CN110241032B - 一种近玫色锁掷孢酵母及其应用 - Google Patents
一种近玫色锁掷孢酵母及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110241032B CN110241032B CN201910310799.7A CN201910310799A CN110241032B CN 110241032 B CN110241032 B CN 110241032B CN 201910310799 A CN201910310799 A CN 201910310799A CN 110241032 B CN110241032 B CN 110241032B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- sporobolomyces
- ssm
- laccase
- trametes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000222068 Sporobolomyces <Sporidiobolaceae> Species 0.000 title claims abstract description 30
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 241000222357 Trametes hirsuta Species 0.000 claims abstract description 46
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 30
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 30
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 16
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 claims abstract description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 241000220317 Rosa Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 241000228389 Sporidiobolus Species 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 7
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 6
- 241000123675 Sporobolomyces roseus Species 0.000 claims description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 abstract description 9
- 241000222354 Trametes Species 0.000 abstract description 6
- 241000218231 Moraceae Species 0.000 abstract description 3
- 241000218213 Morus <angiosperm> Species 0.000 abstract description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 9
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 3
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 3
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 241000222355 Trametes versicolor Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000143459 Hirsutella Species 0.000 description 2
- 241000352027 Microbotryomycetes Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 235000006521 Pleurotus eryngii var ferulae Nutrition 0.000 description 2
- 244000088486 Pleurotus eryngii var. ferulae Species 0.000 description 2
- 241001157811 Pucciniomycotina Species 0.000 description 2
- 241000223254 Rhodotorula mucilaginosa Species 0.000 description 2
- 241000221523 Rhodotorula toruloides Species 0.000 description 2
- 241001085826 Sporotrichum Species 0.000 description 2
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 2
