CN109666592A - 一种真菌漆酶表达菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

一种真菌漆酶表达菌株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种真菌漆酶表达菌株及其构建方法和应用，通过遗传学手段对漆酶高产菌株—栓菌AH28‑2进行改造，即在该菌株中过表达热激蛋白ThHspA1，改造后的菌株Trametes hirsuta AH28‑2(ThHspA1‑5)可在添加1/10初始剂量诱导剂的条件下使漆酶产量提高2倍，以该菌株生产漆酶具有高效环保等优点。

Description

一种真菌漆酶表达菌株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种真菌漆酶表达菌株及其构建方法和应用。
背景技术
真菌漆酶(laccase，EC1.10.3.2)是一类含铜的多酚氧化酶，广泛分布于高等丝状真菌特别是担子菌中，能够催化数百种酚类和非酚类化合物发生氧化，同时将氧分子还原成水；在小分子介体物质如丁香酸甲酯等的存在下，真菌漆酶的作用底物可进一步拓宽。近年来，随着社会对可持续、环境友好型催化的呼吁和追求，真菌漆酶宽底物谱、以O2为电子受体副产物为H2O等方面的催化优势逐渐体现，对真菌漆酶的研究也因此受到各国科研工作者的广泛关注。目前，真菌漆酶在新型药物合成、生物能源炼制、环境污染物脱毒处理、新型生物传感器研制、工业纺织染料转化等现代生物技术工艺中已展现出重要应用潜力。
通常情况下，野生型真菌的漆酶产量较低。为了提高漆酶产量，通常会加入外界诱导剂以使真菌的漆酶产量提高，常用的诱导剂包括芳香族化合物(愈创木酚、阿魏酸、藜芦醇、邻甲苯胺等)、重金属离子(如Cu2+、Mn2+)以及一些醇类物质(如乙醇、异丙醇)。这些策略在提高漆酶产量的同时，也导致了新的问题，例如上述诱导剂不仅价格昂贵而且有毒性，从而限制了漆酶产业化应用进程。异源表达是提高酶量和进行工业化生产的另一种常用方法。虽然一些真菌漆酶基因已成功实现重组表达，但真菌漆酶的异源表达多存在产量低，发酵周期长且成本高等缺点，难以达到工业化要求。
发明内容
为了克服上述现有技术所存在的问题，本发明旨在提供一种真菌漆酶表达菌株及其构建方法和应用。
本发明通过遗传学手段对本实验室自行筛选分离的一株漆酶高产菌株—栓菌AH28-2进行改造，即在该菌株中过表达热激蛋白ThHspA1，改造后获得菌株Trameteshirsuta AH28-2 (ThHspA1-5)可以在添加1/10初始剂量诱导剂的条件下使漆酶产量提高2倍，以该菌株生产漆酶具有高效环保等优点。
所述栓菌AH28-2的分类命名为：Trametes sp.AH28-2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2005年11月29日，保藏编号：CCTCC NO： M205134。
本发明真菌漆酶表达菌株Trametes hirsuta AH28-2(ThHspA1-5)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2018年6月12日，保藏编号：CCTCC NO：M 2018329。
本发明真菌漆酶表达菌株的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：ThHspA1过表达载体的构建
1a、从栓菌AH28-2菌株提取基因组DNA，然后以获得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列；
通过Primer 5设计扩增ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列的PCR 特异引物序列如下：
HspA1-F：CGCGATATCATGACGACGACTGCAGACAGCG；
HspA1-R：ATTGGGCCCGAACTGTACCCGGTCGCGCA；
ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列的PCR扩增体系如下，总体系为 50μL。
PCR扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共 25个循环，最后72℃延伸10min，产物用1％琼脂糖凝胶进行检测，将目标序列采用1％琼脂糖凝胶纯化后备用；
