CN104152506B

CN104152506B - 醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(s)-n,n-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺的方法

Info

Publication number: CN104152506B
Application number: CN201410388122.2A
Authority: CN
Inventors: 聂尧; 徐岩
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-08-08
Filing date: 2014-08-08
Publication date: 2016-10-19
Anticipated expiration: 2034-08-08
Also published as: CN104152506A

Abstract

醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(S)‑N,N‑二甲基‑3‑羟基‑3‑(2‑噻吩)‑1‑丙胺（(S)‑DHTP）的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。本发明是在重组菌粗酶体系中添加辅助底物和初始量辅酶NADP⁺促进体系中的辅酶NADPH的再生循环，反应底物为N,N‑二甲基‑3‑酮‑3‑(2‑噻吩)‑1‑丙胺（DTKP），重组菌为表达醛酮还原酶基因的E. coli BL21(DE3)(pETCPAR4)，醛酮还原酶基因cpar4来自于近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC NO：M 203011，该基因编码醛酮还原酶CPAR4，催化不对称还原DKTP为(S)‑DHTP。本发明利用该无细胞系统催化反应，无需在反应体系中额外添加辅酶再生所需的耦联酶，提高了酶与底物直接作用的效率，缩短反应时间，获得较好的转化效果。

Description

醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺的方法

技术领域

本发明涉及一种通过醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（(S)-DHTP）的方法，属于生物催化不对称转化技术领域。

背景技术

(S)-DHTP的化学结构为：

度洛西汀（duloxetine），化学名（S）-N-甲基-3-（1-萘氧基）-3-（2-噻吩基）-1-丙胺，商品名为Cymbalta（欣百达），是一种由美国Eli Lilly公司研发的能够有效抑制5-羟色胺及去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRI）。临床上用其盐酸盐，治疗重症抑郁症、糖尿病性外周神经疼痛及女性应激性尿失禁。在与度洛西汀具有相同化学组成的两种同分对映异构体中，只有（S）-构型具有抗抑郁的药理活性。

目前，由于起始原料不同，不对称合成手性度洛西汀的方法很多。其中，（S）-N,N-二甲基-3-羟基-3-（2-噻吩）-1-丙胺（(S)-DHTP）是制备度洛西汀的重要手性中间体，因而通过专一性不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）为(S)-DHTP已成为高效制备度洛西汀的一种重要途径。

生物催化还原羰基化合物，以其高效、专一、反应条件温和、立体选择性好等优点，已成为制备手性醇的重要手段。目前，已筛选得到多株能够不对称还原制备度洛西汀中间体的微生物，如Exiguobacterium sp.、Thermoanaerobacter sp.、Candida tropicalis、C. viswanathii等。其中C. tropicalis、C. viswanathii能够全细胞催化N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）还原生成(S)-DHTP，并且产率达到80%以上，光学纯度大于99%，但反应底物的浓度仍然较低，从而反应效率仍较为有限。这可能是由于其细胞或胞内功能酶的性质局限性以及全细胞的膜结构阻碍底物（DKTP）与酶的相互作用，从而影响催化反应的时空产率，进而大大限制了其工业应用。而且，目前国内度洛西汀手性中间体的研究较少，且水平较低，尚没有利用重组菌粗酶体系催化不对称转化制备光学纯(S)-DHTP的报道。

本发明从近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC NO：M 203011中获得新型醛酮还原酶基因cpar4，该基因编码醛酮还原酶CPAR4，其重组菌粗酶体系能够催化不对称还原DKTP为(S)-DHTP。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化不对称转化制备(S)-DHTP的方法。

本发明目的不仅仅在于构建一种不对称转化制备(S)-DHTP的粗酶催化体系，并将该粗酶体系应用于不对称还原制备(S)-DHTP的反应中，以提高不对称转化制备(S)-DHTP的生产效率，而且利用该重组菌粗酶体系，仅通过添加乳糖等辅助底物而无需额外添加辅酶再生所需的耦联酶，即可实现生物催化氧化还原必需辅酶的有效再生，从而建立一种具经济、方便、有效的生物催化系统。

