CN110484456B - 一株丝孢酵母菌及其在水体氨氮降解中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株丝孢酵母及其在水体氨氮降解中的应用，申请人自藻类污水反应器中筛选出一株丝孢酵母，经实验检测发现，该丝孢酵母具有良好的氨氮降解能力，该菌株已送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M2018909。水产养殖废水及生活污水的氨氮降解实验表明，该菌株能够有效快速地降解水体中的氨氮浓度，具有广阔的应用前景和推广应用的潜力。

Description

一株丝孢酵母菌及其在水体氨氮降解中的应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株丝孢酵母菌株及其在水体氨氮降解中的应用。
背景技术
快速增长的人口数量和指数上升的经济发展带来的污染物不可避免地进入江河、湖泊，造成水体污染、富营养化。水体污染严重制约着经济发展，威胁社会公众的安全。
氨氮是废水中来源最广的无机污染物。近几十年来，由于工农业的快速发展，居民的生活污水、城市垃圾、农业氨氮化肥、工业废水排放不断增加，使得我国许多自然水体中的氨氮远超出自然环境所能承受的范围。过量的氨氮造成包括主要湖泊河流在内的各类自然水体的富营养化现象十分严重，直接导致水体的自净功能下降，BOD和COD等数据超标，带来严重的生态环境污染问题。
目前氨氮的处理主要是通过物理化学法和生物法来降低氨氮浓度，达到排放标准，常用的物理化学方法有吹脱法、吸附法、化学沉淀法等，物理化学法处理氨氮废水成本过高，会产生有毒物质和残留物。生物法处理氨氮废水主要是依靠一些环境微生物能够利用氨氮及硝态氮等无机氮源并将其转化成对环境无害的氮气或是有机物等，使废水中氨氮含量降低，净化污水。工业上常采取吹脱-生物法、吹脱-折点氯化法、化学沉淀-生物法等处理高浓度氨氮废水；常采用吸附法、生物法等处理低浓度氨氮废水降低成本提高收益。其中，生物法在处理氨氮废水中有物理化学法无法比拟的优点，生物法生态环保，无二次污染，回收后的氨氮还可以资源再利用，符合可持续发展理念。
在氨氮的生物处理方法中，采用硝化细菌去除氨氮污染将其转化为硝酸盐是最便捷高效的脱氮途径。硝化细菌分为自养硝化菌和异养硝化菌，其中自养硝化菌因其自身不易繁殖、生物密度低、难以形成优势菌、脱氮效果较差等特点难以推广使用。自Quastel等首次分离出异养硝化菌株以来，越来越多的异养硝化细菌被广泛关注。异养硝化菌应用的关键是其硝化能力，刘天琪等发现一株具异养硝化功能的假单胞菌(Pseudomonas sp.)，在氨氮初始质量浓度为300mg/L时，其84h对氨氮的去除率超过75％；邹艳艳等筛选到一株根瘤菌(Rhizobium sp.)，在氨氮初始质量浓度100mg/L的条件下，其48h对氨氮的去除率超过90％；孙庆花等自海洋中筛得一株假单胞菌，对氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮等混合氮源的去除率超过90％。
综合目前的研究成果，大多数异养硝化菌在处理高含量氨氮废水过程中存在脱氨氮时间过长、中试放大实验效果不理想等问题。寻求新的高效的脱氨氮菌株已然成为目前亟待解决的问题之一。
丝孢酵母为真菌门、半知菌亚纲、丛梗孢目、隐球酵母科，丝孢酵母属(Trichosporon)。具公开文献，丝孢酵母属能产生脂肪酶、具有苯酚降解、生产微生物油脂以及水果保鲜的能力，目前还未见将其用于废水处理降解氨氮的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株可降解水中氨氮的丝孢酵母，该菌株为丝孢酵母属菌株(Trichosporon montevideense)，保藏编号为CCTCC NO：M2018909。
本发明的另一个目的在于提供了丝孢酵母(Trichosporon montevideense)W02在水体氨氮降解中的应用。实验结果显示该菌株对废水中的氨氮有显著的降解能力，可高效快速地降解含氨氮废水。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一株丝孢酵母(Trichosporon montevideense)，通过以下方法筛选得到：
1)从美国爱荷华州立大学食品系藻类污水反应器中采集水样，将水样在含有50μg/mL氨苄青霉素的YPD液体培养基中30℃好氧富集培养浑浊，适当稀释后涂平板，根据菌落形态挑取典型酵母菌单菌落，通过镜检粗筛出酵母菌,最终筛选出一株丝孢酵母(Trichosporon montevideense)，该菌株属于真菌酵母类，在YPD固体培养基上生长良好，菌落呈白色，表面有大量菌丝，中间呈凸起，长有菌丝，边缘不齐。细胞呈棒状、椭球状，有出芽生殖。
2)通过生理生化及ITS序列鉴定，最终鉴定为丝孢酵母。该菌株于2018年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名：Trichosporon montevideense W02，保藏号为CCTCC NO：M2018909，地址：中国武汉武汉大学。
