CN106399398A - (r)‑3,5‑双(三氟甲基)苯乙醇的生物制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种(R)‑3,5‑双(三氟甲基)苯乙醇(Ⅰ)的生物制备方法。具体地，本发明方法包括以下步骤：(a)在液态反应体系中，以式Ⅱ化合物为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，从而形成式Ⅰ化合物；其中，所述反应体系中，式Ⅱ化合物浓度为50～1000g/L；和(b)任选地从步骤(a)反应后的反应体系中分离出式I化合物。本发明还提供了一种反应体系，包括：(i)水性溶剂；(ii)底物，所述底物为式II化合物；(iii)辅酶；(iv)羰基还原酶；(v)共底物；和(vi)用于辅酶再生的酶。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇的制备方法。
背景技术
阿瑞匹坦(Aprepitant，商品名Emend)，化学名为5-[2(R)-[1(R)-[3,5-Bis(trifluoromethyl)phenyl]ethoxy]-3(S)-(4-fluor ophenyl)morpholin-4-ylmethyl]-3,4-dihydro-2H-1,2,4-triazol-3-one，是由美国默克公司研发的一种神经激肽-1(NK-1)受体抑制剂，作为治疗癌症的辅助药物。该药于2003年经FDA批准在美国上市，于2014年获准在中国上市，主要用于预防和治疗化疗后引起的急性和延迟性恶心、呕吐症状。
阿瑞匹坦的结构式如下：
(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇是合成阿瑞匹坦的关键中间体，可通过生物催化法和化学合成法制备。化学法合成往往存在ee值不够高，催化剂有毒、腐蚀性强或者价格昂贵等不足之处。相较化学法，生物催化具有高选择性、且更加绿色，环保，经济。但目前专利CN102382780 A及CN 104212841 A中所提及的羰基还原酶只有在较低的底物浓度下，才具有较高的转化率。且在CN 104212841 A中为了提高底物浓度所使用的离子液体价格比较昂贵，且存在一些刺激抗生素耐药性等潜在危害，所以不适合工业化生产。Applied andEnvironmental Microbiology 2013,79(4),p1378-1384中报道来源于Microbacteriumluteolum JCM 9174羰基还原酶QNR对于奎宁环酮表现良好活性，但对于类似底物脂肪环酮则表现出较低的催化活性，因此仍未有相关文献报道将其用于芳香酮底物的还原，包括对于本发明中涉及的底物3,5-双(三氟甲基)苯乙酮。
发明内容
本发明目的是提供了一种(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇生物催化的制备方法。
本发明的第一方面提供了一种(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇的制备方法，包括步骤：
(a)在液态反应体系中，以式Ⅱ化合物为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，从而形成式Ⅰ化合物,即(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇；
其中，所述反应体系中，式Ⅱ化合物浓度为50～1000g/L；和
(b)任选地从所述上一步骤的反应后的反应体系中分离出式I化合物。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式Ⅱ化合物浓度为60～700g/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式Ⅱ化合物浓度为80～600g/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式Ⅱ化合物浓度为100～500g/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式Ⅱ化合物浓度为200～450g/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式Ⅱ化合物浓度为250～400g/L。
在另一优选例中，所述的反应体系中，还存在共底物。
在另一优选例中，所述的共底物选自下组：异丙醇、葡萄糖、甲酸铵、或其组合。
在另一优选例中，所述的反应体系中，共底物的浓度为5％～50％。
在另一优选例中，所述的反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶。
在另一优选例中，所述的用于辅酶再生的酶选自下组：醇脱氢酶，甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、或其组合。