1b、将制得的ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列与pEASY-T3载体进行连接后转化E.coli Trans1-T1感受态细胞，并将筛选获得的阳性克隆送测序公司进行测序，测序正确后进行下一步实验；
目标片段与pEASY-T3载体的连接：
将30ng回收产物中加入10ng pEASY-T3载体，总体积5μL，吹吸均匀，置于室温(25℃) 反应15min后立即置于冰上。
pEASY-T3-ThHspA1重组质粒的转化：
1)从-70℃冰箱中取出100μL E.coli Trans5α感受态细胞，立即置于冰上；
2)待感受态细胞刚刚融化，将连接产物迅速加入感受态细胞中，轻弹混匀，于冰上放置30min；
3)42℃热激30s，立即置于冰上放置5min；
4)加入500μL LB培养基，37℃，200r/min摇床温育1h，使感受态细胞复苏；
5)将步骤4)温育产物1500r/min离心1min，吸去大部分LB后将菌体重悬，将转化产物均匀涂于含Amp抗性及IPTG和X-gal的筛选平板上，37℃过夜培养。
筛选与鉴定阳性重组子：
1)根据蓝白斑筛选方法，挑白色克隆于5mL含Amp抗性的LB培养基的试管中，37℃培养8h。
2)按照Axygen质粒小量制备试剂盒的说明书抽提菌液质粒，以质粒为模板进行PCR，鉴定是否阳性克隆，质粒PCR体系及条件同ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列的获得方法，将获得的阳性克隆进行测序。
1c、利用限制性内切酶EcoR V和Apa I对将测序正确的pEASY-T3-ThHspA1质粒及实验室自行构建的质粒pCR-ZM(含hph表达框)重组质粒进行酶切，并将酶切产物回收连接，制得重组质粒pCR-ZM-ThHspA1；将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞进行增值，获得足量pCR-ZM-ThHspA1重组质粒。
pEASY-T3-ThHspA1质粒及pCR-ZM(含hph表达框)质粒的酶切体系及条件：
酶切条件为37℃、2h。
ThHspA1片段与pCR-ZM(含hph表达框)质粒的连接体系及条件：
将上述各组分轻轻混匀，置于16℃连接15-18h后转化到E.coli TOP 10感受态细胞中，并筛选阳性克隆，转化及阳性克隆筛选方法同(2)。
步骤2：ThHspA1过表达菌株的构建及筛选
将获得的过表达质粒pCR-ZM-ThHspA1采用PEG/CaCl2方法转化进入菌株Trameteshirsuta AH28-2的原生质体，经再生、初筛、复筛，制得过表达ThHspA1基因的菌株Trameteshirsuta AH28-2(ThHspA1-5)。
2a、Trametes hirsuta AH28-2菌丝体的收集
取三块菌丝长势较好的培养板，加入2-3mL的无菌水收集表面的菌丝体，通过自制过滤器过滤上清，重复3次后，将滤液于室温条件下2600g离心2min，弃上清，利用2mL MM 缓冲液将孢子浓缩分装至5mL EP管中并计数，使孢子的浓度达到108cells/mL。
2b、Trametes hirsuta AH28-2原生质体的制备
室温条件下，加入4mL MM缓冲液洗涤重悬孢子，2600g离心5min后弃上清；加入2mL终浓度为0.03g/mL的溶壁酶对孢子进行酶解，37℃条件下酶解4-5h，每隔1h采用显微镜观察酶解情况，当原生质体的生成率达到50-70％时酶解完成；立即添加2mL MMC缓冲液终止反应，640g离心10min，弃上清，加入200-500μL MMC缓冲液使原生质体的密度达到0.2-2×108cells/mL左右。
2c、Trametes hirsuta AH28-2原生质体的转化
制备pCR-ZM-ThHspA1的新鲜质粒，在2mL的无菌EP管中加入1μL(1μg/μL)的新鲜质粒、50μL的Trametes hirsuta AH28-2原生质体及12.5μL的PEG/CaCl2溶液，对照组中 PEG/CaCl2溶液代替质粒，用轻轻混匀后冰浴20min；添加500μL的PEG/CaCl2溶液，轻轻混匀，室温孵育5min；添加1mL STC缓冲液后，取300-500μL轻轻涂布于每个再生培养基平板上，置于28℃培养箱中进行培养，24h后添加含有300μg/mL潮霉素的再生培养基覆盖层，置于28℃培养箱中培养，定时观察平板上菌落的生长情况。
2d、Trametes hirsuta AH28-2阳性转化子的筛选
1)阳性转化子的潮霉素筛选
将上述筛选固体培养基中长出的菌落转移到含有300μg/mL潮霉素的复筛再生培养基中进行复筛，转接2-3次后，将仍让可在含有300μg/mL潮霉素的复筛再生培养基上生长的菌落转接于PDA培养基斜面，4℃条件下保藏备用。