菌株W02具有典型的丝孢酵母特征：该菌株在YPD固体培养基上繁殖形成的菌落呈白色，表面有大量菌丝，中间呈凸起，长有菌丝，边缘不齐。细胞呈棒状、椭球状，有出芽生殖。
丝孢酵母(Trichosporon montevideense)W02在水体氨氮降解中的应用，包括利用该丝孢酵母制备氨氮降解菌剂，或是直接投放于水中用于水体中的氨氮降解。
一种丝孢酵母W02高密度固体发酵方法，其步骤如下：
将培养的种子液按3-7％(V/W)的接种量接种固体发酵培养基，25-35℃培养48-72h，低温干燥粉碎，即得；
固体发酵培养基配方：
麸皮1000份，水1000-2000份，可溶性淀粉20-30份，氯化铵5-10份，磷酸二氢钾3-7份，重量份。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一株丝孢酵母(Trichosporon montevideense)W02。该菌株生长速度快，能在污染水体中迅速转化氨氮为自身菌体蛋白质，从而迅速降低氨氮浓度。在0.01％(w/v)添加量时，在水产养殖水体和生活污水中氨氮降解速率分别可达0.33mg/L·h和0.42mg/L·h，该菌株能够有效快速地降解水体中的氨氮浓度，具有广阔的应用前景和推广应用的潜力。
该菌株能以淀粉为唯一碳源生长，可以以麸皮为基质进行高密度固态发酵。本发明提供的丝孢酵母(Trichosporon montevideense)W02高密度固态发酵的方法，与液态发酵相比，设备简单、技术难度低、成本低廉。
附图说明
图1为菌株W02对水产养殖废水的氨氮降解曲线示意图。
图2为菌株W02对生活污水的氨氮降解曲线示意图。
图3为丝孢酵母W02 500ml摇瓶生长曲线示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：
丝孢酵母(Trichosporon montevideense)W02的分离与鉴定：
从美国爱荷华州立大学食品系藻类污水反应器中采集水样，将水样在含有50μg/mL氨苄青霉素的胨葡萄糖(YPD)液体培养基中30℃好氧富集培养浑浊，适当稀释后涂平板，根据菌落形态挑取典型酵母菌单菌落，通过镜检粗筛出酵母菌，测定其氨氮降解能力，挑取菌株单菌落一环，接种于YPD液体培养基中30℃摇床恒温培养48h。以菌株W02的总DNA为模板，在引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)的引导下PCR扩增该菌株的ITS序列，PCR反应体系为50μL,mix25μL,ITS1 1μL,ITS41μL,ddH2O2 1μL，模板2μL，PCR反应条件95℃ 30s，50℃ 30s,72℃ 60s，循环次数31次。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经扩增获得了大小约500bp的条带，送去测序并与NCBI数据库进行比对。在NCBI上采用BLAST比对其ITS序列结果与Trichosporon montevideense菌株同源性99％，该菌株于2018年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名：Trichosporon montevideense W02，保藏编号为：CCTCC NO：M2018909。
菌株W02菌落与菌体形态：该菌株在酵母浸出粉胨葡萄糖固体培养基(YPD)上繁殖形成的菌落呈白色，表面有大量菌丝，中间呈凸起，长有菌丝，边缘不齐。细胞呈棒状、椭球状，有出芽生殖。
实施例2：
丝孢酵母(Trichosporon montevideense)W02的液体发酵培养：
将W02菌株按2％接种量(v/v)接种于YPD液体培养基(蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g，水1000mL，115℃灭菌20min，500mL三角瓶装液量100mL)。30℃下150rpm恒温培养，每2h取样1次，用无菌水稀释100倍，以未发酵的培养基作空白对照，在OD600nm波长下检测吸光值，以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标作图，即可得到酵母菌的生长曲线。该菌株在YPD培养基中生长速度较快，培养12h左右可达最大生物量(图3)。
实施例3：
不同碳源对氨氮降解的影响：
将丝孢酵母W02按2％接种量(v/v)到50mL YPD液体培养基中30℃下150rpm培养24h，离心除去培养基用50mL无菌水重悬，重悬后的活菌数为5亿/mL。
分别吸取1.0mL重悬菌液接种至100mL含有45mg/L氨氮灭菌人工污水中(磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，水1000mL，添加氯化铵至终浓度45mg/L)，分别添加终浓度2g/L葡萄糖、蔗糖、乙醇、乙酸钠、柠檬酸钠作为碳源，未加碳源作为对照组，每组3个重复，25℃下150rpm培养24h后测定氨氮浓度。由表1可知，葡萄糖和蔗糖是菌株W02进行氨氮降解的良好碳源，24h降解率可达96％以上。