在另一优选例中，步骤(a)中，温度为10℃-50℃，较佳地20℃-40℃，更佳地25℃-35℃。
在另一优选例中，步骤(a)中，时间为0.1-240小时，较佳地0.5-120小时，更佳地1-72小时。
在另一优选例中，步骤(a)中，pH为6-9，较佳地6.5-8.5，更佳地6.5-7.5。
在另一优选例中，所述的反应体系为发酵体系。
在另一优选例中，所述的反应体系中，羰基还原酶为游离形式的酶、固定化酶、或菌体形式的酶。
在另一优选例中，所述的反应体系为水性体系。
在另一优选例中，所述的反应体系含有选自下组的溶剂：水、醇、或其组合。
在另一优选例中，所述的反应体系还含有助溶剂。
在另一优选例中，所述的助溶剂选自下组：二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，甲苯、丙酮、或其组合。
在另一优选例中，所述助溶剂的浓度为5～50％。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述的分离包括：加入异丙醇，离心菌体，部分浓缩，正庚烷萃取，浓缩有机层。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇的ee值≥90％，较佳地≥95％，更佳地≥99％。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，≥80％(较佳地≥85％，更佳地≥90％)式II化合物被转化为(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述反应后的反应体系中，式I化合物的浓度50～1000g/L。
在另一优选例中，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Microbacterium luteolum JCM 9174羰基还原酶QNR，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(ii)对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的羰基还原酶QNR的编码基因序列选自下组：
(a)SEQ ID NO.1所示的序列(NCBI的登录号为AB733448)；
(b)与(a)限定的序列互补的多核苷酸；或
(c)与(a)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
在另一优选例中，所述羰基还原酶基因构建在表达载体上。
在另一优选例中，所述的辅酶选自：还原性辅酶、氧化性辅酶，或其组合。
在另一优选例中，所述还原性辅酶选自NADH、NADPH、或其组合。
在另一优选例中，所述氧化性辅酶选自NAD、NADP、或其组合。
在另一优选例中，所述NAD用量与底物用量比率为0.1％～1.5％(w/w)；较佳地0.2％～0.9％(w/w)。
在另一优选例中，所述用于辅酶再生的酶为醇脱氢酶，其基因选自：
(d)SEQ ID NO.3所示的序列(NCBI的登录号为AB213459)；
(e)与(d)限定的序列互补的多核苷酸；或
(f)与(d)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
在另一优选例中，所述用于辅酶再生的酶的基因构建在表达载体上。
本发明第二方面提供了一种反应体系，所述反应体系包括：
(i)水性溶剂；
(ii)底物，所述底物为式II化合物；
(iii)辅酶；
(iv)羰基还原酶；
(v)共底物；和
(vi)用于辅酶再生的酶。
在另一优选例中，在所述的反应体系中，式Ⅱ化合物浓度为50～1000g/L。
本发明第三方面提供了一种制备(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇的方法，包括步骤：使用本发明第二方面所述的反应体系，在适合酶催化的条件下，进行酶促反应，从而制得(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇，即式I化合物：
在另一优选例中，在所述的反应体系中，式Ⅱ化合物浓度为50～1000g/L。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了化合物(Ⅰ)的消旋体手性图谱。
图2显示了羰基还原酶催化所得化合物(Ⅰ)与消旋体的比较。
图3显示了羰基还原酶催化所得化合物(Ⅰ)的ee值。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现一种(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇(Ⅰ)的生物制备方法。具体地，本发明的生物制备方法以3,5-双(三氟甲基)苯乙酮为原料/底物，以羰基还原酶为生物催化剂，在辅酶的存在下，即使在高浓度的底物(如50～1000g/L)条件下，也能够非常高效地制备获得具有立体构象的式I化合物。本发明仅需萃取操作，操作简单，成本低廉，绿色环保，更适合工业化生产具有高化学纯度和高光学纯度关键中间体(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇，以用于阿瑞匹坦、福沙匹坦等药品的制备。在此基础上完成了本发明。
