CN101230363B - 一种利用重组菌株不对称转化制备(r)-苯基乙二醇的方法 - Google Patents
一种利用重组菌株不对称转化制备(r)-苯基乙二醇的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种利用重组菌株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明将(R)-专一性醇脱氢酶基因rcr插入载体pET21c中构建重组质粒pET-RCR，转化入大肠杆菌构建重组菌株E.coli BL21/pET-RCR。该重组菌株具有催化不对称转化2-羟基苯乙酮为(R)-苯基乙二醇的能力。通过优化反应条件，在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中添加2.5％～10％异丙醇作为辅助底物，利用0.1～0.4g/mL重组细胞对浓度为0.5～5g/L底物2-羟基苯乙酮催化转化48h，最终得到光学纯度为80～100％e.e.，产率为70～100％的产物(R)-苯基乙二醇。本发明不仅为制备(R)-苯基乙二醇提供了有效途径，对于今后手性转化用生物催化剂的开发具有较为重要的意义。
Description
技术领域
一种利用重组菌株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。
背景技术
苯基乙二醇的化学结构为：
光学纯(R)-苯基乙二醇不仅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂，而且已成为制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体，开展苯基乙二醇拆分方法的研究极有意义。
手性化合物在人们生活中具有重要作用，由于两个对映体在药理、毒理及功能作用等各方面均有所不同，因此，制备光学纯的手性模块化合物在医药、农业、材料以及环保等领域都具有重要的意义。
由于苯基乙二醇结构中含有两个羟基，利用化学法制备光学纯苯基乙二醇需对羟基选择性保护，易生成其他衍生物，拆分难度较大，反应中所添加的手性催化剂和保护剂具有毒性，会对环境造成危害，因此利用生物法转化光学纯苯基乙二醇就成为研究的热点。
目前，国际上拆分外消旋化合物常见方法主要包括：化学拆分法，色谱拆分法，液体膜拆分法或手性固体膜拆分的膜拆分法，和生物法。
利用生物法转化制备光学纯的手性化合物具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，并能完成一些化学合成难以进行的反应等优点。合成光学活性物质的生物转化反应大致可分为两类：一类是把外消旋体拆分为两个具有光学活性的对映体；另一类是从外消旋或前手性的前体出发，通过催化反应得到不对称的光学活性产物。
90年代起国际上对微生物及酶拆分手性化合物进行大量的研究。酶由L-氨基酸构成，其活性中心构成了一个不对称环境，有利于对消旋体的识别，是一种高度手性的催化剂。其催化效率高，有较强的专一性。酶促拆分消旋体是比较理想的选择。利用完整细胞对外消旋化合物进行转化，可以获得光学纯对映体，在非水相及有机-水双相反应体系中，也可酶促转化制备光学纯化合物。
据报道，目前生物法制备(R)-苯基乙二醇的方法主要包括：
Manzocchi等利用Bakers’酵母不对称还原2-羟基苯乙酮得到(R)-苯基乙二醇，产物光学纯度92％，产率85％，但底物浓度只有0.6g/L。
Cao等利用环氧化物水解酶催化水解外消旋苯乙烯氧化物得到(R)-苯基乙二醇，但底物浓度只有0.6g/L。
Lee等利用萘双氧化酶(NDO)选择性氧化苯乙烯，但所得产品光学纯度较低，仅为78.6％e.e.且底物浓度只有0.125mM。
在利用生物法制备(R)-苯基乙二醇的方法中，通常采用野生型微生物菌体或酶作为催化剂，而利用重组菌株催化不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法的报道很少，聂尧等【化工进展 2006年第25卷第10期1231-1236，“重组大肠杆菌不对称还原2-羟基苯乙酮合成(R)-苯基乙二醇”】曾利用重组大肠杆菌转化制备(R)-苯基乙二醇，但重组细胞用量较多，未采用辅助底物。
发明内容
(1)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种利用重组菌株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法。本发明目的不仅仅在于构建一种不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的重组菌株，并将该重组菌株应用于不对称还原2-羟基苯乙酮制备光学活性苯基乙二醇的反应中，以获得高光学纯度的(R)-苯基乙二醇，尤其是通过采用添加辅助底物的手段降低重组细胞用量，提高转化效果，而且通过将醇脱氢酶基因rcr重组表达，开发该基因的新功能，获得具有新型催化功能的酶蛋白，进而探索立体选择性氧化还原酶的分子催化机理。
(2)技术方案
一种利用重组菌株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法：添加异丙醇作为辅酶再生的辅助底物，以降低重组菌株细胞用量，反应过程为：利用重组菌株E.coli BL21/pET-RCR为出发菌株，经过菌体的培养，以2-羟基苯乙酮为底物，添加异丙醇作为辅酶再生的辅助底物，进行微生物细胞的催化不对称转化反应：在1mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH6.0～8.0)或Tris-HCl缓冲液(pH8.0～9.0)中，细胞浓度为0.1～0.4g/mL，底物浓度为0.5～5g/L，异丙醇体积浓度为2.5％～10％，反应温度30℃，反应时间48小时。
一、基因rcr的获得
近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011培养基：葡萄糖4％，酵母膏0.5％，(NH4)2HPO4 1.3％，KH2PO4 0.7％，ZnSO4.7H2O 0.03％，NaCl 0.01％，pH7.0。
将近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011菌种接种于培养基装液量为20％的250mL摇瓶中于30℃、150rpm振荡培养48h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System(VIOGENE公司)提取基因组。
合成引物1：5′-ATCGATCGCATATGTCAATTCCATCAAGCCAGTAC-3′，引物2：5′-TGACTCTCGAGTGGATTAAAAACAACTCTACCTTC-3′。引物1含有NdeI限制性酶切位点，引物2含有XhoI限制性酶切位点。
PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，dNTP(25mmol/L)0.5μL，引物1(50pmol/μL)1μL，引物2(50pmol/μL)1μL，基因组DNA 5μL，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.5μL。
PCR反应过程如下：94℃预变性5min；94℃ 1min，57℃ lmin，72℃1min，进行30个循环；72℃延伸10min。
利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。
DNA溶液中加入1/10体积的乙酸钠溶液(3mol/L，pH5.2)和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1h。12,000rpm于4℃离心30min。加入75％乙醇500μL洗涤，12,000rpm于4℃离心30min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或-20℃保存。
二、含有基因rcr的重组大肠杆菌构建
目的基因及质粒pET-21c的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pET-21c。
