CN103409402B - 醛缩酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高性能催化羟醛缩合反应的2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶（DERA酶），相比野生型大肠杆菌DERA酶，该酶具有提高的底物耐受能力，以及更高效的催化能力。以本发明的DERA酶为催化剂可以解决高浓度氯乙醛底物导致DERA酶失活的问题，同时降低了生产过程中酶的添加量。本发明还提供了编码所述DERA酶的核酸、包含所述核酸的重组表达载体、包含所述重组表达载体的重组表达转化体、制备重组DERA酶的方法以及催化形成光学活性他汀类中间体的催化剂。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种醛缩酶突变体及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该酶作为催化剂在不对称醛醇缩合制备光学活性的他汀类中间体中的应用。
背景技术
他汀类药物[1]是20世纪80年代开发的一种新型降胆固醇类药物，作为3‐羟基‐3‐甲基‐戊二酰辅酶A（HMG‐CoA）还原抑制剂，通过与该酶竞争性结合，使HMG‐CoA无法转变成内源性胆固醇原料甲羟戊酸，从而阻断胆固醇的合成，降低胆固醇水平。此外他汀类药物还具有降低甘油三脂、提高高密度脂蛋白水平等重要作用，因此他汀类药物在预防和治疗冠心病等方面有着广泛的应用。同时有研究表明他汀类药物具有一定的抗肿瘤作用。目前，他汀类药物统治着全球降胆固醇药物市场，2008年，国际市场上他汀类的药物总销售额合计390亿美元。
各类他汀的化学结构中普遍具有一个手性的侧链基团，其结构式为二羟基酸或（杂）环芳香内酯。化学合成该手性侧链的过程，基本都是从麦芽糊精、L‐苹果酸和环氧氯丙烷等手性原料出发，经过钌、铑复合物的催化生成(R)‐4‐氰基‐3‐羟基丁酸，随后在‐70℃超低温条件下进行克莱森缩合和硼烷还原，制得手性侧链[2]。传统的化学合成过程存在着成本高、污染严重、反应步骤长、合成收率低、副反应多、产品分离纯化难度大等缺点。与传统的化学工艺相比，生物酶催化具有选择性高、反应条件温和等优点，大大缩短了反应步骤和生产成本，生产过程也更节能环保。因此，将生物酶法与化学法相结合来合成他汀侧链逐渐成为研究热点。
2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶（DERA酶）属于Ⅰ型醛缩酶，作为对映异构体选择性催化剂，可以催化乙醛和D‐甘油醛‐3‐磷酸酯之间的醛醇缩合反应。因此，作为手性分子的合成工具，DERA酶可利用乙醛或2‐取代的乙醛为底物，以4‐取代的‐3‐羟基正丁醛为中间产物合成2,4,6‐三脱氧己糖及其衍生物，此类化合物是他汀类侧链的合成前体。与其他酶类催化相比，DERA酶合成他汀侧链具有原料结构简单、来源丰富、价格低廉、易于检测分析等优点。
Wong[3,4]等人利用DERA酶催化的一锅化连续羟醛缩合反应得到了他汀类药物手性侧链，简化了合成过程，但是仍然存在诸多问题，如酶的投料量过大，每克分离产物需200mg DERA酶，这使得该法的成本过高，且增加了产物分离的困难；同时，由于在高浓度底物下，DERA酶极易失活，使得催化反应的底物浓度受到限制。Greenberg[5]等人通过分批补料的发酵工艺，部分解决了底物抑制问题，但是没有从根本上解决高底物浓度导致DERA酶失活问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种高性能催化羟醛缩合反应的2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶（DERA酶），该酶来源于大肠杆菌（E.coli），具有较高的底物耐受能力，以及更高效的催化能力。
在本发明的第一方面，提供了一种2‐脱氧‐D‐核糖‐5‐磷酸醛缩酶（DERA酶），其是选自如下的多肽：
(a)由SEQ ID No.4所示氨基酸序列组成的多肽；或
(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有DERA酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列具有至少90%一致性的多肽。
在本申请文件中，“几个”是指2～100个，更佳的2～30个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明发现这样的融合蛋白同样具有DERA酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有DERA酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的发明目的。根据本发明，在如SEQ ID No.4所示氨基酸序列的蛋白质(a)分子中进行1～10个氨基酸残基的突变，也可获得上述蛋白质(b)，但仍然保持DERA酶活性。
在本申请文件中，与某氨基酸序列具有某个“一致性”数值指的是使用NCBI‐BLAST软件（BLASTP），取默认设置，计算得到的一致性百分比数值。
在一个实施方案中，相对于野生型大肠杆菌DERA酶，本发明的DERA酶在第29、142、185、196、199位氨基酸残基中的一个或多个位点具有突变，且所述DERA酶的催化能力和/或对氯乙醛的底物耐受性提高。
优选地，野生型大肠杆菌DERA酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
更优选地，所述DERA酶具有选自下列突变中的一个或多个：V29A、T142P、M185V、K196E、F199I。
再优选地，所述DERA酶具有下列突变：
(a)V29A+T142P+F199I或
(b)V29A+T142P+M185V+K196E+F199I。
最优选地，所述DERA酶选自由SEQ ID No.5或6所示氨基酸序列组成的多肽。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸，其是选自如下的核酸：