在一具体优选例中，本发明人利用来源于Microbacterium luteolum JCM9174羰基还原酶作为代表性的羰基还原酶时，通过在反应体系中偶联辅酶再生，从而显著提高了反应体系对有机溶剂、底物的耐受性，这样可以大幅提高了底物浓度，即使当反应体系放大百克级时，底物浓度可高达350g/L(1.36mol/L)或更高(达到了现有生物催化方法中同类底物浓度最高级别)，也能够非常高效地制备获得具有立体构象的式I化合物(ee值≥98％、99％、或更高)，从而极大地提高生产效率，降低生产成本。此外，本发明方法大幅简化了后续处理，而且与化学合成法相比，显著减少或消除了各类污染性化学品的使用，从而显著降低了环境污染风险。
术语
羰基还原酶
本发明中，“羰基还原酶”是能够立体选择性催化潜手性酮不对称还原得到手性醇的酶。
在本发明中，所述的羰基还原酶可以是野生型的或突变型的。此外，可以分离的，也可以是重组的。
可用于本发明的羰基还原酶可以来自不同物种。例如，来自微杆菌属，更佳地来自Microbacterium luteolum的羰基还原酶。此外，与上述羰基还原酶有类似活性或同源性(如≥80％，较佳地≥90％，更佳地较佳地≥95％)的酶(包括来自其他物种的酶)也在本发明范围之内。
在本发明中，一种代表性的羰基还原酶为微杆菌属luteolum JCM 9174(Microbacterium luteolum JCM 9174)的羰基还原酶。
一种典型的羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.:2所示，其编码基因如SEQ IDNo.:1所示。
由于密码子的简并性，编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID NO.1。本领域技术人员可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来获得该碱基序列的同系物，本发明涵盖这些同系物，只要其表达的重组酶保持对3-奎宁酮的催化还原活性即可。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ ID NO.1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
本发明的羰基还原酶还包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。
反应体系中可以用上述羰基还原酶的湿菌体、粗酶液、粗酶粉或者纯酶等。为获得较高的转化效率，优选使用粗酶液。羰基还原酶的用量与底物用量比率优选为1％～6％(w/w)或者休止细胞菌体的质量与底物的质量比率为10～100％。
辅酶
本发明中，“辅酶”是指能够实现氧化还原反应中电子传递的辅酶。
典型地，本发明的辅酶为还原性辅酶NADH、NADPH或氧化性辅酶NAD+、NADP+。由于还原性辅酶的价格成本昂贵，优选选择氧化性辅酶NAD+、NADP+。
当选择氧化性辅酶时，需要选择实现辅酶再生的方法，主要包括三种(1)葡萄糖脱氢酶与共底物葡萄糖；(2)醇脱氢酶与共底物异丙醇，(3)甲酸脱氢酶与共底物甲酸铵。
在一个优选实施例中，辅酶为NAD+，辅酶再生体系为醇脱氢酶，本发明优选醇脱氢酶与共底物异丙醇，醇脱氢酶的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示(NCBI的登录号为AB213459)。NAD+用量与底物用量比率为0.2％～0.9％(w/w)，异丙醇的用量为缓冲液体积的5％-30％(v/v)。缓冲体系为磷酸缓冲盐，浓度为0.1mol/L。缓冲液的pH为6-8，优选为6.5-7.5。
助溶剂
本发明中，可以在反应体系中添加或不添加助溶剂。
如本文所用，术语“助溶剂”是指难溶性物质与加入的第三种物质在溶剂中形成可溶性分子间的络合物、缔合物或复盐等，以增加难溶性物质在溶剂中的溶解度。这种第三种物质称为助溶剂。
本发明中，底物化合物3,5-双三氟甲基苯乙酮难溶于水，当底物浓度增大时，严重影响反应转化率。因此，需通过加入助溶剂提高底物溶解性，以改善反应转化情况。可选的助溶剂为二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇，乙腈，甲苯、丙酮，浓度优选为5-50％(v/v)，优选为二甲基亚砜，甲醇，乙醇，异丙醇。
生物制备方法
本发明提供了一种(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇的制备方法，包括步骤：