表1不同碳源对菌株W02降解氨氮的影响
实验分组 初始氨氮(mg/L) 最终氨氮(mg/L) 降解率(％)
CK 45 45 0
葡萄糖 45 1.31 97.1
蔗糖 45 1.73 96.2
乙醇 45 19.1 57.6
乙酸 45 21.7 51.8
柠檬酸 45 35.2 21.8
实施例4：
不同氨氮浓度对氨氮降解的影响
将菌株W02按2％接种量(v/v)接种到50mL YPD液体培养基中30℃下150rpm培养24h，离心除去培养基用50mL无菌水重悬，重悬后的活菌数为5亿/mL。
分别吸取1.0mL重悬菌液接种至初始氨氮浓度分别为19mg/L、47mg/L、90mg/L、212mg/L、531mg/L的100mL灭菌人工污水中(以氨氮浓度为19mg/L的人工污水为例，其配方为：磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，水1000mL，添加氯化铵至终浓度19mg/L)，以葡萄糖为碳源，碳氮比为10:1(m/m)，在25℃的摇瓶(150rpm)中培养24小时。结果如表2所示。可以发现随着氨氮浓度的升高，氨氮降解率在不断下降。菌株W02对氨氮浓度在50mg/l以下的废水具有很好的氨氮降解能力，但在高氨氮浓度废水中的降解能力会下降。
表2不同氨氮浓度对菌株W02降解的影响
初始氨氮(mg/L) 降解率(％)
19 97.5
47 84.5
90 51.4
212 31.0
513 12.1
实施例5：
高密度固体发酵生产丝孢酵母W02菌剂的方法，步骤如下：
用接种环挑取丝孢酵母W02斜面种子，接种YPD液体培养基，30℃下150rpm培养24h，获得种子液。
将培养的种子液按5％(v/m)的接种量接种至固体发酵培养基，发酵温度30℃，发酵周期60h，活菌数可达50.8亿CFU/g干料。
以上所述的固体发酵培养基的配方为：麸皮1000g，水1000mL，可溶性淀粉25g，氯化铵8g，磷酸二氢钾5g。
利用浅盘(长320mm，宽240mm，深45mm)放大10倍发酵培养丝孢酵母，麸皮装料量为300g，采用上述工艺发酵后丝孢酵母活菌数可达43.5亿CFU/g干料。
添加1.5％海藻糖为保护剂，45℃低温干燥粉碎，存活率在80％以上。
实施例6：
W02菌株在水产养殖水体氨氮降解中的应用：
取水产养殖塘水体，pH为7.6，水温18℃，添加氯化铵溶液调整氨氮浓度至5mg/L备用。
取将实施例5制备的丝孢酵母W02菌剂1g(有效菌数43.5亿/g)至100mL无菌水中，静置活化30min。吸取1mL活化菌液接种至100mL未灭菌养殖水体中，按50mg/L添加葡萄糖，28℃下150rpm培养，每隔2h测定氨氮浓度，绘制氨氮降解曲线。
由图1可知，在葡萄糖作为碳源时菌株W02对水产养殖水体中氨氮具有快速降解能力，当接种量为1.0mL时，降解速率可达0.33mg/L·h。同时，菌株W02对水体中COD、硝态氮、亚硝态氮、总氮等指标也有良好降解能力，结果如表3所示。
表3菌株W02处理养殖水体前后各项指标
项目 初始浓度 最终浓度
COD(mg/L) 93.3 36.2
NO<sub>3</sub><sup>-</sup>(mg/L) 0.62 0.30
NO<sub>2</sub><sup>-</sup>(mg/L) 0.09 0.02
TN(mg/L) 5.62 3.21
实施例7：
W02菌株在生活污水氨氮降解中的应用：
取将实施例5制备的丝孢酵母W02菌剂1g至100mL无菌水中，静置活化30min。别吸取0.5、1.0mL活化菌液接种至100mL含有10.4mg/L氨氮未灭菌生活污水中，添加终浓度100mg/L葡萄糖作为碳源，未接种作为对照组，每组3个重复，每隔1h测定氨氮浓度。
由图2可知，在葡萄糖作为碳源时菌株W02对生活污水中氨氮具有快速降解能力，当接种量为1.0mL时，降解速率可达0.42mg/L·h。同时，菌株W02对水体中COD、硝态氮、亚硝态氮、总氮等指标也有良好降解能力，结果如表4所示。
表4菌株W02处理生活污水前后各项指标
Figure BDA0002205340990000061
Figure BDA0002205340990000071

Claims (4)

1.一种分离的丝孢酵母（Trichosporon montevideense）W02，保藏编号：CCTCC NO：M2018909。
2.权利要求1所述的丝孢酵母在制备氨氮降解菌剂中的应用。
3.权利要求1所述的丝孢酵母在水体氨氮降解中的应用。
4.权利要求1所述的丝孢酵母高密度固体发酵方法，包括下述步骤：
将培养的种子液按V/W为3-7%的接种量接种固体发酵培养基，25-35℃培养48-72 h，低温干燥粉碎，即得；
固体发酵培养基配方：
麸皮1000份，水1000-2000份，可溶性淀粉20-30份，氯化铵5-10份，磷酸二氢钾3-7份，重量份。
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