CN110129382A

CN110129382A - 一种羰基还原酶催化合成手性邻位卤代-α-苯乙醇的方法

Info

Publication number: CN110129382A
Application number: CN201910062321.7A
Authority: CN
Inventors: 李爱朋; 张连兵
Original assignee: Northwestern Polytechnical University
Current assignee: Hangzhou wendejie Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-01-23
Filing date: 2019-01-23
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2039-01-23
Also published as: CN110129382B

Abstract

本发明公开了羰基还原酶BaSDR1或含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌在将潜手性邻位卤代苯乙酮不对称还原制备手性邻位卤代‑α‑苯乙醇中的应用；潜手性邻位卤代苯乙酮的结构通式如式I所示：(I)；其中，X为F，Cl和Br中的一种；R1为氢或卤素。能够合成高光学纯度手性醇，绿色高效、高立体选择性。

Description

一种羰基还原酶催化合成手性邻位卤代-α-苯乙醇的方法

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种羰基还原酶催化合成手性邻位卤代-α-苯乙醇的方法。

背景技术

手性化合物的对映异构体往往具有不同的功效或其作用效果相差甚远，因此，单一对映体的合成越来越受关注。作为重要的手性合成砌块，手性邻位卤代-α-苯乙醇被广泛应用于手性药物、精细化学品和农用化学品等高附加值化学产品的合成。例如，(S)-1-(2-氟苯基)乙醇是α7nChR激动剂JN403合成的前体手性化合物；(S)-1-(2-溴-4-氟苯基)乙醇是老年痴呆潜在治疗药物γ-secretase抑制剂合成的重要手性中间体；而(R)-和(S)-1-(2-氯苯基)乙醇则分别是支气管哮喘治疗药物氯丙那林和Polo样激酶1(Polo-likeKinase 1)抑制剂合成的关键手性中间体。因此，手性邻位卤代-α-苯乙醇拥有广阔的市场和应用前景。

手性邻位卤代-α-苯乙醇类化合物的广阔市场需求注定其合成工艺开发成为业界研究的热点。手性源合成、外消旋体拆分和不对称还原等多种方法被开发用于手性卤代-α-苯乙醇类化合物的合成。其中，化学不对称还原法因其能够起到简化合成工艺、缩短合成步骤和提高合成产率的作用，且理论上能100％地将底物转化为单一对映体手性醇，被认为是最有应用价值的合成方法。然而，化学不对称还原立体选择性往往不理想，产品光学纯度常无法达到要求；且其反应过程常需要剧烈反应条件，易引起副反应的发生；此外，有毒有害过渡金属催化剂和大量有机溶剂反应介质的使用也是化学不对称还原的短板。

生物法催化的潜手性酮不对称还原在化学选择性、区域选择性和立体选择性方面更具优势，产物光学纯度高；此外，生物催化通常在温和条件下进行，避免了剧烈化学反应过程中化合物的异构化、差向异构化、消旋和重排等现象的发生。因此，生物催化法不对称还原已成为光学活性手性醇绿色合成的首选技术之一。

虽然手性邻位卤代-α-苯乙醇是一类重要的手性砌块化合物且生物催化在不对称还原潜手性酮合成手性醇方面已有许多成功应用，但是，有关生物催化高效高立体选择性合成手性邻位卤代-α-苯乙醇的案例却寥寥无几，当前能够用于手性邻位卤代-α-苯乙醇合成的生物催化方法屈指可数，根本无法满足市场多样的手性邻位卤代-α-苯乙醇合成需求。因此，建立新的生物催化合成手性邻位卤代-α-苯乙醇的方法十分迫切和必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种羰基还原酶催化合成手性邻位卤代-α-苯乙醇的方法，通过生物催化法绿色高效、高立体选择性合成手性邻位卤代-α-苯乙醇。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，羰基还原酶BaSDR1或含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌在将潜手性邻位卤代苯乙酮不对称还原制备手性邻位卤代-α-苯乙醇中的应用；潜手性邻位卤代苯乙酮的结构通式如式I所示：

其中，X为F，Cl和Br中的一种；R₁为氢或卤素。

本发明还公开了手性邻位卤代-α-苯乙醇的制备方法，以潜手性邻位卤代苯乙酮为底物，羰基还原酶BaSDR1或含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌全细胞为催化剂，在20～55℃下，于pH 5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化即得；其中，当选用羰基还原酶BaSDR1为催化剂时，还需加入辅酶，以NADH或NADPH为辅酶；

所述潜手性邻位卤代苯乙酮的结构通式如式I所示：

其中，X为F，Cl和Br中的一种；R₁为氢或卤素。

制备手性邻位卤代-α-苯乙醇的生物催化过程表示如下：

进一步地，该转化反应体系中潜手性邻位卤代苯乙酮底物的初始浓度为5～300mmol/L；所述羰基还原酶的浓度为0.1～2.0mg/mL，或者含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌的菌体的质量用量以菌体湿重计为10～400g/L。