本发明的技术方案：本发明首先从表达醛酮还原酶的重组大肠杆菌出发制备重组菌粗酶体系，该无细胞体系仅通过添加辅助底物和初始量辅酶NADP⁺即可实现辅酶NADPH的再生循环。在此基础上，对该无细胞体系催化不对称还原制备(S)-DHTP的反应条件进行优化，并考察该反应体系对于制备(S)-DHTP的转化效果。

设计该转化方法的途径如列反应式所示：

利用醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化不对称转化制备(S)-DHTP的方法，是以醛酮还原酶的重组菌粗酶体系为催化剂，并在该无细胞体系重组菌粗酶体系中添加辅助底物和初始量辅酶NADP⁺促进体系中的辅酶NADPH的再生循环，并用于不对称转化反应中，催化DKTP不对称转化反应制备光学纯(S)-DHTP。

所用的辅助底物为葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、乙醇、或果糖，浓度均为10 g/L；辅酶NADPH初始添加量为0.005~0.2 mM。

反应的底物为N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP），重组菌为表达醛酮还原酶基因的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)(pETCPAR4)，醛酮还原酶基因cpar4来自于近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC M 203011，该基因编码醛酮还原酶CPAR4，催化不对称还原DKTP为(S)-DHTP的反应。

具体步骤为：

（1）含有基因cpar4的重组大肠杆菌构建

近平滑假丝酵母（C. parapsilosis）CCTCC NO：M 203011培养基：葡萄糖4%，酵母膏0.5%，(NH₄)₂HPO₄1.3%，KH₂PO₄0.7%，ZnSO₄·7H₂O 0.03%，NaCl 0.01%，pH7.0。

将近平滑假丝酵母（C. parapsilosis）CCTCC NO：M 203011菌种接种于培养基装液量为20%的250 mL摇瓶中于30℃、150 rpm振荡培养48 h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞，利用基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System（VIOGENE公司）提取基因组。

以近平滑假丝酵母（C. parapsilosis）CCTCC NO：M 203011基因组DNA作为PCR扩增反应模板。合成引物1：5'- CCCGCCCGCA TATGTCAGCT CAATTGAAAG TAAAC -3'，引物2：5'- GCCCGCTCGA GGTCATTGAA GTTGTTGAAG CCTG -3'。引物1含有NdeI 限制性酶切位点，引物2含有XhoI 限制性酶切位点。

PCR反应体系：ddH₂O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP (25 mmol/L) 0.5 μL，引物1 (50 pmol/μL) 1 μL，引物2 (50 pmol/μL) 1 μL，基因组DNA 5 μL，Taq DNA polymerase (5 U/μL) 0.5 μL。PCR反应过程如下：94℃预变性5min；94℃ 1 min，64℃ l min，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min。

PCR产物利用上海生工生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒纯化DNA片断。

将目的基因PCR产物DNA片段和质粒pET-21c进行酶切。反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，DNA 10 μL，NdeI 2 μL，XhoI 2 μL，ddH₂O将体系补足40 μL，振荡使液体充分混匀，37℃水浴3 h，在管中加入1/10体积的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。

将目的基因DNA片段与质粒pET-21c连接，反应体系组成如下：质粒pET-21c 0.8 μL，外源基因4.2 μL，Ligation Solution 5 μL，ddH₂O将体系补足10 μL。混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接16 h。

连接反应产物转化大肠杆菌，在100 μL E. coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30 min。转入42℃水浴中，热击45s。快速转移至冰浴中，冷却2 min。每管中加入700 μL LB液体培养基，37℃、100 rpm摇床温育培养1 h。培养后菌液3,000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有100 μg/mL 氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养。

