CN103911295B - 毛栓菌菌株及其在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用 - Google Patents

Abstract

一种毛栓菌SEM-6（<i>Trametes</i><i> trogii </i>SEM-6），该菌株已于2014年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2014002。一种毛栓菌菌株在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用，属于生物工程技术领域。本发明利用有机质含量在40-60%（以干重计）的市政脱水污泥作为主要发酵基质通过液体发酵或者固体发酵方式生产漆酶，从而实现污泥中有机成分的高值化利用的目的。本发明所生产的漆酶可以用于木质纤维素预处理、环境污染物治理等方面。

Description

毛栓菌菌株及其在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用

技术领域

本发明涉及一种毛栓菌菌株及其在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用。

背景技术

漆酶（EC1.10.3.2）属于铜蓝氧化酶家族，其底物范围十分广泛，可氧化单酚、二酚、多酚、二胺、芳香胺、甲基酚、抗坏血酸以及非酚类的化合物等。漆酶是一种环境友好型生物催化剂，能在氧的参与下对底物进行降解，其副产物是水，在环境污染治理、生物修复、造纸工业、食品工业、生物质能源等多个领域，有着极为广阔的应用前景。漆酶广泛存在于生物体中，目前已经在真菌、细菌、植物、动物及藻类中发现，其中产漆酶能力最强的为真菌，尤其是白腐菌。

近年来，随着城镇化进程的发展，我国污水排放量日益增加，城市污水处理能力也在不断提升。而污泥作为城市污水处理过程中的体积最大的副产物，其生成量也在迅速增加，这些大量产生的剩余脱水污泥越来越成为严重的环境与社会问题。“十二五”期间，我国节能减排形式极为严峻，因此在污泥处理处置工艺中应首先采用低能耗技术，并优先考虑其资源化利用方式。市政脱水污泥中含有大量的水分，其处置难度极大。目前，针对市政脱水污泥处理处置的方法主要为堆肥、焚烧、制造建筑材料及提取污泥蛋白等方法，但未有利用市政脱水污泥发酵产漆酶的报道。

目前漆酶采用微生物发酵法进行生产，其所用原料主要为工业原料如葡萄糖、麦芽糖、硫酸铵、酒石酸铵以及酵母膏、蛋白胨、玉米粉、作物秸秆、麸皮等（高大文，梁红，陈军。一种培养白腐真菌分泌漆酶的培养基。中国专利CN200810064055.3；马瑛，贾红华，周华，韦萍。高活性漆酶产生菌的发酵条件优化。南京工业大学学报（自然科学版），32（2）：82-86；肖亚中，洪宇植、张赫，袁璟，房伟。一种真菌共培养发酵生产漆酶的方法。中国专利申请书200610037937.1；肖亚中，孙芹英，房伟，洪宇植，张敏，葛洪华。栓菌AH-28固态发酵生产漆酶的方法。中国专利申请书200610037655.1；郑晓冰，郭丽琼，付小燕，刁惠萍，林俊芳。木霉LaTr01菌株产漆酶发酵的条件。生物加工过程，2007，5（4）：19-24；武忠伟，王振河，赵现方，窦艳萍。白腐真菌固体发酵玉米秸秆产漆酶条件的优化。湖北农业科学，46（5）：735-737）。通过文献对比发现，目前漆酶发酵中所用原料成本较高，不利于其进一步开发利用。市政脱水污泥中有机质含量较高，能够用作发酵漆酶生产的主要原料。由于污泥中成分复杂，且污泥中微生物细胞壁破解难度大，导致很多微生物对其利用效率较低。因此，建立合适的预处理方法并寻找利用污泥能力较强的微生物菌株是提高其资源化利用水平的关键。

发明内容

针对现有技术的局限性和不足，本发明的目的是提供一种毛栓菌菌株及其在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用。本发明提供了一种利用市政脱水污泥生产漆酶的方法，该方法利用新获得的毛栓菌SEM-6（TrametestrogiiSEM-6）高效利用市政脱水污泥生产漆酶，具有良好的应用前景和工业化潜力。

