CN109468251B - 一株硫脲降解菌株及应用该菌株处理含硫脲废水的方法 - Google Patents

一株硫脲降解菌株及应用该菌株处理含硫脲废水的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株硫脲降解菌株及应用该菌株处理含硫脲废水的方法。将该菌株属于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.16152。将该菌株应用于含硫脲废水的好氧生化系统中，能将硫脲完全降解、氨氮达标排放；避免了用化学法处理引起二次污染，且废水难以达标排放的情况。利用该菌株处理含硫脲废水具有耐受负荷高、成本低、处理效果好、出水水质稳定、运行管理简便的优点。

Description

一株硫脲降解菌株及应用该菌株处理含硫脲废水的方法
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株硫脲降解菌株及应用该菌株处理含硫脲废水的方法。
背景技术
硫脲(Thiourea)又称硫代尿素，分子式CH4N2S，其应用范围非常广泛，主要用途分为三个方面：工业、医药、农业，在农业中主要作为一种硝化抑制剂存在，生产过程中的排放量大。因硫脲对微生物的毒性较大，部分硫脲进入废水处理厂时，易造成硝化过程受抑制，使出水氨氮含量增高，难以达到排放要求，严重影响废水处理厂的运行。
Zacherl等研究了硫脲对于亚硝化菌的抑制影响，结果表明，当施用的硫脲浓度达到0.5mg/L的时候，亚硝化单胞菌的生长将会被完全抑制，细胞呼吸将会被降低95％左右。
多年来，国内外针对含硫脲废水的处理进行了大量的研究，现有的常规处理方法为：先化学法去除硫脲、再生物法处理废水，化学法去除硫脲主要是用氧化剂氧化硫脲。专利CN106277513A提出一种用复合氧化剂氧化硫脲再加入NaOH、TMT、PAC及PAM进一步络合去除氧化产物的方法；专利CN106830487A提出了一种用氧化剂氧化硫脲、经过沉降工艺，以达到去除硫脲后再处理高浓度氨氮废水的处理工艺。化学法处理硫脲控制参数较多，剂量难以掌握，容易产生二次污染，导致废水难以达标排放。
利用微生物的代谢作用处理废水，具有成本低、处理效果好、运行管理简便等优点。筛选能够降解硫脲、解除硝化抑制的菌株，成为国内外学者的研究热点，但从发表的专利和文章中，还未有报道。
发明内容
针对现有技术的不足，发明人进行了微生物降解硫脲、解除硝化抑制的研究，最终筛选出一株硫脲降解菌株YJY18-03，该菌株属于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，将该菌株应用于含硫脲废水的好氧生化系统中，能将硫脲完全降解、氨氮达标排放；避免了用化学法处理引起二次污染，且废水难以达标排放的情况。利用该菌株处理含硫脲废水具有耐受负荷高、成本低、处理效果好、出水水质稳定、运行管理简便的优点。
一株硫脲降解菌株，该菌株属于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，菌株命名为YJY18-03，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.16152，形态特征为：革兰氏阳性菌，无荚膜，杆状，菌体大；该菌株在普通营养琼脂上的菌落近似圆形，不透明，无色素，表面粗糙有蜡光，似毛玻璃。
菌株YJY18-03的来源：发明人从山东京博控股集团有限公司硫脲存放地、含硫脲废水存储地、生化处理池采集样品，经过含硫脲的平板分离、纯化，液体培养基(含硫脲)培养筛选，并对其生理生化特性、遗传稳定性、应用于好氧生化系统进行硫脲降解等性能进行深入研究后，最终筛选出一株硫脲降解效率高、易培养且具有遗传稳定性的菌株。
发明人对菌株YJY18-03进行了16SrDNA测序，其序列如Seq ID No：1所示，该序列为菌株的16SrDNA的全序列。
将所测得的16SrDNA序列进行BLAST比对，比对结果显示，菌株YJY18-03的16SrDNA的核苷酸序列与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为蜡样芽孢杆菌(Bacillu cereus)的菌株有100％的同源性。