(a)在液态反应体系中，以式Ⅱ化合物为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，从而形成式Ⅰ化合物,即(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇；
其中，所述反应体系中，式Ⅱ化合物浓度为50～1000g/L；和
(b)任选地从所述上一步骤的反应后的反应体系中分离出式I化合物。
在本发明中，上述的反应可以偶联或不偶联辅酶再生体系。
优选地，上述反应是在同一体系中偶联辅酶再生系统，从而进一步提高生产效率，降低生产成本并提高对底物的耐受性。
反应体系
本发明还提供了一种用于本发明所述生物制备方法的反应体系。
一种典型的一种反应体系，包括：
(i)水性溶剂；
(ii)底物，所述底物为式II化合物；
(iii)辅酶；
(iv)羰基还原酶；
(v)共底物；和
(vi)用于辅酶再生的酶。
在本发明的优选反应体系中，还偶联有辅酶再生系统，从而进一步提高生产效率，降低生产成本并提高对底物的耐受性。
此外，在本发明第一方面中所述的各类优选特征或其组合，同样适用于本发明所述的反应体系。
本发明还提供了所述本发明反应体系的应用，即用于制备(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇，它包括步骤：使用所述的反应体系中，在适合酶催化的条件下，进行酶促反应，从而制得(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇，即式I化合物：
由于本发明的反应体系和方法减少了或消除了各类污染性化学品的使用，也不必使用昂贵的立体结构分拆试剂，因此不仅显著降低了环境污染风险，而且成本低廉。
本发明的主要优点在于：
(1)利用来源于羰基还原酶(如Microbacterium luteolum JCM 9174的羰基还原酶)的新型催化反应体系，通过生物催化还原高效进行生产。
(2)本发明适合工业化生产具有高化学纯度和高光学纯度的阿瑞匹坦、福沙匹坦的关键中间体(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇(Ⅰ)。
(3)本发明方法和反应体系有高立体选择性、高催化活性、以及对有机溶剂的高耐受性、对底物的耐受性，从而可以在极高的底物浓度下，进行大规模生产。当反应体系放大百克级时，底物浓度如(可达350g/L，1.36mol/L或更高)，是现有生物催化方法中底物浓度最高的。
(4)本发明极大地提高生产效率，降低生产成本。
(5)本发明方法大幅简化了后续处理。后处理仅需萃取操作，操作简单，。
(6)绿色环保。与化学合成法相比，本发明显著减少或消除了各类污染性化学品的使用，从而显著降低了环境污染风险。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
材料
化合物(Ⅰ)购自上海翰鸿化工有限公司。
来源于Microbacterium luteolum JCM 9174的羰基还原酶(QNR)，通过商业化的全基因合成得到编码基因，然后将编码基因构建入表达载体，导入宿主菌，诱导表达得到。
方法
1.酶的制备方法
通过本领域常规技术，将上述醇脱氢酶与上述羰基还原酶构建在同一pET28a(+)载体上，然后导入宿主大肠杆菌BL21，通过诱导表达，获得重组基因工程菌。可直接使用离心获得的湿菌体，也可将其破壁获得粗酶，用于后续的生物转化反应。
2.生物催化还原化合物3,5-双三氟甲基苯乙酮制备化合物(Ⅰ)的方法
本发明提供了一种来源于Microbacterium luteolum JCM 9174的羰基还原酶(QNR)催化还原化合物3,5-双三氟甲基苯乙酮制备化合物(Ⅰ)的方法。反应式如下：
其中所述的生物催化体系包括有羰基还原酶，辅酶。本发明中所述的羰基还原酶编码基因序列为SEQ ID NO.1，来源于M.luteolumJCM 9174(QNR)，羰基还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。根据本领域一般常识，上述羰基还原酶基因可通过商业化的全基因合成得到。
根据上述优选体系，所述制备方法的实施过程如下：将底物充分溶解在助溶剂，如二甲基亚砜或异丙醇，然后加入到磷酸缓冲液中，搅拌均匀后，加入湿菌体、粗酶液、粗酶粉或纯酶，加入辅酶NAD+，共底物异丙醇，维持在20℃～40℃，TLC或HPLC监控，至反应转化率达到98％以上。反应终止后，向反应液中加入异丙醇，离心或过陶瓷膜，除去菌体，取上清液，上清液用有机溶剂萃取，有机溶剂可选为甲基叔丁基醚、甲苯、乙酸乙酯、乙酸异丙脂、正庚烷、二氯甲烷，2-甲基四氢呋喃、正丁醇。萃取水层2-3次，合并有机相；用饱和食盐水洗涤2～3次，浓缩后得到白色固体。
体系中底物化合物3,5-双三氟甲基苯乙酮的终浓度为50-400g/L，优选为200-300g/L。反应温度为20-40℃，转速为200rpm/min，反应时间约3-15h，根据底物浓度而有所变化。
