地霉菌在不同PH条件下生长及降氨氮变化，检测氨氮采用纳氏试剂紫外分光光度法如图6和图7所示：白地霉适合于偏碱性环境，最佳PH生长条件为8.5左右，氨氮去除效率在PH为9.0时并不是最好，因为过碱条件白地霉降氨氮酶体系受到一定的抑制。
图8展现了在其他条件不变，温度改变时，24小时后白地霉菌细胞的生长数量。可以看出，该菌温度在10-42℃都能够生长。在10℃时，菌株细胞数量增长缓慢。温度高于10℃时，菌株细胞生长数量明显增加。在30℃时达到最佳数量，超过30℃后菌体生长效率下降。从图9可以看出，在30℃时氨氮去除率最高，为76.3％。而42℃时，去除率只有7％。由此可知，不同温度条件下，氨氮去除率与菌株数量大致呈正相关。筛选到的白地霉在20-37℃，中性偏碱环境中生长速率快。
以原培养基作对照，在氨氮浓度不变，改变葡萄糖含量，即C/N低的条件下，白地霉24h后细胞生长浊度如图10所示：不加碳源，菌株基本不生长。值得注意的是，此时氨氮去除率达到48.7％(图11)。可能原因是加入的菌体在培养基中产生了氨氧化酶，同时说明了白地霉是异养氨氧化类型菌株。在C/N为1-4：1时，菌株均能生长。其中，在C/N等于1.5:1时菌株细胞数量最多，24h后氨氮去除率有93.1％。随着碳源的增加，白地霉去除氨氮的效率逐渐降低；而其他微生物所需环境的碳氮比一般为5:1左右。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其他任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 长沙环境保护职业技术学院
<120> 一株白地霉及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 346
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgatgggtat ctacttgatc tgaggttgat agtgttgttt ttcaaacgaa tttgattcga 60
aattttagaa gagcaaagca attccaagag agaaacaacg ctcaaacaag tatactttgg 120
gggatacccc aaagtgcaat gtgcgttcaa aaactgatga ttcacttctg caattcacaa 180
gaaatatcgc gtttcgctgc gttcttcatc gatacgagaa ccaagagatc cattgttaaa 240
agttttaatt atttaattat tgattgtatg atttttgttt gttgtggtaa attcacaaat 300
attattaatt cataatgatc cttccgcagg ttcacctacg gaagga 346

Claims (9)

1.一株白地霉（Galactomyces candidum），其特征在于，所述白地霉保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山中国典型培养物保藏中心，所述白地霉的保藏编号为CCTCC NO.M2018309。
2.根据权利要求1所述的白地霉，其特征在于，所述白地霉的16S rRNA基因序列如SEQID NO：1所示。
3.一种含白地霉（Galactomyces candidum）的工程菌剂，其特征在于，所述工程菌剂包括：保藏编号为CCTCC NO.M2018309的白地霉或/和其培养物。
4.根据权利要求3所述的工程菌剂，其特征在于，所述白地霉的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。
5.权利要求1或2所述的白地霉，或，权利要求3或4所述的工程菌剂在去除氨氮中的应用，其特征在于，所述应用包括：所述白地霉在C/N为1-4：1中的氨氮环境中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述白地霉在10-42℃的氨氮环境中的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述白地霉的应用环境的pH为6.5-9。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括在污水处理中的应用。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述白地霉去除氨氮的环境包括：PH为8.0，C/N为1.4-1.5，温度为30℃。
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Isolation, identification and optimization of enhanced production of laccase from Galactomyces geotrichum under solid-state fermentation;Khadijeh Pourkhanali等;Prep Biochem Biotechnol;第51卷(第7期);659-668 *

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GR01 Patent grant
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