CN104726354A - 利用(s)-羰基还原酶ii/e228s的孢子微胶囊酶立体选择性制备(r)-苯乙醇的方法 - Google Patents

利用(s)-羰基还原酶ii/e228s的孢子微胶囊酶立体选择性制备(r)-苯乙醇的方法 Download PDF

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Abstract

利用(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶立体选择性制备(R)-苯乙醇的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明提供了一株重组酿酒酵母（Saccharomyces.cerevisiae）AN120/pRS424-TEFpr-scrII/E228S，保藏编号CCTCC NO：M2015099；及其不对称转化制备(R)-苯乙醇的方法。本发明将(S)-羰基还原酶II的第228位的Glu突变为Ser，构建重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S，转化入酿酒酵母获得重组菌株（S.cerevisiae）AN120/pRS424-TEFpr-scrII/E228S，通过后期的诱导培养获得孢子微胶囊酶。该孢子微胶囊酶拓宽了羰基还原酶的底物结合域，解决了羰基还原酶对环境耐受性差、重复利用率低的问题，为高效、低成本、生物合成(R)-苯乙醇的工业应用奠定了基础。

Description

利用(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶立体选择性制备(R)-苯乙醇的方法
技术领域
利用(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶立体选择性制备(R)-苯乙醇的方法，本发明涉及蛋白质工程技术改造(S)-羰基还原酶II催化苯乙酮的底物选择性，通过基因工程技术构建重组酿酒酵母突变株，诱导培养使酵母产生子囊孢子包埋突变蛋白，形成微胶囊酶，高效制备(R)-苯乙醇，属于生物催化不对称转化技术领域。
背景技术
手性化合物作为手性合成的中间体，在医药、农药、和食品添加剂等精细化工中应用广泛。羰基还原酶催化合成手性醇时，一般仅能催化其天然底物，这就要求对野生型羰基还原酶进行理性改造，赋予其新的催化功能，能催化非天然底物，获得非天然的手性产物。
定点突变技术可以有效改变(S)-羰基还原酶II催化的底物选择性。通过氨基酸序列和蛋白结构比对的方法，选择(S)-羰基还原酶II的底物结合域中关键氨基酸位点实施突变，构建相应的突变株，可有效提高其催化苯乙酮底物的效率。
酿酒酵母以其安全、蛋白表达调控等优势逐渐成为优良的表达宿主。当酵母细胞在营养匮乏时产生具有四层网状膜结构的子囊孢子，以抵御外界不良环境，同时拦截外源大分子，只允许小分子物质（底物、产物和辅酶等）进出孢子，为孢子内胶囊酶提供一个相对独立，几乎无外酶干扰的催化内环境。因而酵母孢子是一种极具潜力的酶固定化载体。
本实验室定点改造了近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis) CCTCC NO：M203011的(S)-羰基还原酶II，获得了重组菌株Escherichia coli BL21/pET-E228S。研究发现该突变体具有催化非天然底物苯乙酮的活性。在此基础上，将突变基因克隆至酿酒酵母AN120中表达，通过加入醋酸钾作为唯一能源物质诱导培养产生孢子，包埋突变蛋白，形成微胶囊酶。以微胶囊酶为生物催化剂，苯乙酮为底物进行生物转化。该微胶囊酶不仅能高效手性转化，而且环境具有很好的耐受性；同时，微胶囊酶连续使用20批次后仍能保持较高水平的转化效率。本发明通过基因工程技术构建微胶囊酶，成功克服了(S)-羰基还原酶II底物选择性差及酶蛋白对环境耐受性差的缺陷，从而实现了微胶囊酶高效不对称转化制备(R)-苯乙醇。
发明内容
（1）要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种蛋白质工程技术改造的微胶囊酶，利用重组酿酒酵母(菌种保藏号：CCTCC NO:M2015099)不对称转化制备(R)-苯乙醇的方法。本发明目的在于根据已经解析出来的蛋白结构，利用定点改造技术，基因工程法将突变体表达于酿酒酵母AN120孢子中，形成微胶囊酶，改变该酶的立体选择性和产物空间对映性，提高酶的使用批次。该微胶囊酶不对称还原苯乙酮制备光学活性(R)-苯乙醇，连续使用20批次后，产物光学纯度高达99％，转化率高于81%。对(S)-羰基还原酶II进行定点突变后进行微胶囊化，不仅开发了该酶的催化转化非天然产物的新功能，而且显著提高了酶的催化稳定性，为工业上高效、低成本制备光学纯(R)-苯乙醇奠定了坚实的基础。
（2）技术方案：一株生产用于不对称转化制备(R)-苯乙醇的孢子的重组酿酒酵母，其分类命名为酿酒酵母（S. cerevisiae）AN120/pRS424-TEFpr-scrII/E228S，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2015099。
利用所述的重组酿酒酵母生产(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶的方法，在于：
YPD液体培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，pH 7.0，以去离子水配制；固体培养基添加15琼脂粉；
YPACE液体培养基以g/L计：KAc 20，胰蛋白胨20，酵母提取物10，以去离子水配制；
产孢培养基以g/L计：KAc 20，以去离子水配制；
培养条件：挑取重组酿酒酵母CCTCC NO：M2015099的单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养16 h；取10 mL培养液转接于1 L的YPACE液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养24 h后，6000 rpm、10 min无菌离心收集菌体，并转入1 L的产孢培养基中继续培养2–3 d，用显微镜镜检产孢效率；产孢完成后，6000 rpm、10 min离心收集菌体并以pH 6.5的少量磷酸缓冲液重悬菌体，以超声细胞破碎仪处理1 h，工作强度50%、工作时间1 s、工作间隙3 s后，离心收集孢子，即得(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶，待用。