(1)由SEQ ID No.3所示核苷酸序列组成的核酸；
(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的多肽的核酸：
(a)由SEQ ID No.4所示氨基酸序列组成的多肽；或
(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有DERA酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列具有至少90%一致性的多肽。
本发明所述SEQ ID No.3所示的核酸来源于大肠杆菌K12。本发明所述SEQ IDNo.3所示的核酸可以从大肠杆菌基因组中分离获得，也可以从含有该SEQ ID No.3所示核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。
本发明中，SEQ ID No.3所示的基因全长780bp，其中，其编码序列（CDS）从第1个碱基起至第780个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。
如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No.4的氨基酸序列的核酸序列不仅仅局限于SEQ ID No.3。本发明的DERA酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID No.4所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、插入或缺失来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核酸序列SEQ ID No.3的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、插入或缺失来制得。
SEQ ID No.3的同系物也指启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。
SEQ ID No.3的同系物还指一种具有在标准条件下能够与SEQ ID No.3所示序列的多聚核酸进行杂交的碱基序列的多聚核酸。在标准条件下进行杂交可根据“分子克隆”中描述的方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology）。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.1wt%SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～8×SSC（20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液）。杂交温度为50～70℃。在杂交几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt%SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt%SDS。当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
在本发明的第三方面，提供了一种包含本发明所述的核酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的所述的DERA酶基因或其突变体的核苷酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET21a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET21a分别用限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的DERA酶基因或其突变体的重组表达质粒。
在本发明的第四方面，提供了一种包含本发明所述的重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的DERA酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌（E.coli），更优选大肠杆菌BL21(DE3)。将前述重组表达质粒或其突变体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法，热击法等，较佳地选择热击法进行转化即可，热击条件较佳的是：45℃，热击90秒。
在本发明的第五方面，提供了一种重组DERA酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组DERA酶。
其中，培养所述的重组表达转化体所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的DERA酶的培养基；对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体生长并产生本发明的DERA酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵产酶较佳地选用下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌（优选E.coli BL21(DE3)）接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7（更佳地为0.6）时，加入终浓度为0.05～1.0mmol/L（更佳地是0.1mmol/L）的异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导，诱导温度10～30℃（更佳地是16℃），即可高效表达本发明所述重组DERA酶。