本发明所用菌株为毛栓菌SEM-6，拉丁文学名TrametestrogiiSEM-6，该菌株已于2014年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCCNo．M2014002（TrametestrogiiSEM-6）。

本发明提供了一种毛栓菌菌株在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用，其特征是它是利用毛栓菌SEM-6液体发酵产漆酶技术，具体由如下步骤组成：

（1）液体种子培养基：葡萄糖20克/升，豆粕5克/升，酵母粉1克/升，磷酸二氢钾1克/升，七水硫酸镁0.5克/升，初始pH4-7，摇床转速为200转/分钟，接种菌株CCTCCNo．M2014002毛栓菌SEM-6后，培养时间为48-72小时，获得液体发酵种子；

（2）液体发酵培养基，以干物质含量计：污泥发酵基质为20-50克/升，同时加入1-5克/升的磷酸二氢钾、1-2克/升的七水硫酸镁、5-15克/升的麸皮，调整初始pH值为3-7，121℃灭菌30分钟，获得液体发酵培养基；所述污泥发酵基质经过氢氧化钠预处理的市政脱水污泥，氢氧化钠预处理的具体方法为：以重量份计，在含水量为60-80%的市政脱水污泥100份中加入氢氧化钠0.2-1份，市政脱水污泥中干物质有机质含量为40-60%，搅拌均匀后在20-35℃条件下处理2-4天，即可获得污泥发酵基质；

（3）漆酶生产：采用步骤（2）所述液体发酵培养基，以液体发酵培养基重量的5-10%接入液体发酵种子，控制溶氧相对百分含量大于等于20%，以30℃条件下培养基中饱和氧浓度为100%，搅拌电机转速为100-200转/分，发酵时间为5-10天，获得含有漆酶的发酵液，其中漆酶活力达到5.4-15.8U/毫升。

本发明所述漆酶活力（U）定义：将1.9毫升100毫摩尔/升的柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH3.0)和0.5毫升10毫摩尔/升2,6-二甲氧基酚组成的反应体系在60℃保温5分钟后，加入0.1毫升酶液，测定470纳米处吸光度的增加值。以每分钟氧化1微摩尔的2,6-二甲氧基酚生成3,5,3’,5’-四甲氧基二苯醌（摩尔消光系数（470纳米）=49600摩尔^-1·厘米^-1）所需要的漆酶量定义为1个酶活力单位(U)。

一种毛栓菌菌株在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用，其特征是它是利用毛栓菌SEM-6固体发酵产漆酶技术，具体由如下步骤组成：（1）液体种子培养基：葡萄糖20克/升，豆粕5克/升，酵母粉1克/升，磷酸二氢钾1克/升，七水硫酸镁0.5克/升，初始pH4-7，摇床转速为200转/分钟，接种菌株CCTCCNo．M2014002毛栓菌SEM-6后，培养时间为48-72小时，获得液体发酵种子；

（2）固体发酵培养基，以重量份计：污泥发酵基质60-90份，麸皮1-10份，玉米秸秆粉1-10份，蘑菇渣5-15份，磷酸二氢钾0.1-1份，七水硫酸镁0.05-0.2份，调整培养基初始含水量为50-65%，121℃灭菌30-60分钟，获得固体发酵培养基；所述市政脱水污泥是经过氢氧化钠预处理的市政污泥，氢氧化钠预处理的具体方法为：以重量份计，在含水量为60-80%的市政脱水污泥100份中加入氢氧化钠0.2-1份，市政脱水污泥中干物质有机质含量为40-60%，搅拌均匀后在20-35℃条件下处理2-4天，获得污泥发酵基质；

（3）以固体发酵培养基重量的2-5%接入液体发酵种子，搅拌均匀后置入固体发酵罐中进行固态发酵；发酵条件为25-30℃，搅拌速度为5-30转/分钟，通风量体积为培养基实际体积的0.5-1.2倍，发酵时间为5-10天，获得含有漆酶的发酵产物，漆酶活力可达10.4-30.3U/克干基。