培养后的单菌落经测序鉴定获得含有醛酮还原酶基因cpar4的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)(pETCPAR4)。

（2）重组菌粗酶体系的制备：

LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。

挑取阳性克隆E. coli BL21 (DE3) (pETCPAR4)单菌落接种于3 mL含50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度1 mmol/L，在培养温度17℃下诱导培养12~15 h。

培养后的重组大肠杆菌细胞10,000 rpm离心10 min并用生理盐水洗涤三次后收集。菌体重新悬浮于磷酸钾缓冲液（pH 6.5, 0.1 M）中，配置成含有湿细胞浓度为100 g/L的菌悬液，菌悬液经超声破碎后离心，所得上清液（总可溶蛋白浓度5~20 g/L）作为粗酶体系用于不对称转化反应。

（3）重组菌粗酶体系不对称转化制备光学纯(S)-DHTP

反应体系（2 mL）组成：1 mL 磷酸钾缓冲液 (pH 6.5、0.1 M)，1 mL 粗酶体系（总可溶蛋白5~20 mg），10 g/L 辅助底物，1~6 g/L底物DKTP，0.005~0.2 mM NADP⁺。反应混合物于20~30℃ 振荡反应8 h，反应后混合物用2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于产物(S)-DHTP分析。

产物通过手性固定相高效液相色谱（戴安P 680）进行分析。手性液相色谱柱为Chiralcel OD-H柱（4.6 mm ×25 cm; Daicel Chemical Ind., Ltd., Japan），流动相为正己烷/异丙醇（80/10~98/2），流速0.4~0.8 mL/min，检测波长为215 nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。

产物对映过量值的计算：对映过量值（e.e.%）=[(C _S-C _R)/(C _S+C _R)]*100%

产物产率的计算：产率（%）= C _S/C ₀*100%

式中C _S为反应后(S)-对映体的浓度，C _R为反应后(R)-对映体的浓度，C ₀为反应前底物的浓度。

转化后得到产物(S)-DHTP、(R)-DHTP，光学纯度为99% e.e.，产率为48%~95%。

与纯酶反应体系相比，该粗酶催化体系不需额外添加辅酶再生所需的耦联酶，通过在反应体系中添加10 g/L 辅助底物，初始辅酶0.005~0.2 mM NADP⁺，实现反应必须辅酶NADPH的再生循环，辅酶总转换数为93~921，大大简化了反应系统的复杂性；与细胞反应体系相比，该粗酶催化体系解除了细胞膜对底物/产物进出细胞的阻碍，提高了不对称转化效果。此外，该无细胞系统对高浓度的DKTP具有一定的耐受性，具有一定的应用价值。

本发明的有益效果：本发明成功克隆了近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC NO：M 203011醛酮还原酶编码基因，该基因全长888 bp，编码295个氨基酸残基，其基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2。

本发明与通常采用的纯酶或全细胞催化方式不同，是一种利用重组菌粗酶体系催化不对称转化制备光学纯(S)-DHTP的方法。利用该无细胞系统催化反应，无需在反应体系中额外添加辅酶再生所需的耦联酶，同时提高了酶与底物直接作用的效率，缩短反应时间，从而获得较好的转化效果。

在水相的不对称转化反应体系中，利用重组菌粗酶体系催化底物DKTP，获得了光学纯的反应产物(S)-DHTP对映体，产物光学纯度为99% e.e.，产率为48%~95%。通过在反应体系中添加10g/L 辅助底物，初始辅酶0.005~0.2 mM NADP⁺，实现反应必需辅酶NADPH的再生循环，辅酶总转换数为93~921。

该无细胞系统不仅提供了一种新的生物催化不对称转化的反应方式，既实现了生物催化氧化还原必需的辅酶再生，又提高了生物转化的整体效果，而且该系统对高浓度的DKTP具有一定的耐受性，具有一定的应用价值。