上述硫脲降解菌株YJY18-03可以应用于工业硫脲处理，特别是含硫脲废水的好氧生化处理中，发明人进一步提供了应用该菌株处理含硫脲废水的方法，具体步骤包括：1)制备干粉菌剂，2)好氧生化处理等。
1)制备干粉菌剂：包括菌种活化，液体种子制备，深层发酵以及干燥过程；
2)好氧生化处理：接种干粉菌剂于好氧生化处理系统中，按照废水硫脲含量调节系统进水，经好氧生化处理后，硫脲完全降解，系统出水氨氮合格。
所述的菌种活化具体为：将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下(20℃～25℃)活化4h～8h；
所述的液体种子制备具体过程为：在无菌操作台上，将活化的试管斜面菌种用10mL灭菌后的蒸馏水制成菌体悬浮液，冲洗入100mL培养基中，振荡培养12～18h，得到种子液；
所述的深层发酵具体过程为：取制备好的种子液，按照5％～10％(v/w)的接种量接种于灭菌的发酵培养基中，进行深层发酵，获得液体芽孢；
所述的干燥过程具体为：将深层发酵完成的液体芽孢，加入保护剂，进行喷雾干燥；
更进一步的所述的保护剂为玉米淀粉或粉末碳酸钙，加入量为液体芽孢的8％～13％(w/v)，这两种保护剂具有较高的菌剂回收率，保证较高的有效活菌数量；喷雾干燥条件为进风温度120℃～180℃，出风温度60℃～80℃；液体发酵后的芽孢，喷雾干燥不影响其回收率且喷雾干燥固体菌粉杂菌含量少。
所述液体种子培养基组成及培养条件如下：
液体种子培养基组成，按重量计(w/w)为：葡萄糖1％～2％，硫酸铵0.5％～1％，酵母浸粉0.2％～1％，硫酸镁0.02％～0.1％，磷酸二氢钾0.01％～0.05％,加水至1000mL，pH7.3～7.4；
液体种子制备过程的培养条件为：培养温度30℃～35℃，摇床转速150r/min～200r/min，培养时间为12～18h，检测OD600＝0.5～0.8时停止培养；
深层发酵培养基组成和发酵条件如下：
深层发酵培养基组成，按重量计(w/w)为：玉米粉1％～2％、豆粕1％～2％、硝酸铵0.1％～0.5％、硫酸锰0.01％～0.05％、硫酸镁0.03％～0.1％、氯化钠0.01％～0.05％、硫酸亚铁0.001％～0.005％、氯化钙0.01％～0.05％，加水至1000mL，pH7.3～7.4；
深层发酵条件为：培养温度30℃～35℃，摇床转速150r/min～200r/min，培养时间为48～96h，检测芽孢含量达到5～10×109CFU/mL停止发酵；
最终所得干粉菌剂的芽孢含量为5～15×1010CFU/g。
所述的好氧生化处理过程的具体条件为：
干粉菌剂接种量为好氧生化处理系统总体积的0.1‰～0.5‰(w/v)，系统进水的pH调节到6.5～8.5，硫脲含量≤500mg/L，停留时间0.5～10d。
更进一步的，好氧生化处理系统控制温度25～35℃，溶氧2～4mg/L。
利用上述蜡样芽孢杆菌，生化处理含硫脲废水有以下优点：
解决了技术背景中所提到的无降解硫脲菌株的问题，硫脲中的C＝S可与亚硝化菌催化氨氮氧化的关键酶-氨单加氧酶发生结合，从而抑制硝化作用。本发明中的硫脲降解菌株在弱碱性(pH 7.0～8.5)曝气条件下，能氧化C＝S中的S成硫酸根离子、还原C＝S中的C成CO2，解除硫脲的硝化抑制作用，生化系统的NH4 +在硝化细菌和反硝化细菌作用下转化为氮气。
1、利用该菌株液体深层发酵制备干粉菌剂后，处理硫脲含量≤500mg/L的废水，硫脲能完全降解、氨氮达标排放。
2、利用该菌株生化处理含硫脲废水，具有耐受负荷高、成本低、处理效果好、出水水质稳定、运行管理简便的优点。
3、利用该菌株生化处理含硫脲废水，避免了用化学法处理引起二次污染，且废水难以达标排放的情况。
保藏信息
保藏时间：2018年07月25日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心
保藏编号：CGMCC NO.16152
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所
分类命名:蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)
附图说明
图1实施例1中生化系统添加硫脲降解干粉菌剂前后出水的氨氮含量对比图；