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- -1 salt ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000222501 Agaricaceae Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010031396 Catechol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000030523 Catechol oxidase Human genes 0.000 description 1
- 241000146399 Ceriporiopsis Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101000946191 Galerina sp Laccase-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000043368 Multicopper oxidase Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 241000222397 Phlebia radiata Species 0.000 description 1
- 241000222341 Polyporaceae Species 0.000 description 1
- 241000222383 Polyporales Species 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 241001160214 Sporidiobolaceae Species 0.000 description 1
- 241000823806 Sporidiobolus sp. Species 0.000 description 1
- 101000946418 Trametes hirsuta Laccase Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003157 biological pigment Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000001879 copper Chemical class 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 150000001261 hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108700020788 multicopper oxidase Proteins 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002902 organometallic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 239000002957 persistent organic pollutant Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12N9/0061—Laccase (1.10.3.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
- C12Y110/03—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with an oxygen as acceptor (1.10.3)
- C12Y110/03002—Laccase (1.10.3.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Botany (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种新菌株——近玫色锁掷孢酵母SSM‑8(Sporidiobolus pararoseus，SSM‑8)，及其与毛栓菌共培养制备漆酶的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明的近玫色锁掷孢酵母SSM‑8是本发明的发明人从杭州西溪湿地的桑树上桑葚中分离得到的一种新菌株，该菌株已于2019年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2019034。本发明还涉及近玫色锁掷孢酵母SSM‑8与毛栓菌共培养制备漆酶的应用，具体为：以毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母SSM‑8为原料分别制备毛栓菌种子液和近玫色锁掷孢酵母种子液，将其依次接种到共培养发酵培养基中振荡培养得到含漆酶的发酵液，本发明发酵获得的漆酶活力高，符合工业化大规模生产要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种新菌株——近玫色锁掷孢酵母SSM-8(Sporidioboluspararoseus，SSM-8)，及其与毛栓菌共培养制备漆酶的方法，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
漆酶(Laccase,ρ-diphenoloxidase,EC1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，属蓝色多铜氧化酶家族。漆酶广泛存在于自然界中，包括真菌、细菌、植物及昆虫等。真菌是漆酶的主要产生菌，其中以担子菌门的白腐真菌研究为主。漆酶是一种环境友好型酶类，可催化氧化多种底物，如酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、羟酸及其衍生物、一些金属有机化合物和甾类激素、生物色素等，在环境保护与修复、造纸工业、有机合成、食品工业、生物监测等领域有着广泛的应用前景。