根据本发明产生的催化形成光学活性他汀类中间体的催化剂可以是上述产生的重组DERA酶的转化体的培养物，也可以是通过将培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指转化体细胞的提取物、或通过对提取物中的DERA酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或通过固定化转化体细胞或其提取物或提取物的分离产品而得到的固定化制品。优选地,将DERA酶溶液与0.5～10倍体积的饱和硫酸铵溶液以及0.1～10%的戊二醛进行交联固定化，不仅提高了底物耐受性，而且可以进行重复利用。最优选地，3倍体积的饱和硫酸铵溶液以及0.5%的戊二醛进行交联固定化的固定化酶具有最好的催化效能。
以本发明的DERA酶为催化剂可以很好地解决高浓度底物导致DERA酶失活的问题，同时降低了生产过程中酶的添加量。本发明对于应用DERA酶法生产他汀类侧链及其产业化具有重大意义。
附图说明
图1DERA酶突变基因PCR扩增的凝胶电泳结果。
图2DERA酶突变体在大肠杆菌中的表达产物的SDS‐PAGE电泳结果。
图3优选的DERA酶突变体5（SEQ ID No.5）和DERA酶突变体9（SEQ ID No.6）及野生型DERA酶（SEQ ID No.4）的氨基酸序列比对。
具体实施方式
实施例1 构建E.coli突变体deoC文库
使用随机诱变试剂盒，通过改变MnSO4浓度来进行多个反应，从而将1至3个点突变引入E.coli deoC基因（SEQ ID No.3），使DERA酶氨基酸序列中1～2个氨基酸被替换。为扩增编码E.coli DERA酶（SEQ ID No.4）的E.coli deoC基因（SEQID No.3），分别以引物DAI13600（SEQ ID No.1）和DAI13465（SEQ ID No.2）作为正向和反向引物。两个引物都含有与使用Gateway Technology通过定点重组克隆获得的PCR扩增deoC基因片段相容的位点。PCR扩增产物的凝胶电泳图谱如图1所示。
正向引物（DAI13600）的序列SEQ ID No.1：
5’‐GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GACTGA TCT GAA AGC AAG CAG CC‐3’
反向引物（DAI13465）的序列SEQ ID No.2：
5’‐GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA CTA GCT GCT GGC GCT C‐3’
易错PCR扩增使用下述温度程序：94℃2min，94℃30s和68℃1min的25个循环，接着68℃10min。首先将易错PCR片段克隆进pDONR载体，制备大规模pENTR质粒文库，起始超过20,000个菌落。然后以pDEST14为载体，将pENTR入门质粒文库构建为表达文库。然后将表达文库转入化学感受态E.coil BL21Star（DE3），用于表达突变的E.coil deoC基因（编码DERA酶突变体）。
实施例2 DERA酶的表达
突变的deoC基因在深孔微量滴定板中的表达：按照实施例1获得的突变菌，选取突变菌落，接种至微量滴定板（MTP）中200μl2×YT培养基（含有100μg/ml的氨苄青霉素），培养条件37℃，时间为1天。然后取100μl上述预培养物接种至含500μl表达培养物（2×YT，100μg/ml氨苄青霉素，1mM IPTG）的深孔板中，然后于摇床上25℃培养24h。表达产物的SDS‐PAGE电泳图谱如图2所示。同样的条件表达未突变的deoC基因（SEQ ID No.4），作为对照组。
实施例3 荧光底物的制备
底物为常规的甲基-5-甲苯磺酰-2-脱氧核苷酸。将12.75g甲苯磺酸盐溶解至75ml的DMF中，然后向制得的溶液中加入11.86g K2CO3和9.29g4-甲基-7-羟基香豆素（4-methylumbelliferone，4-MU）。将上述混合液在75℃下搅拌16h后，加入300ml水，并用200ml乙酸乙酯萃取2次。有机相用100ml0.1M的NaOH进行反提，有机相用硫酸钠进行干燥。有机相浓缩得到的粗提物溶解到25ml乙腈与100ml水的混合液中，再加入2.5g离子交换树脂Dowex50WX8-100，室温下搅拌1.5h，然后减压蒸馏去除甲醇。2天后，混合物进行过滤，减压浓缩，并用硅胶柱进行纯化，依次采用100%乙酸乙酯到10%丙酮/乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱。获得的产物为白色泡沫（5.31g，产率62%），为两种异头物的混合物。
实施例4 筛选具有提高催化能力的DERA突变体
将实施例2获得的DERA突变体1～5深孔培养物3500rpm进行离心15分钟，加入400μL裂解缓冲液（50mM磷酸缓冲液pH7.4，1mg/mL溶菌酶）使其重悬浮，反复冻融使细胞破碎。离心4000rpm移除细胞残骸，每个孔中取出210μL不含细胞的裂解液到新的微孔滴定板。以实施例3中得到的荧光底物检测DERA酶突变体1～5及野生型DERA酶的催化活力，该荧光底物在DERA酶存在的情况下可发生逆醛缩反应，产物自发释放出带荧光的化合物4‐MU，荧光激发波长为360nm，检测波长为460nm。以未突变的野生型DERA酶为对照（SEQ ID No.4），各突变株的相对酶活力（即相对荧光强度）如表1所示。其中，突变体5的相对酶活力最高，经过测序，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
表1 DERA酶突变体的相对酶活力
| DERA酶 | 相对荧光强度 |
| 野生型DERA酶（SEQ ID No.4） | 1 |
| DERA酶突变体1 | 3.4±0.1 |
| DERA酶突变体2 | 7.5±0.2 |
| DERA酶突变体3 | 8.9±0.2 |
| DERA酶突变体4 | 10.4±0.2 |
| DERA酶突变体5 | 13.2±0.4 |
实施例5 筛选具有提高氯乙醛底物耐受能力的DERA突变体