本发明所述毛栓菌SEM-6是利用济南市市政脱水污泥中通过选择性培养基（污泥浸出液1000毫升，愈创木酚0.06克，玉米淀粉2克，葡萄糖0.5克，琼脂20克，pH5，121℃灭菌30分钟后倒平板）筛选获得。其中污泥浸出液是指，将含水量60-80%的污泥烘干至含水量10%以下，以200克干污泥加入1000毫升自来水的比例进行提取并煮沸处理30分钟，离心获得的上清液。该毛栓菌有如下特征：在选择性培养基上生长迅速，5天即可布满平板，气生菌丝为白色，毛茸状，菌落周围能够产生明显铁红色氧化带。

本发明所述毛栓菌SEM-6ITS-5.8SrDNA核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。通过美国生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)序列同源性分析，将本发明的菌株毛栓菌SEM-6（TrametestrogiiSEM-6）CCTCCNo．M2014002的ITS-5.8SrDNA核苷酸通过BLAST工具进行比对，比对结果表明该菌株属于毛栓菌。结合该菌株所培养出的子实体、菌丝体形态分析和孢子的形态分析根据《真菌鉴定手册》（魏景超著）表明该菌株属于栓菌属中的毛栓菌。

序列表SEQIDNo.1

毛栓菌SEM-6（TrametestrogiiSEM-6）ITS-5.8SrDNA核苷酸序列

1AGCTGGCTTCTCCGGAGCCATGTGCACGCCCTGCTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTA

61CTGTGGGTATCGGGAGGTGTCGCGTCGTTTACGGCGAGGCGTTAACCGTGCCTACGTTTT

121ACTACAAACGATTCAGTATCAGAATGTGTATTGCGATGTAACGCATCTATATACAACTTT

181CAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAAT

241GTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTAT

301TCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATTCTCAAACCCATAAGTCTTTGCGGGC

361TTACGGGCTTTGGACTTGGAGGCTTGTCGGCGACCGTGAGGTCACATCGACTCCTCTCAA

421ATGCATTAGCTTGATTCCTTGCGGATCGGCTCTCGGTGTGATAATTGTCTACACCGTGAC

481CGTGAAGCGCTTTGGCTAGCTTCTAACCGACTCTAATTAGACAGCTTACTTTGACCTCTG

541ATTTCAAATCAGGTTGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATTTCA

本发明中如无特殊说明，原料用量均为重量份。

文中所提到的市政脱水污泥是指市政给排水处理系统给水、雨水、生活污水等收集并由水质净化厂经活性污泥法处理后经絮凝、脱水后所产生的含水量为60-80%的污泥，尤其是指干物质中有机质含量在40-60%的市政脱水污泥，脱水污泥干物质中含氮量为20-60毫克每克，含碳量为100-300毫克每克。

本发明的有益效果：市政脱水污泥来源广泛，且有机质含量高。本发明以市政脱水污泥作为发酵主要原料生产漆酶，能大幅降低漆酶的生产成本，同时对污泥中的部分污染物（酚类、多环芳烃等有害物质）进行生物降解处理。其中固体发酵生产漆酶工艺还能作为污泥的预处理手段用于污泥堆肥、污泥生物干化等方面，可降低污泥中的有害污染物水平，提高污泥的生物利用效率。本发明利用新获得的毛栓菌菌株利用市政脱水污泥作为主要原料进行漆酶生产，其液体发酵最高酶活力达到15.8U/毫升，固体发酵最高酶活力达到30.3U/克干重，液体发酵水平为15.8U/毫升。在利用剩余市政脱水污泥为主要原料发酵产漆酶时，其产酶量和发酵速度均有明显优势（以血红密孔菌GW(CGMCCNo.1008)进行液体发酵时其产量为0.2U/毫升）。