漆酶诱导表达是提高白腐真菌漆酶产量的一个重要途径，其诱导方式主要有外源化合物诱导和共培养诱导两种。外源化合物如金属盐离子、醇类、芳香族小分子类及木质素降解过程的中间产物或衍生物等对自腐真菌漆酶产量具有明显的诱导作用。诱导剂的添加一方面增加了成本，另一方面可能引入有毒的芳香类化合物或金属离子，增加了后处理的成本，也容易造成环境污染，不利于大规模工业化生产。微生物共培养诱导漆酶生产，具有成本低廉、安全清洁、后处理简单等优点，更具有工业化应用前景。目前，共培养诱导的研究主要集中在近缘白腐真菌之间的漆酶诱导，例如Dichomitus squalens、Phlebia radiata和Ceriporiopsis共培养产漆酶降解农业上的废弃秸轩等。此外，也有木霉、曲霉、酵母等其他类型真菌诱导白腐真菌产漆酶的研究报道。
中国专利申请号CN201310232385.X，名称为“一种阿魏菇与胶红酵母共发酵生产漆酶的方法”，公开了一种阿魏菇与胶红酵母共发酵生产漆酶的方法，但其产酶水平并不高(18015.1U/L，ABTS法)，共培养时酶活力提高有限。
毛栓菌(Trametes hirsuta)，隶属于菌物界，担子菌门，伞菌纲，多孔菌目，多孔菌科,能够分泌多种对有机污染物有降解作用的氧化酶，是一类重要的产漆酶白腐真菌。目前，毛栓菌漆酶大多采用人工合成的培养基进行液态或者固态发酵制备，有关毛栓菌共培养诱导漆酶的研究报道较少，而且没有有关毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母共培养诱导漆酶的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种新菌株——近玫色锁掷孢酵母SSM-8(Sporidioboluspararoseus，SSM-8)，及其与毛栓菌共培养制备漆酶的方法，本发明共培养液体发酵工艺显著提高产漆酶水平，所产漆酶酶活性高。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明的近玫色锁掷孢酵母SSM-8(Sporidiobolus pararoseus，SSM-8)是本发明的发明人从杭州西溪湿地的桑树上桑葚中分离得到的一种新菌株，该菌株已于2019年1月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2019034SSM-8。
本发明所述的近玫色锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)SSM-8，隶属于担子菌门Basidiomycota；柄锈菌亚门Pucciniomycotina；微球黑粉菌纲Microbotryomycetes；锁掷酵母目Sporidiobolales；锁掷酵母科Sporidiobolaceae；锁掷酵母属Sporidiobolus。
本发明的近玫色锁掷孢酵母SSM-8菌株特征如下：
菌落形态：菌落生长较快，菌落呈粉红色，表面光滑、湿润，边缘整齐，易挑起。
显微(10×40高倍显微镜)形态：显微镜下观察，菌体呈椭球形，以出芽方式进行繁殖。
本发明提取所述的近玫色锁掷孢酵母SSM-8的总DNA，以通用引物ITS1和ITS4为引物，成功扩增了它的ITS区序列，增的序列大小约为550bp，将它们交由上海生工生物工程有限公司测序。将ITS序列提交Genebank，本发明菌株SSM-8序列与近玫色锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)序列同源性为99％，结合形态学观察，该菌鉴定为近玫色锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)。
其中，上述菌株近玫色锁掷孢酵母SSM-8的ITS序列如附录表SEQ ID NO：1所示。
本发明还涉及所述的近玫色锁掷孢酵母SSM-8与毛栓菌共培养制备漆酶的应用。
具体的，所述的应用为：
S1、制备毛栓菌种子液：
取毛栓菌菌种接种到PDA斜面培养基，于20～30℃培养6～8天，将培养后的斜面菌种接种至PDB种子培养基，于20～30℃下振荡培养5～8天得到毛栓菌种子液，摇床转速为120～160r/min；
S2、制备近玫色锁掷孢酵母种子液：
取近玫色锁掷孢酵母SSM-8接种到PDA斜面培养基，于25～30℃培养2～4天，将培养后的斜面菌种接种至PDB种子培养基，于25～30℃振荡培养2～3天得到近玫色锁掷孢酵母种子液，摇床转速为120～180r/min；
S3、毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母共培养：
将步骤S1所得的毛栓菌种子液接种到共培养发酵培养基，于25～28℃振荡培养4～6天，摇床转速为120～160r/min，再将步骤2所得的近玫色锁掷孢酵母种子液接种到同一共培养发酵培养基，于25～28℃继续振荡培养培养3～7天即得含漆酶的发酵液。
优选的，步骤S3中所述共培养发酵培养基的组成为(终浓度)：马铃薯150～200g/L，玉米粉10～20g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，水。
优选的，步骤S1和S2中所述PDB培养基的组成为(终浓度)：马铃薯150～200g/L，葡萄糖10～20g/L，水；所述PDA培养基的组成为(终浓度)：150～200g/L，葡萄糖10～20g/L，琼脂15～20g/L，水。
本发明的有益效果主要体现在：
本发明首次将毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母共培养生产漆酶，并提供了一种新的菌株，在一定的工艺条件下，近玫色锁掷孢酵母SSM-8单培养时不产漆酶，与毛栓菌共培养时可显著提高漆酶酶活力；本发明在漆酶生产过程中无需添加化学诱导剂，生产工艺安全环保、后处理简单；本发明发酵获得的漆酶活力高，符合工业化大规模生产要求。
附图说明
图1为近玫色锁掷孢酵母SSM-8和毛栓菌的菌落形态图和显微形态图，其中，A为SSM-8菌落形态；B为SSM-8显微形态图；C为毛栓菌菌落形态；D为毛栓菌显微形态图。
