CN105567652B

CN105567652B - 一种酮还原酶及其在不对称合成手性羟基化合物中的应用

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Publication number: CN105567652B
Application number: CN201410541899.8A
Authority: CN
Inventors: 罗煜; 丁时澄; 瞿旭东; 王海涛
Original assignee: Shanghai Yi Ke Lai Biological Medicine Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Yikelai Biotechnology Group Co ltd
Priority date: 2014-10-14
Filing date: 2014-10-14
Publication date: 2019-06-11
Anticipated expiration: 2034-10-14
Also published as: CN105567652A

Abstract

本发明提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的酮还原酶，以及使用该酮还原酶催化合成(R)‑HPBE，进而进一步合成普利类药物的酶‑化学合成方法。还提供了编码该酮还原酶的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该酮还原酶的制备方法，以及该酮还原酶在催化羰基底物不对称还原中的用途。相对于其它不对称还原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点。

Description

一种酮还原酶及其在不对称合成手性羟基化合物中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酮还原酶，该酮还原酶的制备方法，以及该酮还原酶作为催化剂在不对称合成手性羟基化合物中的应用。

背景技术

(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯((R)-HPBE,CAS号：90315-82-5)是一种手性仲醇，它是合成众多血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(即普利类药物)的关键手性砌块。

普利类药物主要用于治疗心力衰竭、高血压。目前在中国抗高血压药物市场上主要有ACE抑制剂、钙拮抗剂、血管紧张素II受体拮抗剂和β-受体阻滞剂四类抗高血压药物。普利类药物近年受到沙坦类药物的影响，销量有所下降，但由于受到欧盟新标准和国内一些厂家退出的影响，价格较为稳定。

自1977年Ondetti等研究开发了第一代的卡托普利后，普利类药物已经拓展到80多个衍生物，常见的几种普利药物如上所示。普利类药物由于具有疗效显著、不良反应小、作用时间长等优点，在临床上仍有广泛的应用前景。由于(R)-HPBE是该药物的关键手性中间体，对于(R)-HPBE合成新方法的研究仍具有较大的实用意义和工业应用前景。

合成(R)-HPBE的方法包括化学法和生物法。其中，化学法是由价廉易得的原料出发，经过多步反应最终合成(R)-HPBE。如由苯甲酸和丙酮酸经过多步反应生成2-羟基-4-苯基丁酸，再经过去消旋化和酯化作用合成(R)-HPBE；再如由乙二酸二乙酯和苯丙酸乙酯作为起始原料，合成2-羰基-4-苯基丁酸乙酯后经过不对称氢化得到(R)-HPBE。化学法在产物规模上具有较为明显的优势，可达到500公斤的生产规模，但是，化学法要用到重金属Pt等污染环境的催化剂，无法满足绿色化学的要求且成本较高。另外，化学法存在收率较低、反应条件较为苛刻、对底物的纯度要求高、得到的产物的光学活性较低等缺点，所以不适合进行规模化生产的进行。

目前生物法合成(R)-HPBE主要有两种途径，一种是利用脂肪酶来拆分rac-HPBE得到(R)-HPBE，或拆分rac-HPBA后经过乙酯化得到(R)-HPBE。另一种途径是用酮还原酶OPBE或OPBA进行不对称还原，生成(R)-HPBE或(R)-HPBA，(R)-HPBA可经过进一步酯化合成(R)-HPBE。利用酮还原酶进行不对称还原，理论得率可以达到100％，而脂肪酶的理论得率最高只能达到50％，酮还原酶具有一定的优势，但酮还原酶催化反应通常需要额外添加价格昂贵的辅酶NAD⁺/NADP⁺。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的不对称还原反应制备(R)-HPBE反应中收率较低、反应条件较为苛刻、对底物的纯度要求高、得到的产物的光学活性较低、或者需要添加价格昂贵的辅酶等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的酮还原酶，以及使用该酮还原酶催化合成(R)-HPBE，进而进一步合成普利类药物的酶-化学合成方法。还提供了编码该酮还原酶的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该酮还原酶的制备方法，以及该酮还原酶在催化羰基底物不对称还原中的用途。

本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：

本发明的第一方面提供了一种酮还原酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。

SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质由环境DNA编码，具有酮还原酶的功能，是一种新的酮还原酶。