2)阳性转化子的PCR筛选
提取菌株Trametes hirsuta AH28-2及潮霉素筛选的转化子的基因组DNA，设计引物扩增潮霉素的编码基因hph，所述PCR筛选的引物序列如下：
hph-P1:ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG；
hph-P2:CTATTCCTTTGCCCTCGGAC；
潮霉素的编码基因hph的PCR扩增体系如下，总体系为20μL。
PCR扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共 25个循环，最后72℃延伸10min，产物用1％琼脂糖凝胶进行检测。能扩增出hph的转化子，说明过表达质粒已成功转入。
3)阳性转化子的RT-PCR筛选
提取野生型菌株Trametes hirsuta AH28-2和PCR筛选的阳性转化子的RNA，测定其纯度和浓度；提取Trametes hirsuta AH28-2和转化子的RNA的方法参考TaKaRa的RNAisoPlus (Total RNA提取试剂)说明书进行操作，按照TaKaRa的PrimesCripTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser试剂盒的操作说明对RNA进行DNA的去除和反转录，根据测定的RNA样品的浓度，依照试剂盒说明书去除样品中的DNA，反应体系为10μL，每个体系加入0.8ug总RNA，42℃温育5min。将去除DNA的RNA样品依照试剂盒说明书进行反转录，反应体系为20μL， 37℃温育15min，85℃反应55s。将反转录获得的cDNA保存于-20℃备用。
将获取的cDNA进行qRT-PCR扩增，gapdh作为内参基因，设计qRT-PCR引物序列如下：
lacA-qF:TTCCAGTCTCTGCTCGCC；
lacA-qR:CTGACGAGCGAACCCATC；
gapdh-qF1:GCCGCTTCAAGGGCAAAGTC；
gapdh-qF2:TGTAGTCGGCACCAACGGA；
qRT-PCR扩增体系如下，总体系为20μL。
PCR扩增条件为95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火20s，40个循环。按照TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒进行qRT-PCR分析，PCR仪为Roche公司的LightCycler96，数据分析采用LC96SW1.1软件。qRT-PCR扩增反应结束后，65℃-95℃熔解曲线分析。T.hirsuta AH28-2转化子的ThHspA1转录水平显著高于野生型，说明构建的过表达载体在转化菌株中发挥作用，则可确认阳性转化子并进行后续实验。
本发明真菌漆酶表达菌株的应用，是以本发明真菌漆酶表达菌株发酵制备漆酶，包括如下步骤：
将构建的ThHspA1过表达菌株Trametes hirsuta AH28-2(ThHspA1-5)接种于PDA培养基平板进行活化，即在保藏斜面上取直径0.5cm的菌丝块，接种于PDA培养基平板中心位置，置于28℃恒温培养，待菌丝边缘生长至距培养皿边缘1cm时(约需5-7天)，活化完成；在活化好的平板上取6块直径0.5cm的菌丝块，接种于100mL的纤维二糖-天冬酰胺液体培养基中(250mL容器)，于28℃、120rpm的摇床中进行摇瓶培养，培养96h后匀浆2次(3000 rpm、5s)，按照5％的接种量(体积比)接种到400mL纤维二糖-天冬酰胺液体培养基中(1000 mL容器)，于28℃、120rpm条件下进行液体发酵，在漆酶酶活达到最高时(约培养96-108 h)通过离心去除菌体的方法制得发酵液，然后经超滤浓缩、离子交换或分子筛等纯化方法制得漆酶。
所述PDA培养基以500mL计，配方如下：10g葡萄糖，1.5g KH2PO4，0.75g MgSO4·7H2O， 20mg VB1，7.5g琼脂，10％土豆滤出液(取100g去皮土豆切块，加400mL蒸馏水煮沸，沸后保持30min，过滤取汁，即制得10％土豆滤出液)，定容至500mL，115℃，高压灭菌30 min。
所述纤维二糖-天冬酰胺液体培养基以500mL计，配方如下：0.5g蛋白胨，7.5g纤维二糖，0.05g Na2HPO4·12H2O，0.05g KH2PO4，0.75g L-天冬酰胺，0.005g FeSO4·7H2O，0.005g CaCl2，25μg VB1，0.001g CuSO4，0.014g腺嘌呤，定容至500mL，115℃高压灭菌30min。