图2为总DNA经通用引物ITS1/ITS4 PCR扩增后凝胶电泳图，其中，M为参照物Marker；泳道1为近玫色锁掷孢酵母的目的条带；泳道2为毛栓菌的目的条带。
图3为近玫色锁掷孢酵母SSM-8和毛栓菌(Trametes hirsuta)基于ITS序列的系统发育树(采用邻接法构建)。
图4为本发明实施例5毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母SSM-8共培养生产的漆酶的酶活力测试图。
图5为漆酶的Native-PAGE电泳图，其中，泳道1为毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母共培养；泳道2为毛栓菌单独培养；泳道3为近玫色锁掷孢酵母单培养。
具体实施方式
下面通过实施例，结合附图，对本发明的技术方案进一步阐述说明。
实施例1：近玫色锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)SSM-8的分离
近玫色锁掷孢酵母CCTCC M 2019034SSM-8于2018年5月分离自健康的桑葚。实验材料于2018年4月采自杭州西溪国家湿地公园的桑树。
分离按如下步骤进行：取健康的桑葚在75％乙醇中浸泡30s，取出后用灭菌水漂洗3次，再在3％的次氯酸钠溶液中浸泡30s，取出后用灭菌水漂洗3次。在无菌条件下将桑葚撕成小片置于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养2-4d；将分离物置于新鲜的PDA平板上多次划线分离纯化，将纯化后的菌株接种到斜面培养基上，于28℃培养3天后放于4℃冰箱保存。
上述PDA固体培养基的制备方法为：称取200g去皮马铃薯小块，加入500mL水，煮沸30min后，用4层纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖和20g琼脂，加热溶解后补水至1000mL，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。
实施例2：近玫色锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)SSM-8的鉴定
1、菌株平板形态观察
将本发明实施例1分离的菌株接种在PDA培养基平板上，于28℃培养箱内培养，观察菌落的形态。
请参阅附图1所示的近玫色锁掷孢酵母SSM-8的菌落形态图，所述菌株SSM-8的菌落形态为：菌落生长较快，菌落呈粉红色，表面光滑、湿润，边缘整齐，易挑起。
2、菌株显微形态观察
请参阅附图1所示的本发明近玫色锁掷孢酵母SSM-8的显微形态图，所述近玫色锁掷孢酵母SSM-8的显微形态(10×40高倍显微镜)为：菌体呈椭圆形，以出芽方式进行繁殖。
3、菌株的分子生物学鉴定
(1)DNA的提取
收集PDB培养基发酵4天的菌体，将菌体用液氮研磨后，用真菌基因组DNA提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取总DNA。
(2)ITS区序列的PCR扩增
引物序列为：ITS1(5′–TCCGTAGGTGAACCTGCGC–3′)和ITS4(5′–TCCTCCGCTTATTGATATGC–3′)。
PCR反应条件为：94℃预热5min，94℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸50s，共30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物(附图2)由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。
本发明所述近玫色锁掷孢酵母SSM-8的ITS碱基序列见附录SEQ ID NO：1所示。
(3)数据处理
序列数据在NCBI的Genbank中进行同源序列搜索比对，分析其同源性。
结果显示：本发明菌株SSM-8序列与近玫色锁掷孢酵母(Sporidioboluspararoseus)的同源性达到99％，请参阅附图3所示的近玫色锁掷孢酵母SSM-8基于ITS序列的系统发育树，综合形态学分类鉴定结果和分子生物学分类鉴定结果，最终鉴定该菌株为近玫色锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)。
实施例3：毛栓菌(Trametes hirsuta)
请参阅附图1所示的毛栓菌的显微形态图以及附图3所示的毛栓菌基于ITS序列的系统发育树。
本发明所述的毛栓菌的ITS碱基序列见附录SEQ ID NO：2所示。
实施例4：毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母种子液的制备
制备毛栓菌种子液：取从桑椹中分离得到的毛栓菌菌种接种到PDA斜面培养基，于20～30℃培养7d；将斜面菌种接种至PDB种子培养基，于20～30℃振荡培养5～8d，摇床转速120～160r/min，得到毛栓菌种子液。
制备近玫色锁掷孢酵母种子液：取从桑椹中分离得到的玫色锁掷孢酵母SSM-8接种到PDA斜面培养基，于25～30℃培养2～4天；将斜面菌种接种至PDB种子培养基，于25～30℃振荡培养2～3d，摇床转速120～180r/min，得到近玫色锁掷孢酵母种子液。
PDA培养基的组成为(终浓度)：150～200g/L，葡萄糖10～20g/L，琼脂15～20g/L，余量为水，自然pH。
PDB培养基的组成为(终浓度)：马铃薯150～200g/L，葡萄糖10～20g/L，余量为水，自然pH。
实施例5：毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母共培养制备漆酶
将实施例4制备的毛栓菌种子液3mL接种到共培养发酵培养基，于28℃振荡培养6天，摇床转速150r/min；再在共培养发酵培养基接种实施例4制备的近玫色锁掷孢酵母种子液4.5mL，于相同的条件下继续培养4天，即得含漆酶的发酵液。请参阅附图5，经检测，该漆酶发酵液中漆酶活力为31777U/L(ABTS法)，比单培养时提高了近10倍。