利用所述方法制备的(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶不对称转化制备(R)-苯乙醇的方法，将改造后的突变基因E228S通过构建重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S转入酿酒酵母AN120中，利用诱导培养获得的(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶；以苯乙酮为底物，催化不对称转化反应：在1 mL pH5.0~5.5的0.1 mol/L醋酸缓冲液，或1 mL pH 6.0~7.5的0.1 mol/L磷酸缓冲液，或1 mL pH 8.0~9.0的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液中，孢子浓度为0.1 g/mL，苯乙酮底物浓度为6 g/L，及与苯乙酮等摩尔量的辅酶NADPH，反应温度30℃，反应时间5 h。
所述的重组酿酒酵母AN120/pRS424-TEFpr-scrII/E228S的构建方法：
YPD液体培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去离子水配制；
SD-Trp培养基：葡萄糖2%，氨基酸干粉混合物6.7 g/L，YNB 2%，以去离子水配制；固体培养基添加20琼脂粉；
培养条件：挑取酿酒酵母AN120单菌落接种于5 mL的YPD液体培养基中，30℃、200rpm震荡培养16 h，取1 mL菌液12000 rpm离心收集菌体，弃去上清，用100 μL 组成为1M DTT 10 μL、50% PEG 80 μL、2M LiAc 10 μL的 Buffer重悬菌体，加入重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S 1 μL，轻轻混匀后于45℃温浴30 min，取出后将菌液涂布SD-Trp平板，30℃倒置培养。
重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S的构建：
利用限制性内切酶Pst I 和Xho I，质粒pET-28a- scrII/E228S与载体pRS424-TEFpr分别进行双酶切处理，经切胶回收浓缩后DNA片断通过粘性末端连接，获得重组质粒pRS424-TEFpr- scrII/E228S。
质粒pET-28a- scrII/E228S的获得：
以pET-28a-scrII为模板，利用全质粒PCR引物进行PCR反应；
E228S_F：5’-TTTCTGATTT TGTTAGTAAA GACATGAAAG C-3’，
E228S_R：5’-GCTTTCATGT CTTTACTAAC AAAATCAGAA A-3’；
PCR反应体系：ddH2O 41 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L 的dNTP  0.5 μL，50 pmol/μL的引物E228S_F和E228S_R各1 μL，质粒pET-28a-scrII 1 μL，5 U/μL 的Taq DNA polymerase 0.5 μL；
PCR反应：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 7 min，进行30个循环；72℃延伸10 min；PCR反应结束后，向反应体系中加入Dpn I 1μL，置于37℃水浴锅中酶切1 h去除原始模板质粒。
pET-28a-scrII质粒的获得：
利用限制性内切酶Pst I 和Xho I，基因scrII与载体pET-28a分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得重组质粒pET-28a-scrII。
基因scrII的获得：
以近平滑假丝酵母基因组为PCR反应模板，利用含有Pst Ⅰ和Xho Ⅰ限制性酶切位点的引物SCR_F，SCR_R：
SCR_F：5’-TGCACTGCAG ATGCACCACC ACCACCACCA CGGCGAAATC GAATCTTATT GCA-3’，
SCR_R：5’-CCGCTCGAGC TATGGACAAG TGT-3’；
PCR反应体系：ddH2O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L dNTP 0.5 μL，50 pmol/μL的引物SCR_F和SCR_R各1 μL，基因组DNA 5 μL，5 U/μL的Taq DNA polymerase 0.5 μL；
PCR反应过程：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min、60 ℃ 30 s、72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。
用于获得scrII基因所需要提取的近平滑假丝酵母基因组的菌种为近平滑假丝酵母(C. parapsilosis) CCTCC NO：M203011。
一、基因组的获得
近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)CCTCC NO：M203011的培养基组成为：葡萄糖2%，酵母膏1%，胰蛋白胨2%。
将近平滑假丝酵母CCTCC NO：M203011接种于培养基装液量为20%的250 mL摇瓶中于30℃、200 rpm振荡培养16 h。培养结束后，将菌体于6,000 rpm、20 min下离心，用生理盐水洗涤两次后收集细胞，利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System（VIOGENE公司）提取基因组。
二、scrII基因的获得 
合成两端引物（下划线为酶切位点）：
SCR_F：5’-TGCACTGCAG ATGCACCACC ACCACCACCA CGGCGAAATC GAATCTTATT GCA-3’(Pst I)，
SCR_R：5’-CCGCTCGAGC TATGGACAAG TGT-3’(Xho I)；
具体方法如下：
PCR反应体系：ddH2O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP (25 mmol/L) 0.5 μL，引物 (50 pmol/μL)各1 μL，基因组DNA 5 μL，Taq DNA polymerase (5 U/μL) 0.5 μL。
PCR反应：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。以近平滑假丝酵母基因组为模板，以引物SCR_F和SCR_R进行PCR反应，获得scrII全长片段。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能博彩生物科技有限公司）纯化DNA片断。