(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有酮还原酶活性的蛋白质。

其中，所述的“几个”是指2个至100个，更佳地小于30个，最佳地小于10个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白。根据本发明，在如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质分子中进行1～5个氨基酸残基的突变，仍然保持酮还原酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有酮还原酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的发明目的。

(c)与(a)的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且具有酮还原酶活性的蛋白质。

SEQ ID NO:2所示的酮还原酶和其他已知酮还原酶的氨基酸序列的同一性低于90％，具有显著差异性，例如与吗啡脱氢酶YtbE之间的同一性为85％。

在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBIBlastp程序进行比对，默认参数。

本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的酮还原酶。优选地，所述核酸是由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列组成的。

由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成的核酸来源于环境DNA，其可以从土壤样本中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。

本发明中，SEQ ID NO:1所示的基因命名为BYK-KRED，全长843bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第840个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核酸序列不仅仅局限于SEQ ID NO:1。本发明的酮还原酶基因的核酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核酸序列SEQ ID NO:1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或添加来制得。

SEQ ID NO:1的同系物也指启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。

SEQ ID NO:1的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID NO:1所示序列的核酸进行杂交的核酸序列。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～8×SSC(20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液)；杂交温度为50～70℃；在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS；当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。

本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的编码酮还原酶的核酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明所述的编码酮还原酶或其突变体的核酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET系列质粒。较佳地，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的目的核酸片段与表达载体pET21a分别用限制性内切酶NdeⅠ和HindIII双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的编码酮还原酶的核酸序列的重组表达质粒pET21a-BYK-KRED或含有编码其突变体的核酸序列的重组表达质粒。

本发明的第四个方面提供了一种包含本发明的重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的酮还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌(E.coli)，更优选E.coli BL21(DE3)。将前述重组表达质粒pET21a-BYK-KRED或其突变体转化至E.coli BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET21a-BYK-KRED或其突变体。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法，热击法等；较佳地选择热击法进行转化，热击条件较佳的是：42℃，热击90秒。

本发明的第五方面提供一种重组酮还原酶的制备方法，包括培养本发明所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组酮还原酶。

其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞得到。所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转化体生长并表达本发明的酮还原酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体生长并表达本发明的酮还原酶即可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行。对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵较佳地选用下述方法：将本发明的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3)/pET21a-BYK-KRED或其突变体)接种至含氨苄青霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5～0.7(更佳地为0.6)时，加入终浓度为0.05～1.0mmol/L(更佳地是0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度10～37℃(更佳地是25℃)，即可高效表达本发明所述重组酮还原酶。

本发明的第六方面提供了一种催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物的催化剂，其可以是上述重组转化体的培养物，也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物中的酮还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。

本发明的第七方面提供了本发明的酮还原酶、重组酮还原酶或催化剂在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物中的应用。

所述前手性羰基化合物较佳地为杂环酮类化合物，即式I所示的化合物：

其中，

R选自H或C1～C6烷基，

R’选自H、C1～C6烷基或烷氧基、卤素、卤素任意取代的C1～C6烷基，

n选自0～6的整数；

优选地，其中，

R选自H、甲基、乙基，

R’选自H或Cl，

n为0或2。

所述前手性羰基化合物更优选地为2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或2-(2-氯苯基)-2-氧代乙酸甲酯。

本发明所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳地，所述应用包括下述步骤：在pH 5.0～8.0的水溶液中，在葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的存在下，在本发明的酮还原酶、重组酮还原酶或催化剂的催化下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性羟基化合物。

其中所述的前手性羰基化合物在反应液中的较佳浓度为10～1000g/L。本发明的酮还原酶用量为催化有效量，较佳地为1～100U/L。本发明的葡萄糖用量较佳为50～100g/L，葡萄糖脱氢酶的用量较佳为100～1000U/L。所述的不对称还原反应较佳的是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳地为20～45℃，更佳地为25～35℃。所述的不对称还原反应的时间较佳地以前手性羰基化合物的含量在反应溶液中低于5％为准。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性羟基产物。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明针对已经报道的反应收率低、原料成本昂贵、反应不完全、对应选择性不高等问题，提供了一种新的酮还原酶及利用重组酮还原酶进行不对称还原的方法。在催化浓度高达300g/L的底物时，产物的光学纯度仍高达98％以上，且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于其它不对称还原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点，因此具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1酮还原酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M为DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增的的酮还原酶基因

图2酮还原酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。M为分子量标准，泳道1为酮还原酶的蛋白上清液。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1环境酮还原酶基因分离