所述共培养发酵培养基的组成为(终浓度)：马铃薯150～200g/L，玉米粉10～20g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，其余成分为水，自然pH。容量为500mL的三角瓶的装液量为120mL。
所述漆酶酶活力的测定方法具体如下：
采用ABTS法测定漆酶酶活，反应体系为1mL，含Hac-NaAc(pH 4.5)缓冲溶液0.78mL，稀释后的发酵酶液20μL和1mmol/L的ABTS 100μL，每30s读取一次420nm下吸光值，每组3个重复。1个酶活力单位定义为在当前反应条件下每分钟氧化1μmol ABTS所需的酶量。
实施例6：毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母共培养制备漆酶
将实施例4制备的毛栓菌种子液3mL接种到共培养发酵培养基，于28℃振荡培养5天，摇床转速150r/min，再在共培养发酵培养基接种实施例4制备的近玫色锁掷孢酵母种子液4.5mL，于相同的条件下继续培养5天，即得含漆酶的发酵液。经检测，该漆酶发酵液中漆酶活力为28333U/L(ABTS法)。漆酶酶活力的测定方法同实施例5。
实施例7：毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母共培养产漆酶
将实施例4制备的毛栓菌种子液3mL接种到共培养发酵培养基，于28℃振荡培养6天，摇床转速150r/min，再在共培养发酵培养基接种实施例4制备的近玫色锁掷孢酵母种子液3mL，于相同的条件下继续培养4天，即得含漆酶的发酵液。经检测，该漆酶发酵液中漆酶活力为27500U/L(ABTS法)。漆酶酶活力的测定方法同实施例5。
实施例8：漆酶的Native-PAGE电泳
采用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)分析漆酶同工酶。分别取8μL毛栓菌单独培养发酵上清液、毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母共培养发酵上清液和近玫色锁掷孢酵母单培养发酵上清液进行检测，电泳后使用含有0.5mM ABTS的醋酸钠缓冲液(pH 4.5)染色，分析同工酶谱含量和组分。请参阅附图5所示的漆酶的Native-PAGE电泳图。
Native-PAGE分析表明，毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母SSM-8共培养时，漆酶同工酶谱发生改变。在共培养时，漆酶同工酶由Lac1、Lac2和Lac3组分共同组成；然而，毛栓菌单独培养时，漆酶同工酶组分主要以Lac2和Lac3为主。此外，毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母SSM-8共培养时，Lac3的酶活力比单培养时明显增加，而Lac2的酶活力与单培养时相当。
以上所述的实施例只是本发明的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其他的变体及改型。
序列表
<110> 浙江树人学院（浙江树人大学）
<120> 一种近玫色锁掷孢酵母及其应用
<130> 2019
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 578
<212> DNA
<213> 近玫色锁掷孢酵母SSM-8 (Sporidiobolus pararoseus，SSM-8)
<400> 1
tggggttttg gaccgggggg tgtccattta cttggaccca aacttctcaa ttctaacttt 60
gtgcatctgt attaatggcg agcaacttcg gttgtgagcc ttcacttaca aaacactagt 120
ctatgaatgt aaaattttta taacaaataa aaactttcaa caacggatct cttggctctc 180
gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat acgtaatgtg aattgcaaaa ttcagtgaat 240
catcgaatct ttgaacgcat cttgcgctct ctggtattcc ggagagcatg tctgtttgag 300
tgtcatgaat tcttcaaccc aatcttttct tgtaatcgat tggtgtttgg attctgagcg 360
ttgctggcgt ttgcctagct cgttcgtaat acattagcat ccctaataca agtttggatt 420
gacttggcgt aatagactat tcgctaagga ttcggtggaa acatcgagcc aacttcatta 480
aggaagctcc taatttaaaa gtctaccttt tgattagatc tcaaatcagg caggattacc 540
cgctgaactt aaagcatatc aataagcgga ggaaagat 578
<210> 1
<211> 599
<212> DNA
<213> 毛栓菌 (Trametes hirsuta)
<400> 1
ggcttcgggc ttgatgggtt gttgctggcc ttccgaggca tgtgcacgcc ctgctcatcc 60
actctacacc tgtgcactta ctgtaggttg gcgtgggttt ctagcctccg ggctgggagc 120
attctgccgg cctatgtaca ctacaaactc taaagtatca gaatgtaaac gcgtctaacg 180