三、含scrII基因的重组质粒pET-28a-scrII的构建
基因scrII及质粒pET-28a的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒pET-28a。
按照水、缓冲液、基因或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2 s使液体集中于管底，37℃水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收并浓缩。
反应体系组成：10×Buffer H 4 μL，DNA 10 μL，Pst I 2 μL，XhoI 2 μL，ddH2O将体系补足40 μL。
基因scrII与质粒pET-28a的连接
反应体系组成如下：质粒pET-28a 0.8 μL，基因scrII4.2 μL，Ligation Solution 5 μL，将混合连接液置于16℃培养箱中连接12-16 h。
重组质粒转化大肠杆菌E. coli JM109
在每管的100 μL E. coli JM109感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置40 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴中冷却3 min。每管中加入800 μL LB液体培养基，37℃ 150 rpm摇床温育复苏1 h。培养后菌液4,000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
阳性克隆的选择
挑取4个克隆，转接入装有5 mL的含有50 μg/mL 卡那霉素的LB培养基中，37℃培养12 h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2 μL，DNA 5 μL，Pst I 0.5 μL，XhoI 0.5 μL，ddH2O将体系补足20 μL。获得阳性质粒pET-28a-scrII。
四、全质粒PCR获取重组质粒pET-28a- scrII/E228S
       合成引物：
E228S_F：5’-TTTCTGATTT TGTTAGTAAA GACATGAAAG C-3’；
E228S_R：5’-GCTTTCATGT CTTTACTAAC AAAATCAGAA A-3’。
具体方法如下：
PCR反应体系：ddH2O 41 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP (25 mmol/L) 0.5 μL，引物 (50 pmol/μL)各1 μL，质粒pET-28a-scrII 1 μL，Taq DNA polymerase (5 U/μL) 0.5 μL。
PCR反应：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 7 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。以质粒pET-28a-scrII为模板，以引物E228S_F和E228S_R进行PCR反应，获得含有突变基因的重组质粒pET-28a- scrII/E228S。PCR反应结束后，向反应体系中加入Dpn I 1μL，置于37℃水浴锅中酶切1 h。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能博彩生物科技有限公司）纯化重组质粒。
重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21
在每管的100 μL E. coli JM109感受态细胞悬液中加入全部纯化回收后的PCR体系，轻轻混匀，冰浴中静置40 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴中冷却3 min。每管中加入800 μL LB液体培养基，37℃ 150 rpm摇床温育复苏1 h。培养后菌液4,000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
阳性克隆的选择
挑取4个克隆，转接入装有5 mL的含有50 μg/mL 卡那霉素的LB培养基中，37℃培养12 h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2 μL，DNA 5 μL，Pst I 0.5 μL，XhoI 0.5 μL，ddH2O将体系补足20 μL。酶切验证后阳性质粒送至上海生工生物工程有限公司进行DNA序列测定，测序后可获得阳性质粒pET-28a- scrII/E228S和阳性克隆E.coli BL21/pET-28a- scrII/E228S。
五、重组大肠杆菌的诱导表达培养
LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入卡那霉素（50 μg/mL），固体培养基添加2%琼脂粉。
       挑取阳性菌落接种于4 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm震荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm震荡培养至OD 600为0.6-0.8时，向培养物中加至终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，于30℃诱导培养8 h。
六、重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S的构建
质粒pET-28a-scrII/E228S及质粒pRS424-TEFpr的酶切
利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒pRS424-TEFpr。
按照水、缓冲液、质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2 s使液体集中于管底，37℃水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收并浓缩。
反应体系组成：10×Buffer H 4 μL，DNA 10 μL，Pst I 2 μL，XhoI 2 μL，ddH2O将体系补足40 μL。
基因scrII/E228S与质粒pRS424-TEFpr的连接
反应体系组成如下：质粒pRS424-TEFpr 0.8 μL，基因scrII/E228S4.2 μL，Ligation Solution 5 μL，将混合连接液置于16℃培养箱中连接12-16 h。
重组质粒转化大肠杆菌E. coli JM109