进一步地，该转化反应体系中还添加有质量浓度为1～50％的醇或糖作为辅底物。

进一步地，糖为葡萄糖，葡萄糖的浓度为10％。

进一步地，该含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌为E.coli BL21(DE3)/pET30a-Basdr1。

进一步地，该羰基还原酶BaSDR1来源于菌株Bacillus aryabhattai NWPU-1801；该菌株由本实验室从土壤中筛选获得，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018700，保藏地址是中国武汉武汉大学，保藏时间是2018年10月22日。羰基还原酶BaSDR1氨基酸序列为如下序列之一：(1)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；(2)SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列缺失、插入或替换一个或几个氨基酸的序列，且仍具有羰基还原酶BaSDR1的活性。

菌株Bacillus aryabhattai NWPU-1801的筛选过程如下：在9.0mL 0.85％的生理盐水中加入1.0g取自西安本地的土样，充分振荡使其成均匀的土壤悬液，静置；吸取1.0mL上清接种于装有49ml富集培养基的250mL三角瓶中，置于30℃，220rpm的摇床培养24h，然后吸取1.0mL该培养液转接到新鲜的富集培养基中，继续培养24h；如此进行三轮富集，将富集培养液稀释多个梯度并涂布于平板筛选培养基，30℃培养箱中培养24h，获得单菌落；挑选长势良好的单菌落转接到斜面培养基上，在30℃培养箱中培养24h；将斜面培养基上的菌种转接到发酵培养基中，在30℃，220rpm下培养24h，离心收集菌体，并用0.85％生理盐水洗涤两次，置于-80℃保存备用。将0.10g冻存的湿菌体细胞重悬于1.0mLNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液(100mM,pH 7.5)，加入10mM 2'-氟代苯乙酮，于30℃，220rpm下反应12h；反应结束后，离心并用乙酸乙酯萃取上清液中的底物及产物，离心移取上层有机相进行手性气相色谱分析确定转化率及产物的光学纯度。表明该菌株含有催化底物转化的酶。

进一步地，该羰基还原酶BaSDR1的制备方法如下：培养工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30a-Basdr1，诱导获得重组羰基还原酶。

本发明还公开了羰基还原酶BaSDR1，其氨基酸序列为如下序列之一：(1)如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列缺失、插入或替换一个或几个氨基酸的序列，且仍具有羰基还原酶BaSDR1的活性。

本发明还公开了羰基还原酶BaSDR1基因的制备方法，该方法包括如下：分别以SEQID No：3所示核苷酸和SEQ ID No：4所示核苷酸为上、下游引物，以Bacillus aryabhattaiNWPU-1801基因组DNA为模板，利用PCR进行基因扩增，获得全长885bp的羰基还原酶基因序列。

本发明一种羰基还原酶催化合成手性邻位卤代-α-苯乙醇的方法具有如下优点：羰基还原酶BaSDR1或含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌不对称还原制备手性邻位卤代-α-苯乙醇具有显著优点，能够合成高光学纯度手性醇，ee达99％。该方法催化剂易于制备、反应条件温和、底物适应性广、无副反应、环境友好；为手性邻位卤代-α-苯乙醇生产提供了可选择的环境友好的生物催化方法，具有很好的工业化应用开发前景。

附图说明

图1为羰基还原酶BaSDR1编码基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2为羰基还原酶BaSDR1分离纯化SDS-PAGE图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明一种羰基还原酶催化合成手性邻位卤代-α-苯乙醇的方法作进一步的解释说明。

本发明公开了羰基还原酶BaSDR1或含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌在将潜手性邻位卤代苯乙酮不对称还原制备手性邻位卤代-α-苯乙醇中的应用；所述潜手性邻位卤代苯乙酮的结构通式如式I所示：

其中，X为F，Cl和Br中的一种；R₁为氢或卤素。

羰基还原酶BaSDR1或含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌的具体应用如下，以潜式手性邻位卤代苯乙酮为底物，羰基还原酶BaSDR1或含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌全细胞为催化剂，在20～55℃下，于pH 5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化即得；其中，当选用羰基还原酶BaSDR1为催化剂时，还需加入辅酶；以NADH或NADPH为辅酶；

潜手性邻位卤代苯乙酮的结构通式如式I所示：

生物催化过程表示如下：

其中，X为F，Cl和Br中的一种；R₁为氢或卤素。

上述转化反应体系中潜手性邻位卤代苯乙酮底物的初始浓度为5～300mmol/L；羰基还原酶的浓度为0.1～2.0mg/mL，或者含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌的菌体的质量用量以菌体湿重计为10～400g/L。