catcttaata caactttcag caacggatct cttggctctc gcatcgatga agaacgcagc 240
gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac 300
cttgcgctcc ttggtattcc gaggagcatg cctgtttgag tgtcatgaaa ttctcaaccc 360
ataagtcctt gtgatctatg ggcttggatt tggaggcttg ctggccctag cggtcggctc 420
ctcttgaatg cattagcttg attccgtgcg gatcggctct cagtgtgata attgtctacg 480
ctgtgaccgt gaagcgtttt ggcaagcttc taaccgtcca ttaggacaat cttttaacat 540
ctgacctcaa atcaggtagg actacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggaggaa 599
Claims (7)
1.一种近玫色锁掷孢酵母，其特征在于，该近玫色锁掷孢酵母(Sporidioboluspararoseus)的保藏名称为近玫色锁掷孢酵母SSM-8，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2019年1月9日，保藏编号：CCTCCNO:M 2019034。
2.权利要求1所述的近玫色锁掷孢酵母的应用，其特征在于，将所述近玫色锁掷孢酵母SSM-8与毛栓菌共培养制备漆酶。
3.如权利要求2所述的近玫色锁掷孢酵母的应用，其特征在于，具体方法如下：
S1、制备毛栓菌种子液：
取毛栓菌菌种接种到PDA斜面培养基，于20～30℃培养6～8天，将培养后的斜面菌种接种到PDB种子培养基，于20～30℃下振荡培养5～8天得到毛栓菌种子液；
S2、制备近玫色锁掷孢酵母种子液：
取近玫色锁掷孢酵母SSM-8接种到PDA斜面培养基，于25～30℃培养2～4天，将培养后的斜面菌种接种到PDB种子培养基，于25～30℃振荡培养2～3天得到近玫色锁掷孢酵母种子液；
S3、毛栓菌和近玫色锁掷孢酵母共培养：
将步骤S1所得的毛栓菌种子液接种到共培养发酵培养基，于25～28℃振荡培养4～6天，再将步骤S2所得的近玫色锁掷孢酵母种子液接种到同一共培养发酵培养基，于25～28℃继续振荡培养培养3～7天即得含漆酶的发酵液。
4.如权利要求3所述的近玫色锁掷孢酵母的应用，其特征在于，步骤S3中所述毛栓菌种子液与共培养发酵培养基的体积比为(0.02～0.05)：1，所述近玫色锁掷孢酵母种子液与共培养发酵培养基的体积比为(0.02～0.04)：1。
5.如权利要求3所述的近玫色锁掷孢酵母的应用，其特征在于，步骤S1中振荡培养时摇床转速为120～160r/min，步骤S2中振荡培养时摇床转速为120～180r/min，步骤S3中振荡培养时摇床转速为120～160r/min。
6.如权利要求3所述的近玫色锁掷孢酵母的应用，其特征在于，步骤S3中所述共培养发酵培养基的组成为：马铃薯150～200g/L，玉米粉10～20g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，水。
7.如权利要求3所述的近玫色锁掷孢酵母的应用，其特征在于，步骤S1和S2中所述PDB培养基的组成为：马铃薯150～200g/L，葡萄糖10～20g/L，水。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910310799.7A CN110241032B (zh) | 2019-08-09 | 2019-08-09 | 一种近玫色锁掷孢酵母及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910310799.7A CN110241032B (zh) | 2019-08-09 | 2019-08-09 | 一种近玫色锁掷孢酵母及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110241032A CN110241032A (zh) | 2019-09-17 |
| CN110241032B true CN110241032B (zh) | 2021-11-16 |
Family
ID=67883198
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910310799.7A Expired - Fee Related CN110241032B (zh) | 2019-08-09 | 2019-08-09 | 一种近玫色锁掷孢酵母及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110241032B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113355250B (zh) * | 2021-07-21 | 2022-08-23 | 江南大学 | 一种油脂酵母及其培养方法 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1807607A (zh) * | 2006-01-20 | 2006-07-26 | 安徽大学 | 一种真菌共培养发酵生产漆酶的方法 |
| CN101280277A (zh) * | 2008-04-14 | 2008-10-08 | 山东大学 | 一种粗毛栓菌及其培养方法与应用 |
| CN102080046A (zh) * | 2010-09-25 | 2011-06-01 | 江南大学 | 一株高产漆酶菌株及发酵产漆酶的方法 |
| CN102115716A (zh) * | 2010-12-07 | 2011-07-06 | 江南大学 | 锁掷酵母菌株及其应用 |