从上海市奉贤区四团镇朱家村采集土壤样本并提取DNA(提取方法参照ChromaSpin TE-1000，Clontech Laboratories，Inc.，USA)，用Sau3AI部分酶切，电泳收集0.5～4kb的片段，回收并连接到pUC19的BamHI位点，得到质粒文库。将文库转化到E.coli DH5α并涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性克隆接种到加有500μL LB(含100μg/mL氨苄青霉素)的96深孔孔板，37℃培养4小时后加1mM IPTG诱导，30℃继续培养过夜；然后各取50μL深孔培养物到加有50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)的新的96孔板，-80℃反复冻融使细菌裂解；加入1mM苯乙酮为底物、10mM葡萄糖、1单位葡萄糖脱氢酶、0.002％(v/v)的酚红，30℃培养4小时，挑取变红最明显的孔所对应的深孔培养物，提取质粒并测序。用NCBI的ORFFinder分析其开放读码框(ORF)，得到ORF核苷酸序列SEQ ID NO:1，并进一步得到其编码的氨基酸序列SEQ ID NO:2。

实施例2酮还原酶表达

根据SEQ ID NO:1合成引物对P1(核苷酸序列为SEQ ID NO:3)和P2(核苷酸序列为SEQ ID NO:4)。

使用P1和P2扩增全长ORF序列，PCR体系如下：10×KOD-Plus PCR buffer2μL，25mMMgSO₄1.2μL，2mM dNTP 2μL，KOD-Plus PCR高保真酶0.3μL，实施例1获得的DNA模板0.5μL(含DNA模板0.1μg)，ddH₂O 13μL，P1和P2各0.5μL(10mmol/L)。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)98℃，变性15s；(3)56℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复35次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化(电泳结果见图1)，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收800～900bp区间的目标条带，获得一条完整的ORF序列，经DNA测序，全长843bp。

PCR产物切胶回收后，用NdeI/HindIII酶切后连接到pET21a原核表达载体，并转化到E.coli BL21(DE3)感受态细菌，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板培养，挑选阳性菌落(BYK-KRED基因工程大肠杆菌)接种到100mL液体LB培养基中进行培养。过夜培养物转入1L新鲜的LB液体培养基，培养到OD₆₀₀达0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为100μM诱导重组蛋白表达，降温至30℃继续培养24小时。5000rpm离心收集菌体，用0.2M pH7.0的磷酸钠缓冲液洗一次，每1g菌体重悬于5mL上述磷酸盐缓冲液中，超声波破碎后，SDS-PAGE检验表达水平，电泳结果见图2。

实施例3酶活测定方法

酶活(U)的定义为每分钟消耗1μmolNADPH所需要的酶量。

酶活(U)的测定方法是：在2mL反应液中，加入2mM苯乙酮为底物，0.1mMNADPH为辅因子，再加入20μL粗酶液，测定1分钟内OD340的降低速度为ΔA340。每mL酶液的比酶活U＝ΔA₃₄₀×1000/(6220×20)，即每mL裂解液的比酶活力。

实施例4高密度发酵

将按照实施例2获得的BYK-KRED基因工程大肠杆菌接种于装有200mLLB液体培养基的1L摇瓶中，于37℃，180～220rpm培养10～16h。将上述培养好的种子培养液按10％(v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基(M9培养基，含葡萄糖4g/L、磷酸氢二钠12.8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵1g/L、硫酸钠0.5g/L、氯化钙0.0152g/L、六水氯化镁0.41g/L)中，在20～30℃，300～800rpm，空气流量2～6L/min的条件下培养。培养6～10h后，以5～20mL/h的速率流加含60％甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至OD₆₀₀达到20～40时，添加0.1～1mM IPTG开始诱导。诱导10～20h后，放罐，5000rpm离心收集菌体。

实施例5前手性羰基底物的不对称还原反应

100g表1中的前手性羰基底物(或其盐酸盐)溶于200mL水，用1M的NaOH调pH 6.0，加入实施例2的全菌裂解液200mL、水500mL、葡萄糖70g和葡萄糖脱氢酶5000U(购自sigma)，30℃搅拌反应16小时，1M NaOH控制反应pH在5.8～6.0之间，TLC检测反应进程。反应结束后调pH 10.0，升温至50℃加热1小时使蛋白质变性，加硅藻土过滤除去变性蛋白质；等体积乙酸乙酯萃取3次，并用等体积乙酸乙酯洗涤滤渣一次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂，得到粗产物，测定纯度，结果见表1。纯度95.0～97.0％，摩尔收率88～92％，e.e.值>99％。