生物材料样品保藏：近平滑假丝酵母（C. parapsilosis）CCTCC NO：M 203011，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏日期2003年3月1日，该菌株已在中国专利03132140.2，发明名称：一种应用微生物立体选择性转化制备光学纯苯基乙二醇的方法及其专用微生物，CN 1477203 A 公告。

具体实施方式

实施例1重组菌粗酶体系的制备：

LB培养基组成为胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素（50 μg/mL），固体培养基添加1.5%琼脂粉。

挑取阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养过夜。取1 mL培养液转接于50 mL含50 μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6。向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度1 mmol/L，在培养温度17℃下诱导培养12 h。

培养后的重组大肠杆菌细胞10,000 rpm离心10 min并用生理盐水洗涤三次后收集。菌体重新悬浮于磷酸钾缓冲液（pH 6.5、0.1 M）中配置成含有湿细胞浓度为100 g/L的菌悬液，菌悬液经超声破碎后离心，所得上清液（总可溶蛋白浓度10 g/L）作为粗酶体系用于不对称转化反应。

实施例2水相反应体系中粗酶体系催化不对称还原反应：

2 mL反应体系组成为1 mL 磷酸钾缓冲液 (pH 6.5, 0.1 M)，1 mL 粗酶体系（总可溶蛋白15 mg），10 g/L 葡萄糖，5 g/L DKTP，0.02 mM NADP⁺。反应混合物于30℃振荡反应8h，反应后混合物用2倍体积乙酸乙酯萃取，产物(S)-DHTP的光学纯度99% e.e.，产率69.4%。

实施例3水相反应体系中粗酶体系催化不对称还原反应：

2 mL反应体系组成为1 mL 磷酸钾缓冲液 (pH 6.5、0.1 M)，1 mL 粗酶体系（总可溶蛋白15 mg），10 g/L 乳糖，5 g/L DKTP，0.02 mM NADP⁺。反应混合物于30℃振荡反应8h，反应后混合物用2倍体积乙酸乙酯萃取，产物(S)-DHTP的光学纯度99% e.e.，产率69.7%。

实施例4水相反应体系中粗酶体系催化不对称还原反应：

2 mL反应体系组成为1 mL 磷酸钾缓冲液 (pH 6.5、0.1 M)，1 mL 粗酶体系（总可溶蛋白15 mg），10 g/L乳糖，5 g/L DKTP，0.02 mM NADP⁺。反应混合物于30℃振荡反应8h，反应后混合物用2倍体积乙酸乙酯萃取，产物(S)-DHTP的光学纯度99% e.e.，产率69.9%。

实施例5水相反应体系中粗酶体系催化不对称还原反应：

2mL反应体系组成为1mL 磷酸钾缓冲液 (pH 6.5、0.1 M)，1mL 粗酶体系（总可溶蛋白15mg），10g/L乳糖，5 g/L DKTP，0.02 mM NADP⁺。反应混合物于25℃振荡反应8h，反应后混合物用2倍体积乙酸乙酯萃取，产物(S)-DHTP的光学纯度99% e.e.，产率66.4%。

实施例6水相反应体系中粗酶体系催化不对称还原反应：

2mL反应体系组成为1mL 磷酸钾缓冲液 (pH 6.5、0.1 M)，1mL 粗酶体系（总可溶蛋白15mg），10g/L乳糖，3g/L DKTP，0.02 mM NADP⁺。反应混合物于25℃振荡反应8h，反应后混合物用2倍体积乙酸乙酯萃取，产物(S)-DHTP的光学纯度99% e.e.，产率94.5%。

实施例7水相反应体系中粗酶体系催化不对称还原反应：

2mL反应体系组成为1mL 磷酸钾缓冲液 (pH 6.5、0.1 M)，1mL粗酶体系（总可溶蛋白15 mg），10g/L 乳糖，6g/L DKTP，0.02 mM NADP⁺。反应混合物于25℃振荡反应8h，反应后混合物用2倍体积乙酸乙酯萃取，产物(S)-DHTP的光学纯度99% e.e.，产率48.5%。