本发明首次通过将ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列插入实验室自行构建的载体pCR-ZM中，并转化栓菌T.hirsuta AH28-2菌株的原生质体，制得可以稳定传代的过表达ThHspA1基因的漆酶高产菌株。
本发明构建的过表达ThHspA1的栓菌Trametes hirsuta AH28-2(ThHspA1-5)菌株能够显著提高漆酶的产量，在添加微量芳香化合物诱导的条件下，使漆酶的产量提高了2倍，有助于栓菌Trametes hirsuta AH28-2(ThHspA1-5)漆酶的工业化应用。
附图说明
图1是ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列电泳图。
图2是ThHspA1过表达菌株中漆酶lacA的转录情况。
图3是ThHspA1过表达菌株中漆酶lacB的转录情况。
图4是过表达菌株及野生型菌株漆酶总活力的变化(左)及同工酶谱的变化(右)。
具体实施方式
本发明通过遗传学手段对本实验室自行筛选分离的一株漆酶高产菌株—栓菌AH28-2进行改造，即在该菌株中过表达热激蛋白ThHspA1，改造后获得菌株Trameteshirsuta AH28-2 (ThHspA1-5)可以在添加1/10初始剂量诱导剂的条件下使漆酶产量提高2倍，以该菌株生产漆酶具有高效环保等优点。
所述栓菌AH28-2的分类命名为：Trametes sp.AH28-2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2005年11月29日，保藏编号：CCTCC NO： M205134。
本发明真菌漆酶表达菌株Trametes hirsuta AH28-2(ThHspA1-5)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2018年6月12日，保藏编号：CCTCC NO：M 2018329。
本发明真菌漆酶表达菌株的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：ThHspA1过表达载体的构建
1a、从栓菌AH28-2菌株提取基因组DNA，然后以获得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列；PCR扩增ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列如图1所示。
通过Primer 5设计扩增ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列的PCR 特异引物序列如下：
HspA1-F：CGCGATATCATGACGACGACTGCAGACAGCG；
HspA1-R：ATTGGGCCCGAACTGTACCCGGTCGCGCA；
ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列的PCR扩增体系如下，总体系为 50μL。
PCR扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共 25个循环，最后72℃延伸10min，产物用1％琼脂糖凝胶进行检测，将目标序列采用1％琼脂糖凝胶纯化后备用；
1b、将制得的ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列与pEASY-T3载体进行连接后转化E.coli Trans1-T1感受态细胞，并将筛选获得的阳性克隆送测序公司进行测序，测序正确后进行下一步实验；
目标片段与pEASY-T3载体的连接：
将30ng回收产物中加入10ng pEASY-T3载体，总体积5μL，吹吸均匀，置于室温(25℃) 反应15min后立即置于冰上。
pEASY-T3-ThHspA1重组质粒的转化：
1)从-70℃冰箱中取出100μL E.coli Trans5α感受态细胞，立即置于冰上；
2)待感受态细胞刚刚融化，将连接产物迅速加入感受态细胞中，轻弹混匀，于冰上放置 30min；
3)42℃热激30s，立即置于冰上放置5min；
4)加入500μL LB培养基，37℃，200r/min摇床温育1h，使感受态细胞复苏；
5)将步骤4)温育产物1500r/min离心1min，吸去大部分LB后将菌体重悬，将转化产物均匀涂于含Amp抗性及IPTG和X-gal的筛选平板上，37℃过夜培养。
筛选与鉴定阳性重组子：