转化反应体系中还添加有1～50％的醇或糖作为辅底物。所述糖为葡萄糖，葡萄糖的质量浓度为10％。辅底物还可以为乙醇、异丙醇、麦芽糖、葡萄糖、半乳糖或木糖。

上述羰基还原酶BaSDR1来源于菌株BacillusaryabhattaiNWPU-1801。该菌株由本实验室从土壤中筛选获得，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018700，保藏地址是中国武汉，武汉大学，保藏时间是2018年10月22日。

菌株Bacillus aryabhattai NWPU-1801的筛选过程如下：在9.0mL0.85％的生理盐水中加入1.0g取自西安的土样，充分振荡使其成均匀的土壤悬液，静置；吸取1.0mL上清接种于装有49ml富集培养基的250mL三角瓶中，置于30℃，220rpm的摇床培养24h，然后吸取1.0mL该培养液转接到新鲜的富集培养基中，继续培养24h；如此进行三轮富集，将富集培养液稀释多个梯度并涂布于平板筛选培养基，30℃培养箱中培养24h，获得单菌落；挑选长势良好的单菌落转接到斜面培养基上，在30℃培养箱中培养24h；将斜面培养基上的菌种转接到发酵培养基中，在30℃，220rpm下培养24h，离心收集菌体，并用0.85％生理盐水洗涤两次，置于-80℃保存备用。将0.10g冻存的湿菌体细胞重悬于1.0mL Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(100mM,pH 7.5)，加入10mM 2'-氟代苯乙酮，于30℃，220rpm下反应12h；反应结束后，离心并用乙酸乙酯萃取上清液中的底物及产物，离心移取上层有机相进行手性气相色谱分析确定转化率及产物的光学纯度。

羰基还原酶BaSDR1的基因是通过聚合酶链式反应(PCR)技术从BacillusaryabhattaiNWPU-1801基因组中克隆获得。具体制备方法为：分别以SEQ ID No：3所示核苷酸序列GCTGAGGATCCATGTCAAAGTTAAATAATCC和SEQ ID No：4所示核苷酸序列GCATCCTCGAGTTAAGCTAGTTCTATTCCGC为上、下游引物，以Bacillus aryabhattaiNWPU-1801基因组DNA为模板，利用PCR进行基因扩增，获得全长885bp的羰基还原酶基因序列。该羰基还原酶基因核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，该序列编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNo：2所示。

如本领域技术人员所知，本发明的羰基还原酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID No：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其它任何核苷酸序列。

任何对SEQ ID NO：1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与所述核苷酸序列具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。

羰基还原酶BaSDR1基因的制备方法如下：分别以SEQ ID No：3所示核苷酸和SEQID No：4所示核苷酸为上、下游引物，以Bacillus aryabhattai NWPU-1801基因组DNA为模板，利用PCR进行基因扩增，获得全长885bp的羰基还原酶基因序列。

上述羰基还原酶BaSDR1的编码基因由重组表达载体携带。这些重组载体可通过本领域常规方法将本发明的编码羰基还原酶BaSDR1的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-30a。较佳地，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的羰基还原酶基因产物Basdr1与载体pET-30a连接构建本发明的羰基还原酶基因重组表达质粒pET30a-Basdr1。

上述羰基还原酶BaSDR1可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的羰基还原酶基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将重组质粒pET30a-Basdr1转化至E.coliBL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30a-Basdr1。

上述羰基还原酶BaSDR1制备的步骤包括：培养本发明的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30a-Basdr1，诱导获得重组羰基还原酶。其中，所述的培养工程菌所用的培养基可以是本领域可使重组工程菌生长并产生本发明的羰基还原酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使工程菌能够生长并产生羰基还原酶BaSDR1即可。优选下述方法：将本发明涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET30a-Basdr1接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5～0.8时，在终浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组羰基还原酶。

本发明还公开了羰基还原酶BaSDR1或含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌在不对称还原制备手性邻位卤代-α-苯乙醇中的应用。

实施例1：菌株Bacillus aryabhattaiNWPU-1801的分离与鉴定：

(1)分离：

在9.0mL 0.85％的生理盐水中加入1.0g取自西安当地的土样，在涡流振荡器上充分振荡使其成均匀的土壤悬液，静置10min；吸取1.0mL上清接种于装有49ml富集培养基的250mL三角瓶中，置于30℃，220rpm的摇床培养24h，然后吸取1.0mL该培养液转接到新鲜的富集培养基中，继续培养24h；如此进行三轮富集，将富集培养液稀释多个梯度并涂布于平板筛选培养基，30℃培养箱中培养24h，获得单菌落；