在每管的100 μL E. coli JM109感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置40 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴中冷却3 min。每管中加入800 μL LB液体培养基，37℃ 150 rpm摇床温育复苏1 h。培养后菌液4,000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100 μg/mL 氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
阳性克隆的选择
挑取4个克隆，转接入装有5 mL的含有100 μg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养12 h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2 μL，DNA 5 μL，Pst I 0.5 μL，XhoI 0.5 μL，ddH2O将体系补足20 μL。获得阳性质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S。
七、重组酿酒酵母S. cerevisiae AN120/pRS424-TEFpr-scrII/E228S的获得
YPD液体培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。SD-Trp培养基以g/L计：葡萄糖20，氨基酸干粉混合物6.7，YNB 20，固体培养基添加20琼脂粉。
挑取酿酒酵母AN120单菌落接种于5 mL的YPD液体培养基中，30℃、200rpm震荡培养16 h，取1 mL菌液12000 rpm离心收集菌体，弃去上清，用100 μL Buffer重悬菌体（1M DTT 10 μL，50% PEG 80 μL，2M LiAc 10 μL），加入重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S 1 μL，轻轻混匀后于45℃温浴30 min，取出后将菌液涂布SD-Trp平板，30℃倒置培养2-3d。挑取单菌落至SD-Trp液体培养基中，30℃、200rpm震荡培养可生长即为阳性克隆。
八、重组酵母孢子的培育
YPD培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。YPACE培养基以g/L计：KAc 20，酵母提取物10，胰蛋白胨20。产孢培养基以g/L计：KAC 20。
挑取重组酵母CCTCC NO：M2015099单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养16 h。取10 mL培养液转接于1 L的YPACE液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养24 h。将菌液于6000 rpm、10 min无菌离心收集菌体，用产孢培养基重悬菌体，将菌体转移到1 L的产孢培养基中继续培养2–3 d，期间用显微镜镜检产孢效果。6000 rpm、10 min离心收集菌体，用少量PBS缓冲液（pH 6.5）重悬菌体，经超声波细胞破碎仪处理1 h（工作强度50%，工作时间1 s，工作间隙3 s），镜检破碎率约为90%即可。6000 rpm，10 min离心收集孢子。
九、重组大肠杆菌及微胶囊酶催化不对称转化制备(R)-苯乙醇
       （a） 利用重组大肠杆菌催化不对称还原反应。
LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入卡那霉素（50 μg/mL），固体培养基添加2%琼脂粉。
       挑取阳性菌落接种于4 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm震荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm震荡培养至OD 600为0.6-0.8时，向培养物中加至终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，于30 ℃诱导培养8 h。
培养后的重组大肠杆菌细胞10,000 rpm离心10 min并用生理盐水洗涤三次后收集。在以下体系中进行检测：1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH5.0~5.5），或1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0~7.5）或1 mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0~9.0）中，加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量的辅酶NADPH，0.1 g/mL重组大肠杆菌湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应48 h。
或（b）利用微胶囊酶（(S)-羰基还原酶II/E228S）催化不对称还原反应。
YPD培养基：胰蛋白胨2%，酵母提取物1%，葡萄糖2%。YPACE培养基：2% KAc，1% 酵母提取物，2% 胰蛋白胨。产孢培养基：2% KAc。
挑取重组酵母单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养16 h。取10 mL培养液转接于1 L的YPACE液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养24 h。将菌液于6000 rpm、10 min无菌离心收集菌体，将菌体转移到1 L的产孢培养基中继续培养2 – 3 d，期间用显微镜镜检产孢效果。6000 rpm、10 min离心收集菌体，用少量PBS缓冲液（pH 6.0）重悬菌体，经超声波细胞破碎仪处理1 h（工作强度50%，工作时间1 s，工作间隙3 s）镜检破碎率约为90%即可。
破碎后的孢子在6000 rpm、10 min下离心收集。在以下体系中进行检测：1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.0~5.5），或1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0~7.5）或1 mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0~9.0）中，加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量的辅酶NADPH，0.1 g/mL湿孢子，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应5 h。