| CN103087930A (zh) * | 2012-08-29 | 2013-05-08 | 漯河医学高等专科学校 | 一株锁掷孢酵母菌株及其在食品、饲料中的应用 |
| CN105543110A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-05-04 | 河南省科学院生物研究所有限责任公司 | 一种高产漆酶的粗毛栓菌及其应用 |
| CN107523509A (zh) * | 2017-08-29 | 2017-12-29 | 江苏大学 | 一株控制苹果采后青霉病的酵母菌及其应用 |
| EP3263711A1 (en) * | 2016-06-30 | 2018-01-03 | Jiangnan University | A method for improving microbial laccase production |
| CN109055245A (zh) * | 2018-07-19 | 2018-12-21 | 宁波大学 | 一种海洋源锁掷孢酵母及其防控草莓病害的应用 |
| CN109666592A (zh) * | 2018-07-11 | 2019-04-23 | 安徽大学 | 一种真菌漆酶表达菌株及其构建方法和应用 |
| CN109868228A (zh) * | 2019-03-28 | 2019-06-11 | 慕恩（广州）生物科技有限公司 | 一株近玫色锁掷孢酵母及其应用 |
| CN110846231A (zh) * | 2019-12-03 | 2020-02-28 | 安徽农业大学 | 一株高产漆酶真菌毛栓孔菌La-7及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103911295B (zh) * | 2014-03-25 | 2016-06-22 | 山东省科学院能源研究所 | 毛栓菌菌株及其在利用市政脱水污泥生产漆酶中的应用 |
-
2019
- 2019-08-09 CN CN201910310799.7A patent/CN110241032B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1807607A (zh) * | 2006-01-20 | 2006-07-26 | 安徽大学 | 一种真菌共培养发酵生产漆酶的方法 |
| CN101280277A (zh) * | 2008-04-14 | 2008-10-08 | 山东大学 | 一种粗毛栓菌及其培养方法与应用 |
| CN102080046A (zh) * | 2010-09-25 | 2011-06-01 | 江南大学 | 一株高产漆酶菌株及发酵产漆酶的方法 |
| CN102115716A (zh) * | 2010-12-07 | 2011-07-06 | 江南大学 | 锁掷酵母菌株及其应用 |
| CN103087930A (zh) * | 2012-08-29 | 2013-05-08 | 漯河医学高等专科学校 | 一株锁掷孢酵母菌株及其在食品、饲料中的应用 |
| CN105543110A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-05-04 | 河南省科学院生物研究所有限责任公司 | 一种高产漆酶的粗毛栓菌及其应用 |
| EP3263711A1 (en) * | 2016-06-30 | 2018-01-03 | Jiangnan University | A method for improving microbial laccase production |
| CN107523509A (zh) * | 2017-08-29 | 2017-12-29 | 江苏大学 | 一株控制苹果采后青霉病的酵母菌及其应用 |
| CN109666592A (zh) * | 2018-07-11 | 2019-04-23 | 安徽大学 | 一种真菌漆酶表达菌株及其构建方法和应用 |
| CN109055245A (zh) * | 2018-07-19 | 2018-12-21 | 宁波大学 | 一种海洋源锁掷孢酵母及其防控草莓病害的应用 |
| CN109868228A (zh) * | 2019-03-28 | 2019-06-11 | 慕恩（广州）生物科技有限公司 | 一株近玫色锁掷孢酵母及其应用 |
| CN110846231A (zh) * | 2019-12-03 | 2020-02-28 | 安徽农业大学 | 一株高产漆酶真菌毛栓孔菌La-7及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Enhancing laccase production by white-rot fungus trametes hirsuta SSM-3 in co-culture with yeast sporidiobolus pararoseus SSM-8;Jianfen Zhang等;《Jianfen Zhang等》;20190820;第50卷(第1期);第10-17页 * |
| 拟粉红锁掷孢酵母降解展青霉素的蛋白质组学;赵利娜等;《食品与生物技术学报》;20190315(第03期);第10-16页 * |
| 毛栓菌产漆酶条件优化及该酶对合成染料脱色的特性;刘文华等;《微生物学通报》;20130520(第05期);摘要、第728页右列最后一段、第729页左列第3段、第730页左列第2段、第731页左列第1段 * |