1)根据蓝白斑筛选方法，挑白色克隆于5mL含Amp抗性的LB培养基的试管中，37℃培养8h。
2)按照Axygen质粒小量制备试剂盒的说明书抽提菌液质粒，以质粒为模板进行PCR，鉴定是否阳性克隆，质粒PCR体系及条件同ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列的获得方法，将获得的阳性克隆进行测序。
1c、利用限制性内切酶EcoR V和Apa I对将测序正确的pEASY-T3-ThHspA1质粒及实验室自行构建的质粒pCR-ZM(含hph表达框)重组质粒进行酶切，并将酶切产物回收连接，制得重组质粒pCR-ZM-ThHspA1；将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞进行增值，获得足量pCR-ZM-ThHspA1重组质粒。
pEASY-T3-ThHspA1质粒及pCR-ZM(含hph表达框)质粒的酶切体系及条件：
酶切条件为37℃、2h。
ThHspA1片段与pCR-ZM(含hph表达框)质粒的连接体系及条件：
将上述各组分轻轻混匀，置于16℃连接15-18h后转化到E.coli TOP 10感受态细胞中，并筛选阳性克隆，转化及阳性克隆筛选方法同(2)。
步骤2：ThHspA1过表达菌株的构建及筛选
将获得的过表达质粒pCR-ZM-ThHspA1采用PEG/CaCl2方法转化进入菌株Trameteshirsuta AH28-2的原生质体，经再生、初筛、复筛，制得过表达ThHspA1的菌株Trameteshirsuta AH28-2(ThHspA1-5)。
2a、Trametes hirsuta AH28-2菌丝体的收集
取三块菌丝长势较好的平板，加入2-3mL的无菌水收集表面的菌丝体，通过自制过滤器过滤上清，重复3次后，将滤液于室温条件下2600g离心2min，弃上清，利用2mL MM缓冲液将孢子浓缩分装至5mL EP管中并计数，使孢子的浓度达到108cells/mL。
2b、Trametes hirsuta AH28-2原生质体的制备
室温条件下，加入4mL MM缓冲液洗涤重悬孢子，2600g离心5min后弃上清；加入2mL终浓度为0.03g/mL的溶壁酶对孢子进行酶解，37℃条件下酶解4-5h，每隔1h采用显微镜观察酶解情况，当原生质体的生成率达到50-70％时酶解完成；立即添加2mL MMC缓冲液终止反应，640g离心10min，弃上清，加入200-500μL MMC缓冲液使原生质体的密度达到0.2-2×108cells/mL左右。
2c、Trametes hirsuta AH28-2原生质体的转化
制备pCR-ZM-ThHspA1的新鲜质粒，在2mL的无菌EP管中加入1μL(1μg/μL)的新鲜质粒、50μL的Trametes hirsuta AH28-2原生质体及12.5μL的PEG/CaCl2溶液，对照组中 PEG/CaCl2溶液代替质粒，用轻轻混匀后冰浴20min；添加500μL的PEG/CaCl2溶液，轻轻混匀，室温孵育5min；添加1mL STC缓冲液后，取300-500μL轻轻涂布于每个再生培养基平板上，置于28℃培养箱中进行培养，24h后添加含有300μg/mL潮霉素的再生培养基覆盖层，置于28℃培养箱中培养，定时观察平板上菌落的生长情况。
2d、Trametes hirsuta AH28-2阳性转化子的筛选
1)阳性转化子的潮霉素筛选
将上述筛选固体培养基中长出的菌落转移到含有300μg/mL潮霉素的复筛再生培养基中进行复筛，转接2-3次后，将仍让可在含有300μg/mL潮霉素的复筛再生培养基上生长的菌落转接于PDA培养基斜面，4℃条件下保藏备用。
2)阳性转化子的PCR筛选
提取菌株Trametes hirsuta AH28-2及潮霉素筛选的转化子的基因组DNA，设计引物扩增潮霉素的编码基因hph，所述PCR筛选的引物序列如下：
hph-P1:ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG；
hph-P2:CTATTCCTTTGCCCTCGGAC；
潮霉素的编码基因hph的PCR扩增体系如下，总体系为20μL。
PCR扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共 25个循环，最后72℃延伸10min，产物用1％琼脂糖凝胶进行检测。能扩增出hph的转化子，说明过表达质粒已成功转入。
3)阳性转化子的RT-PCR筛选