图2实施例2中生化系统添加硫脲降解干粉菌剂前后出水的氨氮含量对比图；
图3实施例3中生化系统添加硫脲降解干粉菌剂前后出水的氨氮含量对比图；
图4实施例4中生化系统添加硫脲降解干粉菌剂前后出水的氨氮含量对比图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。下面实施例中所用的操作技术及原料药品除特殊说明外都是常规的并被本领域所熟知的。
实施例1
种子培养基组成，按重量计(w/w)为：种子培养基组成，按重量计(w/w)为：葡萄糖1.3％，硫酸铵0.5％，酵母浸粉1％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％，加水至1000mL，pH7.3～7.4；121℃，0.15Mpa灭菌20min；
接种量为每个三角瓶(100mL培养基)接种1支经过活化(将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下活化4h～8h)的试管斜面菌株，培养温度33℃，摇床转速200r/min，培养时间为12h，种子液OD600为0.7；
深层发酵培养基组成，按重量计(w/w)为：玉米粉1.4％、豆粕2％、硝酸铵0.4％、硫酸锰0.04％、硫酸镁0.03％、氯化钠0.03％、硫酸亚铁0.001％、氯化钙0.02％，加水至1000mL，pH7.3～7.4；121℃，0.15Mpa灭菌20min；
深层发酵条件：接种量为7％(v/w)，培养温度30℃，摇床转速190r/min，培养时间为96h；
发酵结束，发酵液中芽孢含量达到7×109CFU/mL；
将发酵完成的液体芽孢，加入10％(w/v)玉米淀粉为保护剂，在进风温度120℃、出风温度62℃～72℃喷雾干燥，制备的干粉菌剂芽孢含量达到15×1010CFU/g。
某建材公司烧砖过程中产生含硫脲废水，硫脲含量在0.8mg/L左右，影响了生化系统氨氮的降解，系统进水的pH调节到7.0～8.5，在好氧生化系统接种0.1‰(w/v)干粉菌剂后，按照停留0.5d调节进水量，好氧生化处理系统控制温度25～35℃，溶氧2～4mg/L。
系统出水经过HPLC法检测，硫脲完全降解、纳氏试剂分光光度计法检测氨氮稳定在0.5mg/L左右，(如图1)。
实施例2
种子培养基组成，按重量计(w/w)为：种子培养基组成，按重量计(w/w)为：葡萄糖2％，硫酸铵0.7％，酵母浸粉0.4％，硫酸镁0.1％，磷酸二氢钾0.03％，加水至1000mL，pH7.3～7.4；121℃，0.15Mpa灭菌20min；
接种量为每个三角瓶(100mL培养基)接种1支经过活化(将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下活化4h～8h)的试管斜面菌株，培养温度35℃，摇床转速160r/min，培养时间为14h，种子液OD600为0.8；
深层发酵培养基组成，按重量计(w/w)为：玉米粉1％、豆粕1.4％、硝酸铵0.5％、硫酸锰0.01％、硫酸镁0.08％、氯化钠0.01％、硫酸亚铁0.004％、氯化钙0.05％，加水至1000mL，pH7.3～7.4；121℃，0.15Mpa灭菌20min；
深层发酵条件：接种量为5％(v/w)，培养温度34℃，摇床转速150r/min，培养时间为72h；
发酵结束，发酵液中芽孢含量达到5×109CFU/mL；
将发酵完成的液体芽孢，加入其13％(w/v)的粉末碳酸钙作为保护剂，在进风温度160℃、出风温度70℃～80℃喷雾干燥，制备的干粉菌剂芽孢含量达到13×1010CFU/g。
某硫脲生产公司产生含硫脲废水，硫脲含量在400～500mg/L，严重影响了生化系统的出水指标，系统进水的pH调节到7.0～8.5，在好氧生化系统接种0.5‰(w/v)硫脲降解干粉菌剂后，按照停留10d调节进水量，好氧生化处理系统控制温度25～35℃，溶氧2～4mg/L。
出水HPLC法检测硫脲完全降解、纳氏试剂分光光度计法检测氨氮稳定在2.0mg/L左右(如图2)。
实施例3
种子培养基组成，按重量计(w/w)为：葡萄糖1％，硫酸铵0.8％，酵母浸粉0.2％，硫酸镁0.09％，磷酸二氢钾0.01％，加水至1000mL，pH7.3～7.4；121℃，0.15Mpa灭菌20min；