富集培养基以1.0g/L 2'-氟代苯乙酮为唯一碳源，其它组成如下，以终浓度表示：(NH₄)₂SO₄5.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，NaCl 1.0g/L，K₂HPO₄2.0g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，以蒸馏水配制，用1.0M的盐酸或NaOH溶液调节pH至7.2；

挑取的单菌落接种到发酵培养基，组份的终浓度如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取粉5.0g/L，NaCl 10g/L，pH 7.2；30℃下，摇瓶转速220rpm，培养24h，离心后悬浮于磷酸缓冲液体系中，加入2'-氟代苯乙酮作为底物，进行转化。用手性毛细管气相色谱法分析具有催化2'-氟代苯乙酮生成相应邻位氟代-α-苯乙醇的菌株即为所述的微生物菌株NWPU-1801。

(2)16S rDNA序列鉴定：

用DNA提取试剂盒提取Bacillus aryabhattaiNWPU-1801菌体的全基因组DNA，以提取到的细胞总DNA为模版，利用本领域公知的通用引物扩增菌株的16S rDNA基因，经测序确认该菌株16S rDNA的扩增产物实际长度为1367bp，其序列如序列表中SEQ ID NO：5所示。

该序列与GenBank中相关数据进行相似性分析，结果表明，菌株NWPU-1801与Bacillus aryabhattai的部分菌株序列同源性较高。菌株NWPU-1801与Bacillusaryabhattai HBUM07016、Bacillus aryabhattai RW120等菌株的系统发育关系最近，Bacillus aryabhattai HBUM07016在GenBank登记号为No.MF662442，序列同源性99％；Bacillus aryabhattai RW120在GenBank登记号为No.MH010171，序列同源性99％。确定该菌株为Bacillus aryabhattai，该菌株命名为Bacillus aryabhattaiNWPU-1801。

实施例2：羰基还原酶BaSDR1编码基因的获得、重组质粒构建及转化大肠杆菌：

用DNA提取试剂盒提取Bacillus aryabhattaiNWPU-1801菌体的全基因组DNA，以提取到的细胞总DNA为模版，上游引物GCTGAGGATCCATGTCAAAGTTAAATAATCC和下游引物GCATCCTCGAGTTAAGCTAGTTCTATTCCGC为作用引物进行PCR扩增反应。PCR反应体系总体积50μL，各组分加入量为：5×PrimeSTAR^TM HS DNA polymerase Buffer 10μL，10mM dNTP混合液4μL，其中：dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM，浓度为50μM的上游引物、下游引物各1μL，基因组DNA 1μL，PrimeSTAR^TM HS DNApolymerase 0.5μL，无核酸水32.5μL。PCR反应条件为：预变性98℃ 1min，然后进入温度循环98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 1min，共30个循环，最后72℃延伸5min，终止温度为4℃。羰基还原酶基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果见附图1。其中，通道M为Maker；通道1为BaSDR1基因PCR扩增产物。测序分析结果表明，经上述过程扩增得到的核苷酸序列长度为885bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该序列编码一个完整的开放阅读框。利用软件对该基因序列进行分析，推知羰基还原酶基因编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

PCR产物由BamHI/XhoI进行双酶切，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，然后用T4连接酶将该片段同用相同限制性内切酶处理的商业化载体pET-30a连接，构建重组表达质粒pET30a-Basdr1。

将上述构建的重组表达载体pET30a-Basdr1转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET30a-Basdr1，涂布于含卡那霉素的平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆测序验证，结果表明重组表达载体pET30a-Basdr1成功转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)中，且羰基还原酶基因已成功克隆至pET-30a的BamHI和XhoI位点。

实施例3：羰基还原酶BaSDR1的诱导表达：

将上述实施例2构建的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30a-Basdr1接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以体积含量1％接种量接种到含50μg/mL卡那霉素的50mL LB培养基中，37℃，220rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，30℃诱导培养6h后，4℃、4000rpm离心10min收集菌体细胞，于-80℃贮存备用。

实施例4：羰基还原酶BaSDR1的分离纯化：

将实施例3收集的菌体细胞悬浮于10mLNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中，pH 8.0；Na₂HPO₄-NaH₂PO₄的摩尔浓度为100mM，振荡摇匀后置超声波下破碎。破碎液于12000rpm离心10min去除细胞碎片，收集上清液为粗酶液，用于酶的后续的分离纯化。纯化柱为Ni-NTA，装柱体积为5mL，先用上样平衡缓冲液平衡Ni-NTA柱，上样平衡缓冲液组成为20mM磷酸钠，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 7.4，以5mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液洗脱收集目标蛋白，洗脱缓冲液的组成如下：20mM T磷酸钠，500mM NaCl和500mM咪唑，pH 7.4；酶液用HiTrap脱盐柱进行脱盐，脱盐缓冲液为Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH 7.5，浓度100mM，所得纯酶液于4℃贮存备用。纯化后的酶液用SDS-PAGE进行分析，SDS-PAGE电泳见图2，其中通道M为蛋白Maker；通道1为BaSDR1纯酶。结果表明经Ni-NTA亲和层析，得到电泳纯的重组羰基还原酶BaSDR1。