<210>SEQ ID NO: 1

<211>888

<212>DNA

<213>近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC NO：M203011

<214>

atgtcagctc aattgaaagt aaacactact gaattcactt taaacacagg tgccaagatc 60

ccagctgttg gtttgggaac atggcgtgct agcgaaaaag acgctgctta caactctgtc 120

ttgacagcat tgaagaatgg ttatagacat attgatactg ctgccattta tggaaacgaa 180

gaagaagtag gtagagggat tgctgctgct ggaattccta gaaacgagtt gtttgtcact 240

acaaaattat ggaacaagaa gcacaaagac gtcgagtctg ctttggatga atcattgaaa 300

aagttgggcc ttgactatgt tgatttgtac ttgatccact ggcctgtttc cactgatcca 360

gaaactgata aaccatactc ggaccacgac ttcgttgaca cctggaaaac tttacaaaaa 420

atatacaagg aaggtaagaa agtcaaggca attggtgttt ccaactttac tgttaagaaa 480

ttagaaaagc ttttaaatgc tgatggtgtt gatgttgtcc cagccgctaa ccaagttgaa 540

gcacatccct tgttgactca acctgaattg tacgactact tgaaatcaaa aaacattatt 600

ttggaagctt attcaccatt gggttcgagc gagtcgccat tgttcaaaaa caagaccatc 660

actgatattg ctgaaaagaa tggtgttgaa ccagcacaag ttttagtttc ttgggctgtt 720

caaagagaca ctgtcgtatt accaaagtca gttactgatt caagaatcat ttccaacatc 780

aagacattta ctttgagtaa ggaagatttt gaaactttga acaagctttc cgaaaaagat 840

ggtgttgtta gaacgtgtaa tccaggcttc aacaacttca atgactga 888

<210>SEQ ID NO: 2

<211>295

<212>PRT

<213>近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC NO：M203011

<400>1

Met Ser Ala Gln Leu Lys Val Asn Thr Thr Glu Phe Thr Leu Asn

1 5 10 15

Thr Gly Ala Lys Ile Pro Ala Val Gly Leu Gly Thr Trp Arg Ala

20 25 30

Ser Glu Lys Asp Ala Ala Tyr Asn Ser Val Leu Thr Ala Leu Lys

35 40 45

Asn Gly Tyr Arg His Ile Asp Thr Ala Ala Ile Tyr Gly Asn Glu

50 55 60

Glu Glu Val Gly Arg Gly Ile Ala Ala Ala Gly Ile Pro Arg Asn

65 70 75

Glu Leu Phe Val Thr Thr Lys Leu Trp Asn Lys Lys His Lys Asp

80 85 90

Val Glu Ser Ala Leu Asp Glu Ser Leu Lys Lys Leu Gly Leu Asp

95 100 105

Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Ile His Trp Pro Val Ser Thr Asp Pro

110 115 120

Glu Thr Asp Lys Pro Tyr Ser Asp His Asp Phe Val Asp Thr Trp

125 130 135

Lys Thr Leu Gln Lys Ile Tyr Lys Glu Gly Lys Lys Val Lys Ala

140 145 150

Ile Gly Val Ser Asn Phe Thr Val Lys Lys Leu Glu Lys Leu Leu

155 160 165

Asn Ala Asp Gly Val Asp Val Val Pro Ala Ala Asn Gln Val Glu

170 175 180

Ala His Pro Leu Leu Thr Gln Pro Glu Leu Tyr Asp Tyr Leu Lys

185 190 195

Ser Lys Asn Ile Ile Leu Glu Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser Ser