TLC条件：EA:PE＝1:3，碘缸显色。

GC检测反应进度，GC条件为：初始温度100℃，每分钟升高10℃，终温280℃；

ee值测定：Chiralpak AD-H柱，正己烷:乙醇(0.1％DEA)＝90:10，0.8mL/min，220nm，Agilent1260。

表1酮还原酶催化前手性羰基化合物发生不对称还原反应的结果

Claims

1.一种酮还原酶，其是由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的酮还原酶的分离的核酸。

3.根据权利要求2所述的核酸，其是由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成的。

4.包含权利要求2或3所述的核酸的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述的表达载体选自质粒、噬菌体或非噬菌体病毒载体。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述的质粒选自pET21a。

7.一种包含权利要求4～6任一项所述的重组表达载体的重组表达转化体，其特征在于通过将权利要求4～6任一项所述的重组表达载体转化至大肠杆菌宿主细胞中制得。

8.根据权利要求7所述的重组表达转化体，其特征在于所述的大肠杆菌为E.coliBL21(DE3)。

9.一种重组酮还原酶的制备方法，包括培养权利要求7或8所述的重组表达转化体，以及从所述培养物中获得重组酮还原酶。

10.一种催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物的催化剂，其是权利要求7或8所述的重组转化体的培养物，或通过将所述培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用所述转化体细胞加工的制品。

11.权利要求10所述的所述的催化剂，其特征在于所述的转化体细胞加工的制品为由转化体细胞得到的提取物或通过对提取物中的酮还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。

12.一种权利要求1所述的酮还原酶、权利要求9所述的方法制备的重组酮还原酶或权利要求10所述的催化剂在催化前手性羰基化合物进行不对称还原反应形成手性羟基化合物中的应用，其特征在于所述的前手性羰基化合物为式I所示的化合物：

其中，R选自H、甲基、乙基，R’选自H或Cl，n为0或2。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于所述的前手性羰基化合物为2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或2-(2-氯苯基)-2-氧代乙酸甲酯。

14.根据权利要求12-13任一项所述的应用，其特征在于所述应用包括下述步骤：在pH5.0～8.0的水溶液中，在葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的存在下，在权利要求1所述的酮还原酶、权利要求9所述的方法制备的重组酮还原酶或权利要求10所述的催化剂的催化下，前手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成光学活性手性羟基化合物。

15.根据权利要求14所述的应用，其中所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度为10～1000g/L；所述的酮还原酶、重组酮还原酶或催化剂的用量为1～100U/L；所述的葡萄糖用量为50～100g/L，葡萄糖脱氢酶的用量为100～1000U/L。

16.根据权利要求14所述的应用，其特征在于所述的不对称还原反应液中含有0～1mmol/L的NAD⁺。

17.根据权利要求14所述的应用，其特征在于；所述的不对称还原反应在振荡或搅拌条件下进行；所述的不对称还原反应的温度为20～45℃。

18.一种合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法，包括使用权利要求1所述的酮还原酶、权利要求9所述的方法制备的重组酮还原酶或权利要求10所述的催化剂催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯进行不对称还原反应。

19.一种合成(R)-2-(2-氯代苯基)-2-羟基乙酸甲酯的方法，包括使用权利要求1所述的酮还原酶、权利要求9所述的方法制备的重组酮还原酶或权利要求10所述的催化剂催化2-(2-氯苯基)-2-氧代乙酸甲酯进行不对称还原反应。

20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述不对称还原反应的反应液中含有10～1000g/L的2-氧代-4-苯基丁酸乙酯、1～100U/L的酮还原酶、50～100g/L的葡萄糖、100～1000U/L的葡萄糖脱氢酶、0～1mmol/L的NAD⁺，反应在振荡或搅拌条件下进行，反应温度为20～45℃。

21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述不对称还原反应的反应液中含有10～1000g/L的2-(2-氯苯基)-2-氧代乙酸甲酯、1～100U/L的酮还原酶、50～100g/L的葡萄糖、100～1000U/L的葡萄糖脱氢酶、0～1mmol/L的NAD⁺，反应在振荡或搅拌条件下进行，反应温度为20～45℃。