实施例5：羰基还原酶BaSDR1不对称还原邻位氟代苯乙酮：

取实施例4中所得到的BaSDR1纯酶液，加入10mM邻位氟代苯乙酮作为底物，再分别加入100mg(10％，w/w)葡萄糖和2.5mM NADH作为辅底物和辅酶，组成总反应体积为1.0ml的转化反应体系，纯酶的终浓度为1.0mg/ml；于30℃恒温摇床振荡(220rpm)反应4h。反应液经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(S)-1-(2-氟苯基)乙醇的光学纯度99％，转化率95％。w/w表示质量浓度。

实施例6：羰基还原酶BaSDR1不对称还原邻位氟代苯乙酮：

取实施例4中所得到的BaSDR1纯酶液，加入5mM邻位氟代苯乙酮作为底物，再分别加入100mg(10％，w/w)葡萄糖和2.5mM NADH作为辅底物和辅酶，组成总反应体积为1.0ml的转化反应体系，BaSDR1纯酶终浓度为0.1mg/ml，于35℃恒温摇床振荡(220rpm)反应10h。反应液经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(S)-1-(2-氟苯基)乙醇的光学纯度99％，转化率82％。

实施例7：羰基还原酶BaSDR1不对称还原邻位氟代苯乙酮：

取实施例4中所得到的BaSDR1纯酶液，加入20mM邻位氟代苯乙酮作为底物，再分别加入200mg(20％，w/w)葡萄糖和2.5mM NADH作为辅底物和辅酶，组成总反应体积为1.0ml的转化反应体系，纯酶终浓度为2.0mg/ml，于35℃恒温摇床振荡(220rpm)反应6h。反应液经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(S)-1-(2-氟苯基)乙醇的光学纯度99％，转化率90％。

实施例8-23：重组大肠杆菌不对称还原邻位卤代苯乙酮：

在900μL、100mM的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液pH 7.5中，加入100mg，质量浓度为10％的葡萄糖作为辅底物，加入实施例3中所得到的湿菌体细胞，终浓度50g/L，再加入10mM潜手性邻位卤代苯乙酮底物，结构如式(I)所示。于35℃恒温摇床振荡(220rpm)反应一段时间。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值ee。所用气相色谱仪为福立GC 9790，色谱条件为：进样量1.0μl，进样口、检测器的温度均为240℃；载气为氮气。潜手性酮及其相应手性醇用手性毛细管气相色谱柱Hydrodexβ-TBDAc分析，均采用恒温程序。产物光学纯度ee_p(％)、转化率及检测温度如下表1所示：

表1重组大肠杆菌不对称还原邻位卤代苯乙酮的产物光学纯度和转化率

由表1可知，羰基还原酶BaSDR1或含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌能够特异性不对称还原邻位卤代苯乙酮，所得到手性邻位卤代-α-苯乙醇具有高光学纯度，且反应转化率高。

实施例24：重组大肠杆菌不对称还原邻位氟代苯乙酮：

在900μL、100mM的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中(pH 5.5)中，加入10mg(1％，w/w)葡萄糖作为辅底物，加入实施例3中所得到的湿菌体细胞，终浓度200g/L；再加入10mM邻位氟代苯乙酮底物。于35℃恒温摇床振荡(220rpm)反应4h。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(S)-1-(2-氟苯基)乙醇的光学纯度99％，转化率94％。

实施例25：重组大肠杆菌不对称还原邻位氟代苯乙酮：

在900μL、100mM的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中(pH 7.5)中，加入100mg(10％，w/w)葡萄糖作为辅底物，加入实施例3中所得到的湿菌体细胞，终浓度400g/L；再加入300mM邻位氟代苯乙酮底物。于40℃恒温摇床振荡(220rpm)反应12h。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(S)-1-(2-氟苯基)乙醇的光学纯度99％，转化率86％。在高浓度底物下湿菌体细胞也具有良好的催化性能。

实施例26：重组大肠杆菌不对称还原邻位氟代苯乙酮：

在900μL、100mM的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中(pH 10.5)中，加入500mg(50％，w/w)葡萄糖作为辅底物，加入实施例3中所得到的湿菌体细胞，终浓度200g/L；再加入10mM邻位氟代苯乙酮底物。于55℃恒温摇床振荡(220rpm)反应4h。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(S)-1-(2-氟苯基)乙醇的光学纯度99％，转化率80％。