具体实施方式

以下结合实施例对发明进行进一步说明，但本发明不仅限于此。

实施例1

一种毛栓菌菌株在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用，它包括脱水如下步骤：（1）液体种子培养基（克/升）：葡萄糖20，豆粕5，酵母粉1，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.5，初始pH5，摇床转速为200转/分钟，接种毛栓菌SEM-6(CCTCCNo.M2014002)，培养时间为48小时，获得液体发酵种子。（2）液体发酵培养基（克/升）：烘干后的污泥发酵基质20（从济南市光大水务一厂获得，有机质占其干重的40%，经过氢氧化钠预处理。其具体方法为：在重量份为100、含水量为60%的市政脱水污泥中加入重量份为0.2的氢氧化钠，搅拌均匀后在20℃条件下处理2天，即可获得污泥发酵基质。），磷酸二氢钾5、七水硫酸镁2、麸皮5，调整初始pH值为3，121℃灭菌30分钟，获得用于漆酶生产的液体发酵培养基。（3）漆酶生产：采用步骤（2）所述液体发酵培养基，以液体发酵培养基重量的5%接入液体发酵种子，控制溶氧水平相对百分含量为20%，以30℃条件下培养基中饱和氧浓度为100%，搅拌电机转速为100转/分，发酵时间为5天，获得含有漆酶的发酵液，其漆酶活力水平达到5.4U/毫升。

实施例2

一种毛栓菌菌株在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用，它包括如下步骤：（1）液体种子培养基（克/升）：葡萄糖20，豆粕5，酵母粉1，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.5，初始pH4，摇床转速为200转/分钟，接种毛栓菌SEM-6(CCTCCNo.M2014002)，培养时间为60小时，获得液体发酵种子。（2）液体发酵培养基（克/升）：烘干后的污泥发酵基质50（从济南市光大水务二厂获得，有机质占其干重的52%，经氢氧化钠预处理。其具体方法为：在重量份为100、含水量为80%的市政脱水污泥中加入重量份为1的氢氧化钠，搅拌均匀后在35℃条件下处理4天，即可获得污泥发酵基质），麸皮10，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁1.5，调整初始pH值为7，121℃灭菌30分钟，获得用于漆酶生产的液体发酵培养基。（3）漆酶生产：采用步骤（2）所述液体发酵培养基，以液体发酵培养基重量的8%接入液体发酵种子，控制溶氧相对百分含量为30%，以30℃条件下培养基中饱和氧浓度为100%，搅拌电机转速为200转/分，发酵时间为7天，获得含有漆酶的发酵液，其漆酶活力水平达到8.2U/毫升。

实施例3

一种毛栓菌菌株在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用，它包括如下步骤：（1）液体种子培养基（克/升）：葡萄糖20，豆粕5，酵母粉1，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.5，初始pH7，摇床转速为200转/分钟，接种毛栓菌SEM-6(CCTCCNo.M2014002)，培养时间为72小时，获得液体发酵种子。（2）液体发酵培养基（克/升）：烘干后的污泥发酵基质40（从济南市光大水务二厂获得，有机质占其干重的60%，经氢氧化钠预处理。其具体方法为：在重量份为100、含水量为70%的市政脱水污泥中加入重量份为0.6的氢氧化钠，搅拌均匀后在30℃条件下处理3天，即可获得污泥发酵基质。），磷酸二氢钾3、七水硫酸镁1、麸皮15，调整初始pH值为5，121℃灭菌30分钟，获得获得用于漆酶生产的液体发酵培养基。（3）漆酶生产：采用步骤（2）所述液体发酵培养基，以发酵培养基重量的10%接入液体发酵种子，控制溶氧相对百分含量为25%，以30℃条件下培养基中饱和氧浓度为100%，搅拌电机转速为150转/分，发酵时间为10天，获得含有漆酶的发酵液，其漆酶活力水平达到15.8U/毫升。