提取野生型菌株Trametes hirsuta AH28-2和PCR筛选的阳性转化子的RNA，测定其纯度和浓度；提取Trametes hirsuta AH28-2和转化子的RNA的方法参考TaKaRa的RNAisoPlus (Total RNA提取试剂)说明书进行操作，按照TaKaRa的PrimesCripTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser试剂盒的操作说明对RNA进行DNA的去除和反转录，根据测定的RNA样品的浓度，依照试剂盒说明书去除样品中的DNA，反应体系为10μL，每个体系加入0.8ug总RNA，42℃温育5min。将去除DNA的RNA样品依照试剂盒说明书进行反转录，反应体系为20μL， 37℃温育15min，85℃反应55s。将反转录获得的cDNA保存于-20℃备用。
将获取的cDNA进行qRT-PCR扩增，gapdh基因作为内参基因，设计qRT-PCR引物序列如下：
lacA-qF:TTCCAGTCTCTGCTCGCC；
lacA-qR:CTGACGAGCGAACCCATC；
gapdh-qF1:GCCGCTTCAAGGGCAAAGTC；
gapdh-qF2:TGTAGTCGGCACCAACGGA；
qRT-PCR扩增体系如下，总体系为20μL。
PCR扩增条件为95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火20s，40个循环。按照TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒进行qRT-PCR分析，PCR仪为Roche公司的LightCycler96，数据分析采用LC96SW1.1软件。qRT-PCR扩增反应结束后，65℃-95℃熔解曲线分析。T.hirsuta AH28-2转化子的ThHspA1转录水平显著高于野生型，说明构建的过表达载体在转化菌株中发挥作用，则可确认阳性转化子并进行后续实验。
本发明真菌漆酶表达菌株的应用，是以本发明真菌漆酶表达菌株发酵制备漆酶，包括如下步骤：
将构建的ThHspA1过表达菌株Trametes hirsuta AH28-2(ThHspA1-5)接种于PDA培养基平板进行活化，即在保藏斜面上取直径0.5cm的菌丝块，接种于PDA培养基平板中心位置，置于28℃恒温培养，待菌丝边缘生长至距培养皿边缘1cm时(约需5-7天)，活化完成；在活化好的平板上取6块直径0.5cm的菌丝块，接种于100mL的纤维二糖-天冬酰胺液体培养基中(250mL容器)，于28℃、120rpm的摇床中进行摇瓶培养，培养96h后匀浆2次(3000 rpm、5s)，按照5％的接种量(体积比)接种到400mL纤维二糖-天冬酰胺液体培养基中(1000 mL容器)，于28℃、120rpm条件下进行液体发酵，在漆酶酶活达到最高时(约培养96-108 h)通过离心去除菌体的方法制得发酵液，然后经超滤浓缩、离子交换或分子筛等纯化方法制得漆酶。
所述PDA培养基以500mL计，配方如下：10g葡萄糖，1.5g KH2PO4，0.75g MgSO4·7H2O， 20mg VB1，7.5g琼脂，10％土豆滤出液，定容至500mL，115℃，高压灭菌30min。
所述纤维二糖-天冬酰胺人工液体培养基以500mL计，配方如下：0.5g蛋白胨，7.5g纤维二糖，0.05g Na2HPO4·12H2O，0.05g KH2PO4，0.75g L-天冬酰胺，0.005g FeSO4·7H2O，0.005g CaCl2，25μg VB1，0.001g CuSO4，0.014g腺嘌呤，定容至500mL，115℃高压灭菌30min。
ThHspA1过表达菌株ThHspA1-5中漆酶基因lacA的转录水平较野生型增加约1.8倍(如图2)，另一漆酶同工酶lacB的转录水平也有上升，但是上升不显著(如图3)。在T.hirsuta AH28-2液态发酵培养4d后，加入邻甲苯胺诱导野生株和过表达株漆酶表达，以不添加化合物的菌株为空白对照。在菌株培养的第0、12h、24h、……、96h、108h等时间点，测定漆酶表达活力及同工酶谱，结果见图4。
本发明首次通过将ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列插入实验室自行构建的载体pCR-ZM中，并转化栓菌T.hirsuta AH28-2菌株的原生质体，制得可以稳定传代的过表达ThHspA1的漆酶高产菌株。

Claims (9)

1.一种真菌漆酶表达菌株，其特征在于：是在栓菌AH28-2中过表达热激蛋白ThHspA1后获得的菌株Trametes hirsuta AH28-2(ThHspA1-5)。
2.根据权利要求1所述的真菌漆酶表达菌株，其特征在于：