实施例27：重组大肠杆菌不对称还原2',3'-二氟苯乙酮：

在900μL、100mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中(pH 7.5)中，加入100mg(10％，w/w)葡萄糖作为辅底物，加入实施例3中所得到的湿菌体细胞，终浓度10g/L；再加入10mM 2',3'-二氟苯乙酮底物。于20℃恒温摇床振荡(220rpm)反应7h。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(S)-1-(2,3-二氟苯基)乙醇的光学纯度99％，转化率94％。

实施例28：重组大肠杆菌不对称还原2',3'-二氟苯乙酮：

在900μL、100mM的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中(pH 7.5)中，加入100mg(10％，w/w)葡萄糖作为辅底物，加入实施例3中所得到的湿菌体细胞，终浓度100g/L；再加入100mM 2',3'-二氟苯乙酮底物。于35℃恒温摇床振荡(220rpm)反应6h。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，用手性毛细管气相色谱法分析底物和产物的含量及对映体过量值(ee)。产物(S)-1-(2,3-二氟苯基)乙醇的光学纯度99％，转化率96％。

SEQ ID No.1如下：

ATGTCAAAGTTAAATAATCCATTAACTCAATATTTCCATGAAGACTATCCAAAACAGTATCAAGAACCGC CCGGTGTACAGAAAGAAATGAACGTCATCCCGGACTGCGG GGAAAACAGTTACATAGGTG CAGGTAAATTAAAAGGCAGAAAAGCTCTTGTGACGGGTGGAGATTCAGGTATTGGCCGGGCAGCAGCGATCGCTTACGCAAGAGAAGGTG CAGACGTTGC GCTTAATTAC TTGCCACAAGAGCAAGCAGATGCAGAAGAAGTACAAAAGC TTATTGAAGCAGAAGGAAGAAAAGCCGTTC TCATACCTGG TGATGTAGGC GAAGAATCTTTTTGCAAAGAGCTAGTAGAAAAAGCTTATAAAGAATTAGATGGTTTAGATGTTCTAGCGCTCGTAGCTGGCAAACAGCAG GCAGTAGAAGATATTGCTGATTTAGAAACGGACCAACTGC GCAAAACCTTTGAAGTAAAT GTATTCTCTTTATATTGGACCGTAAAAGCAGCGCTGCCTTATTTACCGGCAGGTGCTTCTATTATTACCACAAGTTCTGTACAAGGCTATAGCCCAAGTC CTAATTTATTAGACTATGCAGCTACAAAGTTTGCCATTAACGGATTCACTCGCGGACTAG CCAAGCAATTAGCTCCAAAAGGTATTCGCGTCAACTCCGTTGCTCCAGGACCTATCTGGACGCCGCTGCAAATTTCTGGAGGGCAGCCAAGCGACGCTATTCCAGGCTTTGGACAAGATACACCTTTGCAGCGTGCTGGTCAGCCGGTAGAGTTAGCAAATGTATACGTATTTTTAGCTTCAACGGATGCAAGCTACGTAACAGCTCAAGTTTACGGGATTACAGGCGGAATAGAACTAG CTTAA；

SEQ ID No.2如下：

MSKLNNPLTQYFHEDYPKQYQEPPGVQKEMNVIPDCGENSYIGAGKLKGRKALVTGGDSG IGRAAAIAYAREGADVALNYLPQEQADAEEVQKLIEAEGRKAVLIPGDVG EESFCKELVE KAYKELDGLD VLALVAGKQQAVEDIADLETDQLRKTFEVNVFSLYWTVKAALPYLPAGAS IITTSSVQGYSPSPNLLDYAATKFAINGFTRGLAKQLAPK GIRVNSVAPGPIWTPLQISG GQPSDAIPGFGQDTPLQRAGQPVELANVYVFLASTDASYVTAQVYGITGG IELA；