反应结束后，将反应混合物离心除去菌体，上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HP1100) 进行分析，条件为Chiralcel OB-H柱(4.6 mm ×25 cm; Daicel Chemical Ind., Ltd., Japan)，流动相为正己烷/异丙醇（9/1），流速0.6 mL/min，检测波长为215 nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。
产物(R)-苯乙醇对映过量值的计算：
对映过量值( e.e.%)=[(C R-C S)/(C S+C R)]*%100%，
产物(R)-苯乙醇产率的计算：产率（%）= C R/C 0*100%，
式中C R为反应后(R)-对映体的浓度，C S为反应后(S)-对映体的浓度，C 0为反应前底物苯乙酮的浓度。
以重组大肠杆菌或微胶囊酶为催化剂，不对称生物转化反应后，产物均为(R)-苯乙醇。
（3）有益效果
成功通过定点突变技术获得了近平滑假丝酵母（S）-羰基还原酶II突变体E228S，成功构建了突变酶基因的重组菌株S. cerevisiae AN120/pRS424-TEFpr-scrII/E228S及其微胶囊酶。
重组大肠杆菌E.coli BL21/pET-28a-E228S和重组酵母孢子S. cerevisiae AN120/pRS424-TEFpe-scrII/E228S均可催化转化底物苯乙酮，获得高光学纯度和高产率的产物(R)-苯乙醇，但微胶囊酶表现出了更优异的反应效率和稳定性。通过优化反应条件，在30℃、pH 6.5的磷酸缓冲液中，利用0.1 g/mL重组孢子对6 g/L底物2-羟基苯乙酮催化转化5 h，产物(R)-苯乙醇的光学纯度为99.6% e.e.，产率为97.0%。同时与大肠杆菌体系相比，反应时间由48 h缩短为5 h；在极端温度和pH条件下，微胶囊酶都表现出了优良的耐受性；连续使用20次后，其催化产物的光学纯度几乎不变，得率仍维持在82%以上。这些工作成功改变了（S）-羰基还原酶II催化底物选择性，同时很好地克服了羰基还原酶对环境耐受性较差的限制，首次实现了羰基还原酶在酿酒酵母孢子内微胶囊化，为手性化合物的高效制备奠定了坚实的研究基础。
生物材料样品保藏：酿酒酵母Saccharomyces. cerevisiae AN120/pRS424-TEF pr-scrII/E228S，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2015099。保藏日期2015年3月11日。
具体实施方式
实施例1
近平滑假丝酵母(C. parapsilosis)CCTCC NO：M203011的菌体培养，其培养基组成为：葡萄糖2%，酵母膏1%，胰蛋白胨2%。
将酵母接种于培养基装液量为20%的250 mL摇瓶中于30℃、200 rpm振荡培养16 h。
实施例2
近平滑假丝酵母(C. parapsilosis) CCTCC NO：M203011基因组的提取：将实施例1培养的菌体于6,000 rpm、20 min下离心，用生理盐水洗涤两次后收集细胞，利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System（VIOGENE公司）提取基因组。
实施例3
scrII基因获得：引物：
SCR_F：5’-TGCACTGCAG ATGCACCACC ACCACCACCA CGGCGAAATC GAATCTTATT GCA-3’(Pst I)；
SCR_R：5’-CCGCTCGAGC TATGGACAAG TGT-3’(Xho I)。
采用PCR反应体系：ddH2O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP (25 mmol/L) 0.5 μL，引物(50 pmol/μL)各 1 μL，基因组DNA 5 μL，Taq DNA polymerase (5 U/μL) 0.5 μL。
PCR反应：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。以近平滑假丝酵母基因组为模板，以引物SCR_F和SCR_R进行PCR反应，获得scrII基因片段。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能博彩生物科技有限公司）纯化DNA片断。
实施例4
pET-28a-scrII重组质粒的获得：基因scrII及质粒pET-28a的酶切反应体系：10×Buffer H 4 μL，DNA 10 μL，Pst I 2 μL，XhoI 2 μL，ddH2O将体系补足40 μL。37℃水浴3 h，在管中加入1/10（V/V）的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收并浓缩。采用以下连接反应体系：质粒pET-28a 0.8 μL，基因scrII4.2 μL，Ligation Solution 5 μL，将混合连接液置于16℃培养箱中连接12-16 h。
在每管100 μL E. coli JM109感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置40 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴中冷却3 min。每管中加入800 μL LB液体培养基，37℃ 150 rpm摇床温育培养1 h。培养后菌液4,000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
挑取4个克隆，转接入装有5 mL的含有50 μg/mL 卡那霉素的LB培养基中，37℃培养12 h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2 μL，质粒DNA 5 μL，Pst I 0.5 μL，XhoI 0.5 μL，ddH2O将体系补足20 μL。获得阳性质粒pET-28a-scrII。
实施例5
定点突变获得重组质粒pET-28a- scrII/E228S：引物：
E228S_F：5’-TTTCTGATTT TGTTAGTAAA GACATGAAAG C-3’；
E228S_R：5’-GCTTTCATGT CTTTACTAAC AAAATCAGAA A-3’。