3.(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇的手性监测方法：
HPLC条件：Daicel IC-3(250×4.6mm，3μm)；流速0.8ml/min；流动相：正己烷:异丙醇＝99:1；紫外检测波长260nm；柱温25℃；样品溶于甲醇，浓度10mg/ml；进样体积2μl。
4.(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇的反相监测方法：
HPLC条件：phenomenex Gemini 5u C18 110A，250×4.6mm,5μm；流速：1ml/min；流动相梯度如下表；紫外检测波长：260nm；柱温：30℃；样品浓度：10mg/ml；进样体积10μl。S-39的保留时间为12.3min。
流动相梯度：
| 时间(min) | H2O-0.1％TFA(％) | ACN-0.1％TFA(％) |
| 0 | 80 | 20 |
| 15 | 20 | 80 |
| 35 | 20 | 80 |
| 35.1 | 80 | 20 |
| 40 | 20 | 80 |
实施例1：羰基还原酶工程菌的构建
将QNR目的基因，醇脱氢酶基因委托商业化公司进行全基因合成，克隆入pET28a(+)载体，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，平板培养，挑取阳性转化子单菌落并提取质粒测序确定后，提取重组质粒，导入BL21(DE3)菌株中，LB培养，获得可以诱导表达重组羰基还原酶与醇脱氢酶的基因工程菌。
实施例2：重组羰基还原酶，醇脱氢酶的制备
将上一步保存于甘油中的基因工程菌，接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm，培养13h，得到种子培养基，将种子培养液按1.5％的比例接种到含50ug/ml卡那霉素抗性的液体培养基上，然后37℃，220rmp培养至OD600值>2.0，加入终浓度为1.0％乳糖，降温至25℃，继续培养3h，加入终浓度为0.5％的乳糖，培养20h，放罐，离心得菌体，为生物转化做准备。
培养基配方为：
| 原材料 | 质量含量(％) |
| 酵母提取物 | 2.4 |
| 大豆蛋白胨 | 1.2 |
| 氯化钠 | 0.3 |
| 甘油 | 0.5 |
| 磷酸氢二钾 | 0.2 |
| 七水硫酸镁 | 0.05 |
实施例3：(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇(化合物Ⅰ)的制备
取化合物3,5-双三氟甲基苯乙酮(100g)，溶解于异丙醇(150ml)中，再加入0.1M的磷酸盐缓冲液(200ml)，加入NAD+(0.2g)，加入菌体(20g)，25℃，220rpm，摇床反应，HPLC监控反应转化率>98％时，终止反应。
加入异丙醇(100ml)，离心，取上清液，部分浓缩异丙醇，正庚烷(400ml)萃取，有机溶剂(100ml×2)萃取水层，合并有机层，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得白色固体93.2g，收率92.4％，ee值100％。
对比实施例：QNR还原结构类似物
取化合物Ⅱ(1g)，溶解于异丙醇(12ml)中，加入0.1M的磷酸盐缓冲液(40ml)，加入NAD+(0.1g)，加入上述发酵所得QNR菌体(0.5g)，25℃，220rpm，摇床反应，反应24h,HPLC监控反应转化率44％，终止反应。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海医药工业研究院
中国医药工业研究总院
<120> (R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇的生物制备方法
<130> P2016-1653
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 787
<212> DNA
<213> Microbacterium luteolum JCM 9174
<400> 1
atgcggctgg agaataagaa ggccatcgtc accggcggcg ccggcggcat cggccgcgcc 60
acgtcgatcg cgctcgccgc ggagggcgct gcggtcgccg tcgtcgacct gaacgtcgaa 120
gccgccgagg ccgtcgcggc cgagatccgc gaggcgggcg gcacggccgt cgcgatctcc 180
gccgacgtct ccagcgagcc cgacatcgag cgggtcatcg cgaccgccgt ggccgagttc 240