SEQ ID No.3如下：

GCTGAGGATCCATGTCAAAGTTAAATAATCC；

SEQ ID No.4如下：

GCATCCTCGAGTTAAGCTAGTTCTATTCCGC；

SEQ ID No.5如下：

<110> 西北工业大学

<120> 一种羰基还原酶催化合成手性邻位卤代-α-苯乙醇的方法

<130> 无

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> SEQ ID No.1

<211> 885

<212> 核苷酸

<213> 人工序列

<400> SEQ ID No.1

ATGTCAAAGT TAAATAATCC ATTAACTCAA TATTTCCATG AAGACTATCC 50

AAAACAGTAT CAAGAACCGC CCGGTGTACA GAAAGAAATG AACGTCATCC 100

CGGACTGCGG GGAAAACAGT TACATAGGTG CAGGTAAATT AAAAGGCAGA 150

AAAGCTCTTG TGACGGGTGG AGATTCAGGT ATTGGCCGGG CAGCAGCGAT 200

CGCTTACGCA AGAGAAGGTG CAGACGTTGC GCTTAATTAC TTGCCACAAG 250

AGCAAGCAGA TGCAGAAGAA GTACAAAAGC TTATTGAAGC AGAAGGAAGA 300

AAAGCCGTTC TCATACCTGG TGATGTAGGC GAAGAATCTT TTTGCAAAGA 350

GCTAGTAGAA AAAGCTTATA AAGAATTAGA TGGTTTAGAT GTTCTAGCGC 400

TCGTAGCTGG CAAACAGCAG GCAGTAGAAG ATATTGCTGA TTTAGAAACG 450

GACCAACTGC GCAAAACCTT TGAAGTAAAT GTATTCTCTT TATATTGGAC 500

CGTAAAAGCA GCGCTGCCTT ATTTACCGGC AGGTGCTTCT ATTATTACCA 550

CAAGTTCTGT ACAAGGCTAT AGCCCAAGTC CTAATTTATT AGACTATGCA 600

GCTACAAAGT TTGCCATTAA CGGATTCACT CGCGGACTAG CCAAGCAATT 650

AGCTCCAAAA GGTATTCGCG TCAACTCCGT TGCTCCAGGA CCTATCTGGA 700

CGCCGCTGCA AATTTCTGGA GGGCAGCCAA GCGACGCTAT TCCAGGCTTT 750

GGACAAGATA CACCTTTGCA GCGTGCTGGT CAGCCGGTAG AGTTAGCAAA 800

TGTATACGTA TTTTTAGCTT CAACGGATGC AAGCTACGTA ACAGCTCAAG 850

TTTACGGGAT TACAGGCGGA ATAGAACTAG CTTAA 885

<210> SEQ ID No.2

<211> 294

<212> 核苷酸

<213> 人工序列

<400> SEQ ID No.2

MSKLNNPLTQ YFHEDYPKQY QEPPGVQKEM NVIPDCGENS YIGAGKLKGR 50

KALVTGGDSG IGRAAAIAYA REGADVALNY LPQEQADAEE VQKLIEAEGR 100

KAVLIPGDVG EESFCKELVE KAYKELDGLD VLALVAGKQQ AVEDIADLET 150

DQLRKTFEVN VFSLYWTVKA ALPYLPAGAS IITTSSVQGY SPSPNLLDYA 200

ATKFAINGFT RGLAKQLAPK GIRVNSVAPG PIWTPLQISG GQPSDAIPGF 250

GQDTPLQRAG QPVELANVYV FLASTDASYV TAQVYGITGG IELA 294

<210> SEQ ID No.3

<211> 31

<212> 核苷酸

<213> 人工序列

<400> SEQ ID No.3

GCTGAGGATCCATGTCAAAGTTAAATAATCC 31

<210> SEQ ID No.4

<211> 31

<212> 核苷酸

<213> 人工序列

<400> SEQ ID No.4

GCATCCTCGAGTTAAGCTAGTTCTATTCCGC 31

<210> SEQ ID No.5

<211> 1367

<212> 核苷酸

<213> 人工序列

<400> SEQ ID No.5

GCTTGCTTCT ATGACGTTAG CGGCGGACGG GTGAGTAACA CGTGGGCAAC 50

CTGCCTGTAA GACTGGGATA ACTTCGGGAA ACCGAAGCTA ATACCGGATA 100

GGATCTTCTC CTTCATGGGA GATGATTGAA AGATGGTTTC GGCTATCACT 150

TACAGATGGG CCCGCGGTGC ATTAGCTAGT TGGTGAGGTA ACGGCTCACC 200

AAGGCAACGA TGCATAGCCG ACCTGAGAGG GTGATCGGCC ACACTGGGAC 250

TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTAGGG AATCTTCCGC 300

AATGGACGAA AGTCTGACGG AGCAACGCCG CGTGAGTGAT GAAGGCTTTC 350

GGGTCGTAAA ACTCTGTTGT TAGGGAAGAA CAAGTACGAG AGTAACTGCT 400

CGTACCTTGA CGGTACCTAA CCAGAAAGCC ACGGCTAACT ACGTGCCAGC 450

AGCCGCGGTA ATACGTAGGT GGCAAGCGTT ATCCGGAATT ATTGGGCGTA 500