采用PCR反应体系：ddH2O 41 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP (25 mmol/L) 0.5 μL，引物 (50 pmol/μL)各1 μL，质粒pET-28a-scrII 1 μL，Taq DNA polymerase (5 U/μL) 0.5 μL。PCR反应：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 7 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。以质粒pET-28a-scrII为模板，以引物E228S_F和E228S_R进行PCR反应，获得含有突变基因的重组质粒pET-28a- scrII/E228S。PCR反应结束后，向反应体系中加入Dpn I 1μL，置于37℃水浴锅中酶切1 h。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit（上海申能博彩生物科技有限公司）纯化重组质粒。
实施例6
重组质粒pET-28a- scrII/E228S转化大肠杆菌E.coli BL21
在每管的100 μL E. coli JM109感受态细胞悬液中加入全部纯化回收后的PCR体系，轻轻混匀，冰浴中静置40 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴中冷却3 min。每管中加入800 μL LB液体培养基，37℃ 150 rpm摇床温育复苏1 h。培养后菌液4,000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
挑取4个克隆，转接入装有5 mL的含有50 μg/mL 卡那霉素的LB培养基中，37℃培养12 h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2 μL，DNA 5 μL，Pst I 0.5 μL，XhoI 0.5 μL，ddH2O将体系补足20 μL。酶切验证后阳性质粒送至上海生工生物工程有限公司进行DNA序列测定，测序后可获得阳性质粒pET-28a- scrII/E228S和阳性克隆E.coli BL21/pET-28a- scrII/E228S。
实施例7
重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S的获得：质粒pET-28a- scrII /E228S及pRS424-TEFpe的酶切反应体系：10×Buffer H 4 μL，DNA 10 μL，Pst I 2 μL，XhoI 2 μL，ddH2O将体系补足40 μL。37℃水浴3 h，在管中加入1/10（V/V）的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收浓缩。连接反应体系组成如下：质粒pRS424-TEFpe 0.8 μL，基因scrII /E228S4.2 μL，Ligation Solution 5 μL，将混合连接液置于16℃培养箱中连接12-16 h。
在每管的100 μL E. coli JM109感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置40 min。转入42℃水浴中，热击90 s。快速转移至冰浴中冷却3 min。每管中加入800 μL LB液体培养基，37℃ 150 rpm摇床温育复苏1 h。培养后菌液4,000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100 μg/mL 氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
挑取4个克隆，转接入装有5 mL的含有100 μg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养12 h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit（北京博大泰克生物基因技术有限公司）提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer H 2 μL，DNA 5 μL，Pst I 0.5 μL，XhoI 0.5 μL，ddH2O将体系补足20 μL。获得阳性质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S。
实施例8
重组酵母S. cerevisiae AN120/pRS424-TEFpr-scrII/E228S的获得：YPD培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。SD-Trp培养基以g/L计：葡萄糖20，氨基酸干粉混合物6.7，YNB 20，需用固体培养基可加入20琼脂粉。
挑取酿酒酵母AN120接种于5 mL的YPD液体培养基中，30℃、200rpm震荡培养16 h，取1 mL菌液12000 rpm离心收集菌体，弃去上清，用100 μL Buffer（1M DTT 10 μL，50% PEG 80 μL，2M LiAc 10 μL）重悬菌体，加入重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S 1 μL，轻轻混匀后于45℃温浴30 min，取出后将菌液涂布SD-Trp平板，于30℃恒温培养箱中倒置培养2–3 d获得重组菌单菌落。
实施例9
酵母孢子微胶囊酶的制备：YPD培养基组分同实施例8，YPACE培养基以g/L计： KAc 20，酵母提取物10，胰蛋白胨20。产孢培养基以g/L计：KAc 20。挑取重组酵母CCTCC NO：M2015099单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养16 h。取10 mL培养液转接于1 L的YPACE液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养24 h。6000 rpm、10 min无菌离心收集菌体，用产孢培养基重悬菌体，转移到1 L的产孢培养基中继续培养2–3 d，期间取样并用显微镜镜检产孢率。待产孢完全后，6000 rpm、10 min离心收集菌体，用少量PBS（pH 6.5）重悬，经过超声破碎处理即可将孢子从酵母细胞中释放出来待用。
实施例10
在1 mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.0）中，分别加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应5 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯乙醇的光学纯度为99.2% e.e.，产率为65.2%。