ggcggtgtgg acgtcgtctt caacaatgcg ggcatcatcc gccgcacgac cgccgtcgag 300
acgaccgtcg aggagtggga ccgcgtcttc ggcgtgaacg tgcgctcgat cttcctcatg 360
tgcaagcaca tcgtgccgat catggaggcc gcgggcggcg gctcgatcat caacaccgga 420
tccggctggg ggctcaaggg cggcggccag gccatctcgt actgcgcctc gaagggcgcc 480
gtggtgaaca tgacccgtgc gctggcgatc gaccacgggc cggccggcat ccgcgtcaac 540
tcggtcaatc cgggcgacgt caacaccggg atgctgcgcg aagaggcccg tcagctggcg 600
caggacacga acgcgttcct cgccgaggcc gccgaccgtc cgctgcgtcg gatgggcgag 660
ccgcacgagg tcgcgcaggc cgtggtctgg ctcgcgagcg acgactcgtc ctacgtcacg 720
ggctcggcgc tcgtggtcga cggcggcggg atcgcgtagc gccggaggtc gcgcgtccgc 780
cggtgtc 787
<210> 2
<211> 252
<212> PRT
<213> Microbacterium luteolum JCM 9174
<400> 2
Met Arg Leu Glu Asn Lys Lys Ala Ile Val Thr Gly Gly Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ile Gly Arg Ala Thr Ser Ile Ala Leu Ala Ala Glu Gly Ala Ala Val
20 25 30
Ala Val Val Asp Leu Asn Val Glu Ala Ala Glu Ala Val Ala Ala Glu
35 40 45
Ile Arg Glu Ala Gly Gly Thr Ala Val Ala Ile Ser Ala Asp Val Ser
50 55 60
Ser Glu Pro Asp Ile Glu Arg Val Ile Ala Thr Ala Val Ala Glu Phe
65 70 75 80
Gly Gly Val Asp Val Val Phe Asn Asn Ala Gly Ile Ile Arg Arg Thr
85 90 95
Thr Ala Val Glu Thr Thr Val Glu Glu Trp Asp Arg Val Phe Gly Val
100 105 110
Asn Val Arg Ser Ile Phe Leu Met Cys Lys His Ile Val Pro Ile Met
115 120 125
Glu Ala Ala Gly Gly Gly Ser Ile Ile Asn Thr Gly Ser Gly Trp Gly
130 135 140
Leu Lys Gly Gly Gly Gln Ala Ile Ser Tyr Cys Ala Ser Lys Gly Ala
145 150 155 160
Val Val Asn Met Thr Arg Ala Leu Ala Ile Asp His Gly Pro Ala Gly
165 170 175
Ile Arg Val Asn Ser Val Asn Pro Gly Asp Val Asn Thr Gly Met Leu
180 185 190
Arg Glu Glu Ala Arg Gln Leu Ala Gln Asp Thr Asn Ala Phe Leu Ala
195 200 205
Glu Ala Ala Asp Arg Pro Leu Arg Arg Met Gly Glu Pro His Glu Val
210 215 220
Ala Gln Ala Val Val Trp Leu Ala Ser Asp Asp Ser Ser Tyr Val Thr
225 230 235 240
Gly Ser Ala Leu Val Val Asp Gly Gly Gly Ile Ala
245 250
<210> 3
<211> 859
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggagttatc cgacaggtgt cggataactg aagggagatt ttcatggctc agtacgacgt 60
cgccgaccgg tccgcgatcg tgaccggagg cggctcgggc atcgggcgcg ccgtggcgct 120