所述真菌漆酶表达菌株的分类命名为：Trametes hirsuta AH28-2(ThHspA1-5)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2018年6月12日，保藏编号：CCTCC NO：M 2018329。
3.根据权利要求1所述的真菌漆酶表达菌株，其特征在于：
所述栓菌AH28-2的分类命名为：Trametes sp.AH28-2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2015年11月29日，保藏编号：CCTCC NO：M205134。
4.一种权利要求1-3中任一种真菌漆酶表达菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：ThHspA1过表达载体的构建
1a、从栓菌AH28-2菌株提取基因组DNA，然后以获得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列；
通过Primer 5设计扩增ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列的PCR特异引物序列如下：
HspA1-F：CGCGATATCATGACGACGACTGCAGACAGCG；
HspA1-R：ATTGGGCCCGAACTGTACCCGGTCGCGCA；
1b、将制得的ThHspA1的上游调控区序列、ORF区序列及终止子序列与pEASY-T3载体进行连接后转化E.coli Trans1-T1感受态细胞，并将筛选获得的阳性克隆送测序公司进行测序，测序正确后进行下一步实验；
1c、利用限制性内切酶EcoR V和Apa I对将测序正确的pEASY-T3-ThHspA1质粒及实验室自行构建的质粒pCR-ZM重组质粒进行酶切，并将酶切产物回收连接，制得重组质粒pCR-ZM-ThHspA1；将该重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞进行增值，获得足量pCR-ZM-ThHspA1重组质粒；
步骤2：ThHspA1过表达菌株的构建及筛选
将获得的过表达质粒pCR-ZM-ThHspA1采用PEG/CaCl2方法转化进入菌株Trameteshirsuta AH28-2的原生质体，经再生、初筛、复筛，制得过表达ThHspA1的菌株Trameteshirsuta AH28-2(ThHspA1-5)。
5.一种权利要求1-3中任一种真菌漆酶表达菌株的应用，其特征在于：是以所述真菌漆酶表达菌株发酵制备漆酶。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于包括如下步骤：
将构建的真菌漆酶表达菌株接种于PDA培养基平板进行活化，即在保藏斜面上取直径0.5cm的菌丝块，接种于PDA培养基平板中心位置，置于28℃恒温培养，待菌丝边缘生长至距培养皿边缘1cm时，活化完成；在活化好的平板上取6块直径0.5cm的菌丝块，接种于100mL的纤维二糖-天冬酰胺液体培养基中，于28℃、120rpm的摇床中进行摇瓶培养，培养96h后匀浆2次，接种到400mL纤维二糖-天冬酰胺液体培养基中，于28℃、120rpm条件下进行液体发酵培养，培养96-108h后通过离心去除菌体的方法制得发酵液，纯化后获得漆酶。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述PDA培养基以500mL计，配方如下：10g葡萄糖，1.5g KH2PO4，0.75g MgSO4·7H2O，20mg VB1，7.5g琼脂，10％土豆滤出液，定容至500mL，115℃，高压灭菌30min。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述纤维二糖-天冬酰胺液体培养基以500mL计，配方如下：0.5g蛋白胨，7.5g纤维二糖，0.05g Na2HPO4·12H2O，0.05g KH2PO4，0.75g L-天冬酰胺，0.005g FeSO4·7H2O，0.005gCaCl2，25μg VB1，0.001g CuSO4，0.014g腺嘌呤，定容至500mL，115℃高压灭菌30min。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
接种到400mL纤维二糖-天冬酰胺液体培养基中的接种量按体积比为5％。
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