按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37℃水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。
反应体系组成：10×H Buffer 4μL，DNA 10μL，NdeI 2μL，XhoI 2μL，ddH2O将体系补足40μL。
目的基因与质粒pET-21c的连接
将外源基因与质粒pET-21c连接，反应体系组成如下：质粒pET-21c 0.8μL，外源基因4.2μL，Ligation Solution 5μL，ddH2O将体系补足10μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接12-16h。
重组质粒转化大肠杆菌
在每管的100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。每管中加入700μL LB液体培养基，37℃ 100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000rpm离心2min，弃上清600μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养。
将rcr基因片断插入载体pET 21c构建重组质粒pET-RCR，重组质粒转化感受态大肠杆菌E.coli BL21细胞，通过含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选目的重组菌株E.coli BL21/pET-RCR。
诱导表达培养
LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素(50μg/mL)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。
挑取重组菌株的阳性克隆单菌落接种于3mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。取1mL培养液转接于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600约为0.6-0.8后，向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度0～1mmol/L，在培养温度30～37℃下进行诱导培养。
三、重组菌株催化不对称转化制备(R)-苯基乙二醇
利用重组大肠杆菌催化不对称还原反应。
LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素(50μg/mL)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。
挑取重组菌株的阳性克隆单菌落接种于3mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。取1mL培养液转接于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于30℃，200rpm振荡培养12h。
培养后的重组大肠杆菌细胞10,000rpm离心10min并用生理盐水洗涤三次后收集。在1mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.0～8.0)或Tris-HCl缓冲液(pH8.0～9.0)中，分别加入0.5～5g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1～0.4g/mL重组大肠杆菌湿菌体，和辅助底物异丙醇2.5％～10％，混匀后在30～37℃恒温摇床上振荡反应48小时。
反应结束后，将反应混合物离心除去菌体，上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HP1100)进行分析，条件为Chiralcel OB-H柱(4.6mm×25cm；Daicel Chemical Ind.，Ltd.，Japan)，流动相为正己烷/异丙醇(9/1)，流速0.5mL/min，检测波长为215nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。
产物(R)-苯基乙二醇对映过量值的计算：
对映过量值(e.e.％)＝[(CR-CS)/(CR+CS)]×100％
产物(R)-苯基乙二醇产率的计算：产率(％)＝CR/C0×100％
式中CR为反应后(R)-对映体的浓度，CS为反应后(S)-对映体的浓度，C0为反应前底物2-羟基苯乙酮的浓度。转化后得到产物(R)-苯基乙二醇，光学纯度为80～100％e.e.，产率为70～100％。
(3)有益效果
成功克隆了(R)-专一性醇脱氢酶结构基因rcr(GenBank登记号DQ295067)，该基因全长1011bp，编码336个氨基酸残基。
将基因rcr插入表达载体pET21c中并转化入相应表达宿主E.coli BL21(DE3)中成功构建带有目的基因的重组菌株E.coli BL21/pET-RCR。
重组菌E.coli BL21/pET-RCR全细胞催化转化2-羟基苯乙酮在反应48h效果最好，反应体系在pH8-9的偏碱性环境中有利于转化进行，提高体系中的细胞量可以在一定程度上促进转化反应，反应中添加异丙醇用于底物耦联辅酶再生能够在原有基础上改善转化效果。
通过优化反应体系和反应条件，在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中添加5％异丙醇作为辅助底物，利用0.15g/mL重组细胞对5g/L底物2-羟基苯乙酮催化转化48h，最终可得到光学纯度95.5％e.e.、产率92.6％的产物(R)-苯基乙二醇。这些工作不仅为(R)-苯基乙二醇的获得提供了有效途径，而且有助于从分子水平上认识功能性酶蛋白的立体选择性，对于今后手性转化用生物催化剂的开发具有较为重要的意义。
生物材料样品：近平滑假丝酵母，保藏日期2003年3月1日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心CCTCC，菌株编号：M203011。该菌株已在中国专利CN 1212403 C公告。
具体实施方式
实施例1
诱导表达培养：LB培养基组成为胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素(50μg/mL)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。挑取阳性克隆单菌落接种于3mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。取1mL培养液转接于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600约为0.6向培养物中加入诱导物IPTG 0mmol/L，在培养温度30℃下进行诱导培养。
实施例2
诱导表达培养：LB培养基组成同实施例1。挑取阳性克隆单菌落接种于3mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。取1mL培养液转接于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG 1mmol/L，在培养温度37℃下进行诱导培养。
实施例3
在1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，分别加入1g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，和辅助底物异丙醇2.5％，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48小时。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度86.2％e.e.，产率81.4％。
实施例4
在1mL 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)中，分别加入1g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，和辅助底物异丙醇2.5％，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48小时。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度81.5％e.e.，产率72.1％。