cactctcgcg gcgagcggcg cagccgtcct cgtcaccgac ctgaacgagg agcacgcgca 180
ggccgtcgtg gccgagatcg aggccgcggg cggtaaggcc gccgcgctcg cgggcgacgt 240
gaccgacccc gcgttcggcg aggcgagcgt cgccggggcg aacgctctcg cgcccctcaa 300
gatcgcggtc aacaacgcgg gcatcggcgg cgaggccgcc acggtcggcg actactcgct 360
cgacagctgg cgcacggtga tcgaggtcaa cctcaacgcc gtgttctacg ggatgcagcc 420
gcagctgaag gccatggccg ccaacggcgg cggtgcgatc gtcaacatgg cgtccatcct 480
gggaagcgtc ggcttcgcca actcgtcggc ctacgtcacg gccaagcacg cgctgctcgg 540
tctcacccag aacgccgcgc tcgagtacgc cgccgacaag gtgcgcgtcg tcgcggtcgg 600
ccccggcttc atccgcaccc cgctcgtgga ggccaacctc tccgccgacg cgctggcgtt 660
cctcgagggc aagcacgccc tcggccgcct gggcgagccg gaagaggtcg cctcgctggt 720
cgcgttcctc gcctccgacg ccgcgagctt catcaccggc agctaccacc tggtggacgg 780
cggctacacc gcccagtgac cgggcgacag cccgtatcgt gcacggtcgc gctcccttag 840
gctgaggagc gtgaccccg 859
Claims (10)
1.一种(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在液态反应体系中，以式Ⅱ化合物为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，从而形成式Ⅰ化合物,即(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇；
其中，所述反应体系中，式Ⅱ化合物浓度为50～1000g/L；和
(b)任选地从所述上一步骤的反应后的反应体系中分离出式I化合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述羰基还原酶选自下组：
(i)来源于Microbacterium luteolum JCM 9174羰基还原酶QNR，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示；
(ii)对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的羰基还原酶QNR的编码基因序列选自下组：
(a)SEQ ID NO.1所示的序列(NCBI的登录号为AB733448)；
(b)与(a)限定的序列互补的多核苷酸；或
(c)与(a)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
4.根据权利要求1-3中任一所述的制备方法，其特征在于，所述的辅酶选自：还原性辅酶、氧化性辅酶，或其组合。
5.根据权利要求1-3中任一所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述用于辅酶再生的酶为醇脱氢酶，其基因选自：
(d)SEQ ID NO.3所示的序列(NCBI的登录号为AB213459)；
(e)与(d)限定的序列互补的多核苷酸；或
(f)与(d)限定的序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系中，还存在共底物。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的反应体系还含有助溶剂。
9.一种反应体系，其特征在于，所述反应体系包括：
(i)水性溶剂；
(ii)底物，所述底物为式II化合物；
(iii)辅酶；
(iv)羰基还原酶；
(v)共底物；和
(vi)用于辅酶再生的酶。
10.一种制备(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇的方法，其特征在于，包括步骤：使用如权利要求9所述的反应体系，在适合酶催化的条件下，进行酶促反应，从而制得(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇，即式I化合物：
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