AAGCGCGCGC AGGCGGTTTC TTAAGTCTGA TGTGAAAGCC CACGGCTCAA 550

CCGTGGAGGG TCATTGGAAA CTGGGGAACT TGAGTGCAGA AGAGAAAAGC 600

GGAATTCCAC GTGTAGCGGT GAAATGCGTA GAGATGTGGA GGAACACCAG 650

TGGCGAAGGC GGCTTTTTGG TCTGTAACTG ACGCTGAGGC GCGAAAGCGT 700

GGGGAGCAAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGATGA 750

GTGCTAAGTG TTAGAGGGTT TCCGCCCTTT AGTGCTGCAG CTAACGCATT 800

AAGCACTCCG CCTGGGGAGT ACGGTCGCAA GACTGAAACT CAAAGGAATT 850

GACGGGGGCC CGCACAAGCG GTGGAGCATG TGGTTTAATT CGAAGCAACG 900

CGAaGaACCT TACCAGGTCT TGACATCcTC TGACaACTCT AGAGATAGAG 950

CGTTCCCCTT CGGGGGACAG AGTGACAGGT GGTGCATGGT TGTCGTCAGC 1000

TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTTGAT 1050

CTTAGTTGCC AGCATTTAGT TGGGCACTCT AAGGTGACTG CCGGTGACAA 1100

ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC ATCATGCCCC TTATGACCTG 1150

GGCTACACAC GTGCTACAAT GGATGGTACA AAGGGCTGCA AGACCGCGAG 1200

GTCAAGCCAA TCCCATAAAA CCATTCTCAG TTCGGATTGT AGGCTGCAAC 1250

TCGCCTACAT GAAGCTGGAA TCGCTAGTAA TCGCGGATCA GCATGCCGCG 1300

GTGAATACGT TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA CCACGAGAGT 1350

TTGTAACACC CGAAGTC 1367

<210> 下游引物 xdhC-R

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 下游引物 xdhC-R

CCGTggtacc TTACTTCGTT TTCTCGCAAT CC 32

Claims

1.羰基还原酶BaSDR1或含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌在将潜手性邻位卤代苯乙酮不对称还原制备手性邻位卤代-α-苯乙醇中的应用；所述潜手性邻位卤代苯乙酮的结构通式如式I所示：

其中，X为F，Cl和Br中的一种；R₁为氢或卤素。

2.手性邻位卤代-α-苯乙醇的制备方法，其特征在于，以潜手性邻位卤代苯乙酮为底物，羰基还原酶BaSDR1或含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌全细胞为催化剂，在20～55℃下，于pH 5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化即得；其中，当选用羰基还原酶BaSDR1为催化剂时，还需加入辅酶；

所述潜手性邻位卤代苯乙酮的结构通式如式I所示：

其中，X为F，Cl和Br中的一种；R₁为氢或卤素。

3.根据权利要求2所述的手性邻位卤代-α-苯乙醇的制备方法，其特征在于，所述转化反应体系中潜手性邻位卤代苯乙酮底物的初始浓度为5～300mmol/L；所述羰基还原酶的浓度为0.1～2.0mg/mL，或者含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌的菌体的质量用量以菌体湿重计为10～400g/L。

4.根据权利要求2或3所述的手性邻位卤代-α-苯乙醇的制备方法，其特征在于，所述转化反应体系中还添加有终浓度为1～50％的醇或糖作为辅底物。

5.根据权利要求4所述的手性邻位卤代-α-苯乙醇的制备方法，其特征在于，所述糖为葡萄糖，其质量浓度为10％。

6.根据权利要求5所述的手性邻位卤代-α-苯乙醇的制备方法，其特征在于，所述含有羰基还原酶BaSDR1的工程菌为E.coli BL21(DE3)/pET30a-Basdr1。

7.根据权利要求2或3所述的手性邻位卤代-α-苯乙醇的制备方法，其特征在于，所述羰基还原酶BaSDR1来源于菌株Bacillus aryabhattai NWPU-1801；

所述羰基还原酶BaSDR1氨基酸序列为如下序列之一：(1)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列缺失、插入或替换一个或几个氨基酸的序列，且仍具有羰基还原酶BaSDR1的活性。

8.根据权利要求7所述的手性邻位卤代-α-苯乙醇的制备方法，其特征在于，羰基还原酶BaSDR1的制备方法如下：培养工程菌E.coli BL21(DE3)/pET30a-Basdr1，诱导获得重组羰基还原酶。

9.羰基还原酶BaSDR1，其特征在于，其氨基酸序列为如下序列之一：(1)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列缺失、插入或替换一个或几个氨基酸的序列，且仍具有羰基还原酶BaSDR1的活性。

10.羰基还原酶BaSDR1基因的制备方法，其特征在于，该方法包括如下：分别以SEQ IDNo：3所示核苷酸和SEQ ID No：4所示核苷酸为上、下游引物，以Bacillus aryabhattaiNWPU-1801基因组DNA为模板，利用PCR进行基因扩增，获得全长885bp的羰基还原酶基因序列。