接种量为每个三角瓶(100mL培养基)接种1支经过活化(将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下活化4h～8h)的试管斜面菌株，培养温度30℃，摇床转速180r/min，培养时间为18h，种子液OD600为0.5；
深层发酵培养基组成，按重量计(w/w)为：玉米粉2％、豆粕1.6％、硝酸铵0.2％、硫酸锰0.05％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.05％、硫酸亚铁0.003％、氯化钙0.01％，加水至1000mL，pH7.3～7.4；121℃，0.15Mpa灭菌20min；
深层发酵条件：接种量为10％(v/w)，培养温度31℃，摇床转速200r/min，培养时间为60h；
发酵结束，发酵液中芽孢含量达到10×109CFU/mL；
将发酵完成的液体芽孢，加入8％(w/v)玉米淀粉为保护剂，在进风温度140℃、出风温度60℃～70℃喷雾干燥，制备的干粉菌剂芽孢含量达到8×1010CFU/g。
某石化公司产生含硫脲废水，硫脲含量在50～100mg/L，影响了生化系统的出水指标，系统进水的pH调节到7.0～8.5，在好氧生化系统接种0.2‰(w/v)硫脲降解干粉菌剂后，按照停留2d调节进水量，好氧生化处理系统控制温度25～35℃，溶氧2～4mg/L。
出水HPLC法检测硫脲完全降解、纳氏试剂分光光度计法检测氨氮稳定在0.6mg/L左右(如图3)。
实施例4
种子培养基组成，按重量计(w/w)为：葡萄糖1.6％，硫酸铵1％，酵母浸粉0.7％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.04％，加水至1000mL，pH7.3～7.4；121℃，0.15Mpa灭菌20min；
接种量为每个三角瓶(100mL培养基)接种1支经过活化(将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下活化4h～8h)的试管斜面菌株，培养温度32℃，摇床转速150r/min，培养时间为16h，种子液OD600为0.6；
深层发酵培养基组成，按重量计(w/w)为：玉米粉1.6％、豆粕1％、硝酸铵0.1％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.1％、氯化钠0.02％、硫酸亚铁0.005％、氯化钙0.03％，加水至1000mL，pH7.3～7.4；121℃，0.15Mpa灭菌20min；
深层发酵条件：接种量为9％(v/w)，培养温度35℃，摇床转速170r/min，培养时间为48h；
发酵结束，发酵液中芽孢含量达到8×109CFU/mL；
将发酵完成的液体芽孢，加入12％(w/v)玉米淀粉为保护剂，在进风温度180℃、出风温度66℃～76℃喷雾干燥，制备的干粉菌剂芽孢含量达到5×1010CFU/g。
某物资再利用公司产生含硫脲废水，硫脲含量在200～300mg/L，影响了生化系统的出水指标，系统进水的pH调节到7.0～8.5，在好氧生化系统接种0.4‰(w/v)硫脲降解干粉菌剂后，按照停留6d调节进水量，好氧生化处理系统控制温度25～35℃，溶氧2～4mg/L。
出水HPLC法检测硫脲完全降解、纳氏试剂分光光度计法检测氨氮稳定在1.0mg/L左右(如图4)。
从以上述实施例中可以看出，在没有添加硫脲降解菌剂的生化系统中，氨氮几乎不降低，添加了本发明的硫脲降解菌剂的生化系统出水中氨氮几乎全部降解。
实验例
以实施例2中的含硫脲废水以及实施例2的废水处理方法与现有常规处理方法进行对比：
现有常规处理方法(对比组)为：先化学法去除硫脲、再进生化系统处理，以使废水达标排放，化学法采用专利CN106830487A提出的用氧化剂氧化硫脲、经过沉降工艺以达到去除硫脲的处理工艺；本发明采用的硫脲降解菌株生物法(实施例2)处理含硫脲废水。
表1实施例2中的含硫脲废水处理方法的优缺点比较
Figure BDA0001923891590000051
通过上述对比也可以看出，采用本发明的硫脲降解菌株生化法处理含硫脲废水与传统处理方法相比优势明显，占地小成本低，流程操作简单，处理时间短，避免了用化学法处理引起二次污染，利用本发明菌株处理含硫脲废水具有耐受负荷高、成本低、处理效果好、出水水质稳定、运行管理简便的优点。