以实施例4获得的DERA酶突变体5为模板，按照实施例1、2和4的步骤再次进行基于提高DERA酶氯乙醛耐受性的酶突变体库的构建和表达。
将获得的DERA酶突变体6～10及野生型DERA酶对照与500mM氯乙醛在25℃孵育不同时间（5min、30min）后，于25℃测定对荧光底物的分解活力，以未处理的野生型DERA酶在相同条件下测定的分解活力为1，得到不同时间氯乙醛处理后DERA酶突变体的相对分解活力（如表2所示）。其中，突变体9的底物耐受能力最强，经过测序，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
表2 DERA酶突变体对氯乙醛底物的耐受能力
优选的DERA酶突变体5（SEQ ID No.5）和DERA酶突变体9（SEQ ID No.6）及野生型DERA酶（SEQ ID No.4）的氨基酸序列比对如图3所示。其中，相对于野生型DERA酶，DERA酶突变体5（SEQ ID No.5）是经过V29A+T142P+F199I氨基酸残基取代得到的，DERA酶突变体9（SEQ ID No.6）是经过V29A+T142P+M185V+K196E+F199I氨基酸残基取代得到的。
实施例6 DERA酶的发酵
将按照实施例4和5获得的高性能DERA酶突变体基因工程大肠杆菌接种于装有200mL LB培养基的1L摇瓶中，于37℃，180‐220rpm培养10‐16h。将上述培养好的种子按10%(v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基（M9培养基：葡萄糖4g/L，磷酸氢二钠12.8g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铵1g/L，硫酸钠0.5g/L，氯化钙0.0152g/L，六水氯化镁0.41g/L）中，在25～35℃，300～800rpm，空气流量2～6L/min的条件下培养。培养6～10h后，以5～20mL/h的速率流加含60%甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至OD600达到20～40时，添加0.1～1mM IPTG开始诱导。诱导5～15h后，放罐，5000rpm离心收集菌体。
实施例7 DERA酶转化
取实施例6收集的大肠杆菌菌体，加入1～3倍体积0.05M的NaHCO3缓冲液（pH7.5）。超声破碎30min，10000rpm离心取上清粗酶液，用于酶催化反应。催化反应体系中，氯乙醛的浓度为0.3～1M，乙醛和氯乙醛的摩尔比例为1.5～2.5：1，DERA酶的添加量为氯乙醛质量的5～15%。反应温度：10～30℃，催化时间：4～8h。反应结束后加2倍体积丙酮沉淀蛋白质，10000转离心10分钟除去蛋白质；旋转蒸发除掉丙酮，然后用2倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，除去溶剂得到产物粗品。
实施例8 底物与产物分析方法
采用气相色谱法检测产物：以丙二酸二乙酯为内标，色谱柱为非极性柱，固定相为100%聚二甲基硅氧烷；柱温：50℃（停留2min），后以10℃/min升温到240℃；载气为氦气；进样口温度：300℃；离子源温度：250℃；两个产物峰分别在11.3min、13.1min；内标峰出峰在8.1min。
参考文献
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Claims (16)
1.一种2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA酶)，其特征在于：所述DERA酶选自由SEQ ID No.5或6所示氨基酸序列组成的多肽。
2.一种编码权利要求1所述的DERA酶的分离的核酸。
3.一种重组表达载体，其包含权利要求2所述的分离的核酸。
4.权利要求3所述的重组表达载体，其是通过将权利要求2所述的分离的核酸连入质粒pET21a得到的。
5.一种重组表达转化体，其包含权利要求3或4所述的重组表达载体。
6.权利要求5所述的重组表达转化体，其是大肠杆菌。
7.权利要求6所述的重组表达转化体，其是大肠杆菌BL21(DE3)。
8.一种重组DERA酶的制备方法，其包括如下步骤：培养权利要求5所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组DERA酶。
9.权利要求8所述的方法，其中所述重组表达转化体为大肠杆菌，培养所述的重组表达转化体所用的培养基是LB培养基。
10.权利要求9所述的方法，其包括下列步骤：将重组大肠杆菌接种至含氨苄青霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5-0.7时，加入终浓度为0.05-1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度10-30℃，即可表达重组DERA酶。
11.权利要求10所述的方法，其中所述重组大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
12.权利要求10所述的方法，其中所述培养液的光密度OD600达到0.6时加入IPTG进行诱导。
13.权利要求10所述的方法，其中所述加入的IPTG的终浓度为0.1mmol/L。
14.权利要求10所述的方法，其中所述诱导温度为16℃。
15.一种催化形成光学活性他汀类中间体的催化剂，其包括权利要求1所述的DERA酶，或权利要求5-7任一项所述的重组表达转化体的培养物离心分离得到的转化体细胞加工的制品；其中所述转化体细胞加工的制品是对转化体细胞的提取物中的DERA酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或通过固定化所述分离产品而得到的固定化制品。
16.权利要求15所述的催化剂，其通过3倍体积的饱和硫酸铵溶液以及0.5％的戊二醛进行交联固定化。
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