实施例11
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.0）中，分别加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应5 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯乙醇的光学纯度为99.0% e.e.，产率为87.4%。
实施例12
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）中，分别加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应5 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯乙醇的光学纯度为99.6% e.e.，产率为97.0%。
实施例13
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）中，分别加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应5 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯乙醇的光学纯度为98.6% e.e.，产率为85.8%。
实施例14
在1 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中，分别加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应5 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯乙醇的光学纯度为99.2% e.e.，产率为73.6%。
实施例15
在1 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）中，分别加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应5 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯乙醇的光学纯度为99.5% e.e.，产率为68.4%。
实施例16
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）中，分别加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在20℃恒温摇床上振荡反应5 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯乙醇的光学纯度为99.4% e.e.，产率为74.1%。
实施例17
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）中，分别加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在40℃恒温摇床上振荡反应5 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯乙醇的光学纯度为99.0% e.e.，产率为90.3%。
实施例18
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）中，分别加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在50℃恒温摇床上振荡反应5 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯乙醇的光学纯度为99.1% e.e.，产率为80.1%。
实施例19
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）中，分别加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在60℃恒温摇床上振荡反应5 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯乙醇的光学纯度为99.4% e.e.，产率为50.5%。
实施例20
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）中，分别加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在70℃恒温摇床上振荡反应5 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯乙醇的光学纯度为99.8% e.e.，产率为15.3%。
实施例21
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）中，分别加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在80℃恒温摇床上振荡反应5 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(R)-苯乙醇的光学纯度为99.7% e.e.，产率为8.1%。
实施例22
在1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）中，分别加入6 g/L底物苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在30℃恒温摇床上振荡反应5 h。反应结束后同实施例20处理样品，并将离心所得菌体重复实施例15的步骤，反复20次。当重组孢子反复使用20次后，产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度仍可达99.0% e.e.，产率为82.3%。

Claims (9)

1.一株生产用于不对称转化制备(R)-苯乙醇的孢子的重组酿酒酵母，其分类命名为酿酒酵母（S. cerevisiae）AN120/pRS424-TEFpr-scrII/E228S，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2015099。
2.利用权利要求1所述的重组酿酒酵母生产(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶的方法，其特征在于
YPD液体培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，pH 7.0，以去离子水配制；固体培养基添加15琼脂粉；