实施例4

一种毛栓菌菌株在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用，它包括如下步骤：（1）液体种子培养基（克/升）：葡萄糖20，豆粕5，酵母粉1，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.5，初始pH4，摇床转速为200转/分钟，接种毛栓菌SEM-6(CCTCCNo.M2014002)，培养时间为48小时，获得液体发酵种子。（2）固体发酵培养基（重量份）：污泥发酵基质60（含水量70%，从济南光大水务一厂获得，经氢氧化钠预处理。其具体方法为：在重量份为100的市政脱水污泥中加入重量份为1的氢氧化钠，搅拌均匀后在35℃条件下处理2天，获得污泥发酵基质）麸皮1，玉米秸秆粉10，蘑菇渣10，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.2，培养基初始含水量为65%，121℃灭菌30分钟，获得固体发酵培养基。（3）以固体发酵培养基重量的2%接入液体发酵种子，搅拌均匀后置入固体发酵罐中进行固态发酵。发酵条件为25℃，搅拌速度为5转/分钟，通风量体积为培养基实际体积的0.5倍，发酵时间为5天，获得含有漆酶的发酵产物，其漆酶活力可达10.4U/克干重。

实施例5

一种毛栓菌菌株在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用，它包括如下步骤：（1）液体种子培养基（克/升）：葡萄糖20，豆粕5，酵母粉1，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.5，初始pH5，摇床转速为200转/分钟，接种毛栓菌SEM-6(CCTCCNo.M2014002)，培养时间为54小时，获得液体发酵种子。（2）固体发酵培养基（重量份）：污泥发酵基质90（在重量份为100、含水量为80%的市政脱水污泥中加入重量份为0.2的氢氧化钠，搅拌均匀后在35℃条件下处理4天，获得污泥发酵基质，麸皮10，玉米秸秆粉5，蘑菇渣5，磷酸二氢钾0.1，七水硫酸镁0.05，培养基初始含水量为60%，121℃灭菌40分钟，获得固体发酵培养基（3）以固体发酵培养基重量的3%接入液体发酵种子，搅拌均匀后置入固体发酵罐中进行固态发酵。发酵条件为28℃，搅拌速度为15转/分钟，通风量体积为培养基实际体积为1倍，发酵时间为7天，获得含有漆酶的发酵产物，其漆酶活力可达17.2U/克干重。

实施例6

一种毛栓菌菌株在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用，它包括如下步骤：（1）液体种子培养基（克/升）：葡萄糖2，豆粕5，酵母粉1，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.5，初始pH7，摇床转速为200转/分钟，接种毛栓菌SEM-6(CCTCCNo.M2014002)，培养时间为72小时，获得液体发酵种子。（2）固体发酵培养基（重量份）：污泥发酵基质80（含水量65%，从济南光大水务二厂获得。污泥重量份为100，加入重量份为0.5的氢氧化钠，搅拌均匀后在30℃条件下处理3天，获得污泥发酵基质），麸皮8，玉米秸秆粉1，蘑菇渣15，磷酸二氢钾0.6，七水硫酸镁0.1，培养基初始含水量为50%，121℃灭菌60分钟。（3）以固体发酵培养基重量的5%接入液体发酵种子，搅拌均匀后置入固体发酵罐中进行固态发酵。发酵条件为30℃，搅拌速度为30转/分钟，通风量体积为培养基实际体积的1.2倍，发酵时间为10天，获得含有漆酶的发酵产物，其漆酶活力可达30.3U/克干重。