| 锁掷酵母产类胡萝卜素在30L发酵罐中培养条件的研究;李海伟等;《中国食品添加剂》;20131015(第05期);第104-108页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110241032A (zh) | 2019-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Elisashvili et al. | Lentinus edodes and Pleurotus species lignocellulolytic enzymes activity in submerged and solid-state fermentation of lignocellulosic wastes of different composition | |
| Elisashvili et al. | Physiological regulation of laccase and manganese peroxidase production by white-rot Basidiomycetes | |
| Desai et al. | Isolation of laccase producing fungi and partial characterization of laccase | |
| CN103352013B (zh) | 木质纤维素降解复合菌系及其应用 | |
| Mata et al. | Changes in lignocellulolytic enzyme activites in six Pleurotus spp. strains cultivated on coffee pulp in confrontation with Trichoderma spp. | |
| CN106978350B (zh) | 一株黑曲霉及其在普洱茶素类化合物的制备中的应用 | |
| CN102796673A (zh) | 一株阿魏酸酯酶生产菌株及应用该菌株生产阿魏酸酯酶的方法 | |
| Illuri et al. | Production, partial purification and characterization of ligninolytic enzymes from selected basidiomycetes mushroom fungi | |
| CN105039171B (zh) | 栓菌及其应用 | |
| Gupta et al. | Effects of wheat straw solid contents in fermentation media on utilization of soluble/insoluble nutrient, fungal growth and laccase production | |
| CN102181370A (zh) | 南海红树林内生真菌bl321 | |
| CN113684139B (zh) | 一种白囊耙齿菌及其筛选方法及在降解林木废弃物的应用 | |
| CN110241032B (zh) | 一种近玫色锁掷孢酵母及其应用 | |
| Balaraju et al. | Production of cellulase and laccase enzymes by Oudemansiella radicata using agro wastes under solid-state and submerged conditions | |
| CN110499254B (zh) | 一种抗盐碱赭曲霉菌株w1及其菌剂和应用 | |
| Teerapatsakul et al. | Physiological regulation of an alkaline-resistant laccase produced by Perenniporia tephropora and efficiency in biotreatment of pulp mill effluent | |
| Javed et al. | Barley bran, a novel agricultural waste for the improved production of an extracellular laccase from a soil-inhabited Penicillium spp. | |
| Kumar et al. | Ligninolytic enzymes production by endophytic fungus Diaporthe phaseolorum (Desm.) Sacc. under the influence of different carbon and nitrogen sources | |
| CN110903994B (zh) | 产高温蛋白酶地衣芽孢杆菌及其应用 | |
| Kham et al. | A Thermotolerant yeast Cyberlindnera rhodanensis DK isolated from Laphet-so capable of extracellular thermostable β-glucosidase production | |
| KR100409027B1 (ko) | 신규한 세라티아 속 미생물, 이의 분리방법 및 이를이용한 리그닌 분해효소의 생산방법 | |
| Du et al. | Effect of synergistic inducement on the production of laccase by a novel Shiraia bambusicola strain GZ11K2 | |
| Wu et al. | Physiological and biochemical responses of in vitro Fusarium oxysporum f. sp. niveum to benzoic acid | |
| CN108277166B (zh) | 一株棘孢木霉及其在铅污染土壤修复中的应用 | |
| CN102703479B (zh) | 6-ggpp合酶、8-倍半萜合酶、截短侧耳素高产菌株及菌株的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20211116 |