序列表
<110> 黄河三角洲京博化工研究院有限公司
<120> 一株硫脲降解菌株及应用该菌株处理含硫脲废水的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400> 1
tgcaagtcga gcgaatggat taagagcttg ctcttatgaa gttagcggcg gacgggtgag 60
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cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1380
cacccgaagt cggtggggta acctttttgg agccagccgc ctaaggtg 1428

Claims (9)

1.一株硫脲降解菌株YJY18-03 ，其特征在于：该菌株YJY18-03属于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.16152；其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.应用权利要求1菌株YJY18-03 处理含硫脲废水的方法，包括1）制备干粉菌剂，2）好氧生化处理过程，其特征在于，步骤2）好氧生化处理具体为：接种干粉菌剂于好氧生化处理系统中，按照废水硫脲含量调节系统进水，经好氧生化处理后，硫脲完全降解，系统出水氨氮合格。
3.根据权利要求2所述的处理含硫脲废水的方法，其特征在于，好氧生化处理过程的具体条件为：干粉菌剂接种量为好氧生化处理系统总体积的0.1‰～0.5‰（w/v），系统进水的pH调节到7.0～8.5，硫脲含量≤500mg/L，停留时间0.5～10d。
4.根据权利要求2或3所述的处理含硫脲废水的方法，其特征在于，好氧生化处理系统控制温度25～35℃，溶氧2～4mg/L。
5.根据权利要求2所述的处理含硫脲废水的方法，其特征在于，步骤1）制备的干粉菌剂的芽孢含量为5～15×1010CFU /g。
6.根据权利要求2所述的处理含硫脲废水的方法，其特征在于，步骤1）制备干粉菌剂：包括菌种活化，液体种子制备，深层发酵以及干燥过程；
所述的液体种子制备具体过程为：在无菌操作台上，将活化的试管斜面菌种用10mL灭菌后的蒸馏水制成菌体悬浮液，冲洗入100mL培养基中，振荡培养12～18h，得到种子液；
所述的深层发酵具体过程为：取制备好的种子液，按照 5%～10%（v/w）的接种量接种于灭菌的发酵培养基中，进行深层发酵，获得液体芽孢；
所述的干燥过程具体为：将深层发酵完成的液体芽孢，加入保护剂，进行喷雾干燥。
7.根据权利要求6所述的处理含硫脲废水的方法，其特征在于，所述的保护剂为玉米淀粉或粉末碳酸钙，加入量为液体芽孢的8%～13%（w/v）；喷雾干燥条件为进风温度120℃～180℃，出风温度60℃～80℃。
8.根据权利要求6所述的处理含硫脲废水的方法，其特征在于，液体种子培养基组成及培养条件如下：
液体种子培养基组成，按重量计（w/w）为：葡萄糖1%～2%，硫酸铵0.5%～1%，酵母浸粉0.2%～1%，硫酸镁0.02%～0.1%，磷酸二氢钾0.01%～0.05%,加水至1000mL，pH7.3～7.4；
液体种子制备过程的培养条件为：培养温度30℃～35℃，摇床转速150r/min ～200r/min，培养时间为12～18h，检测OD600=0.5～0.8时停止培养。
9.根据权利要求6所述的处理含硫脲废水的方法，其特征在于，深层发酵培养基组成和发酵条件如下：
深层发酵培养基组成，按重量计（w/w）为：玉米粉1%～2%，豆粕1%～2%，硝酸铵0.1%～0.5%，硫酸锰0.01%～0.05%，硫酸镁0.03%～0.1%，氯化钠0.01%～0.05%，硫酸亚铁0.001%～0.005%，氯化钙0.01%～0.05%，加水至1000mL ，pH7.3～7.4；
深层发酵条件为：培养温度30℃～35℃，摇床转速150r/min ～200r/min，培养时间为48～96h，检测芽孢含量达到5～10×109CFU /mL停止发酵。
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