实施例7

一种血红密孔菌在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用，它包括如下步骤：（1）液体种子培养基（克/升）：葡萄糖20，豆粕5，酵母粉1，磷酸二氢钾1，七水硫酸镁0.5，初始pH7，摇床转速为200转/分钟，接种菌株血红密孔菌GW(CGMCCNo.1008)（郭林，王文惠，张虎成，李伟。一种血红密孔菌GW菌漆酶的制备方法。中国专利CN200310118373.0），培养时间为72小时，获得液体发酵种子。（2）液体发酵培养基（克/升）：污泥发酵基质40（以从济南市光大水务二厂获得，有机质占其干重的60%，经氢氧化钠预处理。其具体方法为：在重量份为100、含水量为70%的市政脱水污泥中加入重量份为0.6的氢氧化钠，搅拌均匀后在30℃条件下处理3天，获得污泥发酵基质。），磷酸二氢钾3、七水硫酸镁1、麸皮15，初始pH值为6，121℃灭菌30分钟。（3）漆酶生产：采用步骤（2）所述液体发酵培养基，以发酵培养基体积的10%接入液体发酵种子，控制溶氧相对百分含量25%，以30℃条件下培养基中饱和氧浓度为100%，搅拌电机转速为150转/分，发酵时间为10天，获得含有漆酶的发酵液，其漆酶活力为0.2U/毫升，明显低于本发明实施例。

Claims (2)

1.一种毛栓菌菌株在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用，其特征是它是利用毛栓菌SEM-6液体发酵产漆酶技术，具体由如下步骤组成：

（1）液体种子培养基：葡萄糖20克/升，豆粕5克/升，酵母粉1克/升，磷酸二氢钾1克/升，七水硫酸镁0.5克/升，初始pH4-7，摇床转速为200转/分钟，接种菌株CCTCCNo．M2014002毛栓菌SEM-6后，培养时间为48-72小时，获得液体发酵种子；

（2）液体发酵培养基，以干物质含量计：污泥发酵基质为20-50克/升，同时加入1-5克/升的磷酸二氢钾、1-2克/升的七水硫酸镁、5-15克/升的麸皮，调整初始pH值为3-7，121℃灭菌30分钟，获得液体发酵培养基；所述污泥发酵基质是经过氢氧化钠处理的市政脱水污泥；处理的具体方法为：以重量份计，在含水量为60-80%的市政脱水污泥100份中加入氢氧化钠0.2-1份，市政脱水污泥中干物质有机质含量为40-60%，搅拌均匀后在20-35℃条件下处理2-4天，即可获得污泥发酵基质；

（3）漆酶生产：采用步骤（2）所述液体发酵培养基，以液体发酵培养基重量的5-10%接入液体发酵种子，控制溶氧相对百分含量大于等于20%，以30℃条件下培养基中饱和氧浓度为100%，搅拌电机转速为100-200转/分，发酵时间为5-10天，获得含有漆酶的发酵液。

2.一种毛栓菌菌株在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用，其特征是它是利用毛栓菌SEM-6固体发酵产漆酶技术，具体由如下步骤组成：（1）液体种子培养基：葡萄糖20克/升，豆粕5克/升，酵母粉1克/升，磷酸二氢钾1克/升，七水硫酸镁0.5克/升，初始pH4-7，摇床转速为200转/分钟，接种菌株CCTCCNo．M2014002毛栓菌SEM-6后，培养时间为48-72小时，获得液体发酵种子；

（2）固体发酵培养基，以重量份计：污泥发酵基质60-90份，麸皮1-10份，玉米秸秆粉1-10份，蘑菇渣5-15份，磷酸二氢钾0.1-1份，七水硫酸镁0.05-0.2份，调整培养基初始含水量为50-65%，121℃灭菌30-60分钟，获得固体发酵培养基；所述污泥发酵基质是经过氢氧化钠预处理的市政脱水污泥，氢氧化钠预处理的具体方法为：以重量份计，在含水量为60-80%的市政脱水污泥100份中加入氢氧化钠0.2-1份，市政脱水污泥中干物质有机质含量为40-60%，搅拌均匀后在20-35℃条件下处理2-4天，即可获得污泥发酵基质；

（3）以固体发酵培养基重量的2-5%接入液体发酵种子，搅拌均匀后置入固体发酵罐中进行固态发酵；发酵条件为25-30℃，搅拌速度为5-30转/分钟，通风量体积为培养基实际体积的0.5-1.2倍，发酵时间为5-10天，获得含有漆酶的发酵产物。