YPACE液体培养基以g/L计：KAc 20，胰蛋白胨20，酵母提取物10，以去离子水配制；
产孢培养基以g/L计：KAc 20，以去离子水配制；
培养条件：挑取重组酿酒酵母CCTCC NO：M2015099的单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养16 h；取10 mL培养液转接于1 L的YPACE液体培养基中，于30℃、200 rpm振荡培养24 h后，6000 rpm、10 min无菌离心收集菌体，并转入1 L的产孢培养基中继续培养2–3 d，用显微镜镜检产孢效率；产孢完成后，6000 rpm、10 min离心收集菌体并以pH 6.5的少量磷酸缓冲液重悬菌体，以超声细胞破碎仪处理1 h，工作强度50%、工作时间1 s、工作间隙3 s后，离心收集孢子，即得(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶，待用。
3.利用权利要求2所述方法制备的(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶不对称转化制备(R)-苯乙醇的方法，其特征在于将改造后的突变基因E228S通过构建重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S转入酿酒酵母AN120中，利用诱导培养获得的(S)-羰基还原酶II/E228S的孢子微胶囊酶；以苯乙酮为底物，催化不对称转化反应：在1 mL pH5.0~5.5的0.1 mol/L醋酸缓冲液，或1 mL pH 6.0~7.5的0.1 mol/L磷酸缓冲液，或1 mL pH 8.0~9.0的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液中，孢子浓度为0.1 g/mL，苯乙酮底物浓度为6 g/L，及与苯乙酮等摩尔量的辅酶NADPH，反应温度30℃，反应时间5 h。
4.权利要求3所述的不对称转化制备(R)-苯乙醇的方法，其中所述的重组酿酒酵母AN120/pRS424-TEFpr-scrII/E228S的构建方法，其特征在于：
YPD液体培养基以g/L计：胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去离子水配制；
SD-Trp培养基以g/L计：葡萄糖20，氨基酸干粉混合物6.7，YNB 20，以去离子水配制；固体培养基添加20琼脂粉；
培养条件：挑取酿酒酵母AN120单菌落接种于5 mL的YPD液体培养基中，30℃、200rpm震荡培养16 h，取1 mL菌液12000 rpm离心收集菌体，弃去上清，用100 μL 组成为1M DTT 10 μL、50% PEG 80 μL、2M LiAc 10 μL的 Buffer重悬菌体，加入重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S 1 μL，轻轻混匀后于45℃温浴30 min，取出后将菌液涂布SD-Trp平板，30℃倒置培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于重组质粒pRS424-TEFpr-scrII/E228S的构建：
利用限制性内切酶PstI 和XhoI，质粒pET-28a- scrII/E228S与载体pRS424-TEFpr分别进行双酶切处理，经切胶回收浓缩后DNA片断通过粘性末端连接，获得重组质粒pRS424-TEFpr- scrII/E228S。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是质粒pET-28a- scrII/E228S的获得：
以pET-28a-scrII为模板，利用全质粒PCR引物进行PCR反应；
E228S_F：5’-TTTCTGATTT TGTTAGTAAA GACATGAAAG C-3’，
E228S_R：5’-GCTTTCATGT CTTTACTAAC AAAATCAGAA A-3’；
PCR反应体系：ddH2O 41 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L 的dNTP  0.5 μL，50 pmol/μL的引物E228S_F和E228S_R各1 μL，质粒pET-28a-scrII 1 μL，5 U/μL 的Taq DNA polymerase 0.5 μL；
PCR反应：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 7 min，进行30个循环；72℃延伸10 min；PCR反应结束后，向反应体系中加入Dpn I 1μL，置于37℃水浴锅中酶切1 h去除原始模板质粒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于pET-28a-scrII质粒的获得：
利用限制性内切酶PstI 和XhoI，基因scrII与载体pET-28a分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得重组质粒pET-28a-scrII。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于基因scrII的获得：
以近平滑假丝酵母基因组为PCR反应模板，利用含有PstⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点的引物SCR_F，SCR_R：
SCR_F：5’-TGCACTGCAG ATGCACCACC ACCACCACCA CGGCGAAATC GAATCTTATT GCA-3’， 
SCR_R：5’-CCGCTCGAGC TATGGACAAG TGT-3’；
PCR反应体系：ddH2O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L dNTP 0.5 μL，50 pmol/μL的引物SCR_F和SCR_R各1 μL，基因组DNA 5 μL，5 U/μL的Taq DNA polymerase 0.5 μL；
PCR反应过程：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min、60 ℃ 30 s、72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于用于获得scrII基因所需要提取的近平滑假丝酵母基因组的菌种为近平滑假丝酵母(C. parapsilosis) CCTCC  NO：M203011。
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