实施例5
在1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH9.0)中，分别加入1g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，和辅助底物异丙醇2.5％，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48小时。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度82.8％e.e.，产率75.2％。
实施例6
在1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，分别加入0.5g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，和辅助底物异丙醇2.5％，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48小时。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度93.5％e.e.，产率86.3％。
实施例7
在1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，和辅助底物异丙醇2.5％，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48小时。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度80.6％e.e.，产率71.3％。
实施例8在1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，分别加入1g/L底物2-羟基苯乙酮，0.4g/mL重组大肠杆菌湿菌体，和辅助底物异丙醇2.5％，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48小时。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度88.5％e.e.，产率82.0％。
实施例9在1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，分别加入1g/L底物2-羟基苯乙酮，0.1g/mL重组大肠杆菌湿菌体，和辅助底物异丙醇10％，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48小时。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度81.9％e.e.，产率73.9％。
实施例10在1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，分别加入5g/L底物2-羟基苯乙酮，0.15g/mL重组大肠杆菌湿菌体，和辅助底物异丙醇5％，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48小时。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度95.5％e.e.，产率92.6％。
Claims (1)
1.一种利用重组菌株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法，其特征是添加异丙醇作为辅酶再生的辅助底物，以降低重组菌株细胞用量，反应过程为：利用重组菌株E.coli BL21/pET-RCR为出发菌株，经过菌体的培养，以2-羟基苯乙酮为底物，添加异丙醇作为辅酶再生的辅助底物，进行微生物细胞的催化不对称转化反应：在1mL 0.1mol/L pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或pH 8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液中，细胞浓度为0.1～0.4g/mL，底物浓度为0.5～5g/L，异丙醇体积浓度为2.5～10％，反应温度30℃，反应时间48小时；
(1)重组菌的构建
提取基因组的菌种为近平滑假丝酵母C.parapsilosis CCTCC M203011；
以近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因组DNA作为PCR扩增反应模板，利用含有NdeI限制性酶切位点的
引物1：5′-ATCGATCGCATATGTCAATTCCATCAAGCCAGTAC-3′
和含有XhoI限制性酶切位点的
引物2：5′-TGACTCTCGAGTGGATTAAAAACAACTCTACCTTC-3′，通过PCR反应扩增rcr基因片断；PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP0.5μL，50pmol/μL的引物1取1μL，50pmol/μL的引物2取1μL，基因组DNA 5μL，5U/μL的Taq DNA polymerase取0.5μL；PCR反应过程为：94℃预变性5min，94℃1min，57℃1min，72℃1min，进行30个循环，72℃延伸10min；
利用限制性内切酶NdeI和XhoI对扩增得到的rcr基因与载体pET21c进行双酶切处理，处理后DNA片断通过连接获得带有目的基因rcr片断的重组质粒pET-RCR；
将rcr基因片断插入载体pET21c构建重组质粒pET-RCR，重组质粒转化感受态大肠杆菌E.coli BL21细胞，通过含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选目的重组菌株E.coli BL21/pET-RCR；
(2)重组菌菌体的培养
LB培养基，以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.0，氨苄青霉素0.050，固体培养基添加琼脂粉15；
培养条件：挑取重组菌株的阳性克隆单菌落接种于3mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜，取1mL培养液转接于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6-0.8后，培养物中加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG 0～1mmol/L，诱导培养温度30～37℃。
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| CN1884502A (zh) * | 2006-06-20 | 2006-12-27 | 江南大学 | 近平滑假丝酵母cctcc m203011的(s)－羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成 |
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2007
- 2007-11-11 CN CN2007101354446A patent/CN101230363B/zh active Active
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| CN1884502A (zh) * | 2006-06-20 | 2006-12-27 | 江南大学 | 近平滑假丝酵母cctcc m203011的(s)－羰基还原酶的基因序列和氨基酸组成 |
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| CN101230363A (zh) | 2008-07-30 |
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