200 205 210

Glu Ser Pro Leu Phe Lys Asn Lys Thr Ile Thr Asp Ile Ala Glu

215 220 225

Lys Asn Gly Val Glu Pro Ala Gln Val Leu Val Ser Trp Ala Val

230 235 240

Gln Arg Asp Thr Val Val Leu Pro Lys Ser Val Thr Asp Ser Arg

245 250 255

Ile Ile Ser Asn Ile Lys Thr Phe Thr Leu Ser Lys Glu Asp Phe

260 265 270

Glu Thr Leu Asn Lys Leu Ser Glu Lys Asp Gly Val Val Arg Thr

275 280 285

Cys Asn Pro Gly Phe Asn Asn Phe Asn Asp ***

290 295

Claims

1.一种通过醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺的方法，其特征在于：

以醛酮还原酶的重组菌粗酶体系为催化剂，并在该体系中添加辅助底物和初始辅酶NADP⁺实现辅酶NADPH的再生循环，同时催化（N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺DKTP不对称转化反应制备光学纯(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺，即(S)-DHTP；

所用的辅助底物为葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、乙醇、或果糖，浓度为10 g/L；辅酶NADPH初始添加量为0.005~0.2 mM；反应的底物为N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺，重组菌为表达醛酮还原酶基因的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)(pETCPAR4)，醛酮还原酶基因cpar4来自于近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC NO：M 203011，其基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1，该基因编码醛酮还原酶，催化不对称还原DKTP为(S)-DHTP的反应。

2.根据权利要求1所述通过醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺的方法，其特征在于步骤为：

（1）重组菌的构建：以近平滑假丝酵母（C. parapsilosis）CCTCC NO：M 203011基因组DNA作为PCR扩增反应模板，利用含有NdeI 限制性酶切位点的引物1：5'- CCCGCCCGCA TATGTCAGCT CAATTGAAAG TAAAC -3'和含有XhoI 限制性酶切位点的引物2：5'- GCCCGCTCGA GGTCATTGAA GTTGTTGAAG CCTG -3' 通过PCR反应扩增cpar4基因片段；

PCR反应体系：ddH₂O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L 的dNTP 0.5 μL，50 pmol/μL的引物1为 1 μL，50 pmol/μL的引物2 为1 μL，基因组DNA 5 μL，5U/μL 的Taq DNA polymerase 0.5 μL；

PCR反应过程为：94℃ 预变性5 min；94℃ 1 min，64℃ l min，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃延伸10 min；

近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）CCTCC NO：M 203011醛酮还原酶编码基因，其基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2；

利用限制性内切酶NdeI 和XhoI对扩增得到的cpar4基因与载体pET-21c进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接获得带有目的基因片断的重组质粒pETCPAR4；重组质粒转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3) 感受态细胞，通过含有100μg/mL 氨苄青霉素的LB平板筛选目的重组菌株E. coli BL21 (DE3) (pETCPAR4)；

（2）重组菌粗酶体系的制备：

LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH7.0；需要时使用前加入氨苄青霉素50 μg/mL，固体培养基添加1.5%琼脂粉；

挑取重组菌E. coli BL21 (DE3) (pETCPAR4)单菌落接种于3mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含50μg/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200 rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6；向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度1 mmol/L，在培养温度17℃下诱导培养12~15 h；

培养后的重组大肠杆菌细胞10,000 rpm离心10 min并用生理盐水洗涤三次后收集；菌体重新悬浮于pH 6.5、0.1M的磷酸钾缓冲液中，配置成含有湿细胞浓度为100 g/L的菌悬液，菌悬液经超声破碎后离心，所得上清液总可溶蛋白浓度5~20 g/L，作为粗酶体系用于不对称转化反应；

（3）(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺的合成：

2mL反应体系的组成：1mL pH 6.5、0.1 M的磷酸钾缓冲液，1mL粗酶体系，总可溶蛋白5~20 mg，10g/L辅助底物，1~6g/L 底物DKTP，0.005~0.2 mM NADP⁺；反应混合物于20~30℃振荡反应8h，反应后混合物用2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于产物(S)-DHTP分析。