一种羰基还原酶及其在制备(R)-奎宁醇中的应用
技术领域
本发明属于生物工程领域,具体涉及一种羰基还原酶,含有编码该酶的核苷酸序列的重组表达载体和重组表达转化体,表达的重组酶和该重组酶的制备方法,以及该羰基还原酶作为催化剂在不对称合成(R)-奎宁醇中的应用。
背景技术
膀胱过度活动症(OAB)是一种以尿急症状为特征的症候群,常伴有尿频和夜尿症状,可伴或不伴有急迫性尿失禁,其明显影响患者的日常生活和社会活动,已成为困扰人们的一大疾病。近年来随着我国进入老龄化社会,以及糖尿病与神经系统损害性疾病的增长,由此继发的相关疾病——膀胱过度活动症的发生率也逐年上升。
《膀胱过度活动症诊断治疗指南》中指出:OAB是一种以尿急症状为特征的综合征,常伴有尿频和夜尿症状,可伴或不伴有急迫性尿失禁;尿动力学上可表现为逼尿肌过度活动,也可为其他形式的尿道——膀胱功能障碍。不包括由急性尿路感染或其他形式的膀胱尿道局部病变所致的症状。
对于OAB的药物治疗,主要有以下几种:
(1)M受体拮抗剂药物治疗容易被大多数OAB患者接受,因而是OAB最重要和最基本的治疗手段。逼尿肌的收缩通过激动胆碱能(M受体)介导,M受体拮抗剂可通过拮抗M受体,抑制逼尿肌的收缩,改善膀胱感觉功能,抑制逼尿肌不稳定收缩可能,因此被广泛应用于治疗OAB。一线药物有托特罗定、曲司氯胺、索利那新等,其他药物有奥昔布宁、丙哌唯林、普鲁苯辛等。
(2)镇静、抗焦虑药。中枢神经系统的多个区域参与了排尿控制,如皮质和间脑以及中脑、延髓和脊髓。可选择与这些神经通路有关的神经递质如γ-氨基丁酸、5-羟色胺、多巴胺和谷氨酸等。OAB的治疗药物中,最常用的是丙米嗪,不仅有抗胆碱及拟交感作用,还可能有中枢性抑制排尿反射的作用,被推荐用于治疗混合性急迫、压力性尿失禁。但丙米嗪起效较慢,服用数周后才能见效。不良反应有体位性低血压及心律失常。另一抗抑郁药物度洛西汀,通过抑制中枢对 5-羟色胺和去甲肾上腺素的再摄取,增加尿道外括约肌张力。
(3)钙通道阻断剂实验证明,钙拮抗剂如维拉帕米、硝苯地平等可通过阻滞细胞外钙离子内流从而抑制膀胱逼尿肌的收缩;钾离子通道开放剂则通过增加钾离子外流,引起细胞膜超极化,使平滑肌松弛。
(4)其他药物前列腺素合成抑制剂(吲哚美辛)、黄酮哌酯等。
其中,索非那新(solifenacin)是新一代M3受体拮抗剂,迄今已在全球50多个国家和地区上市销售,已成为欧洲、美国和日本市场膀胱过度活动症(OAB)治疗的领导品牌,受到多个权威机构和指南的推荐。现有技术中对于索非那新的合成主要包括化学法和生物法两种:
化学法主要包括拆分的方法,比如,美国专利US5744606A中公开了3-喹宁酮与路易斯酸成盐,然后在铑、铱或钌与手性二膦配体作为光学活性的复合物催化下生成(R)-喹宁醇,如下所示:
又如,美国专利US5215918A(Bend Research,Inc.)公开了一种制备(R)-奎宁醇的方法,该方法包括(R,S)-3-喹宁醇与低脂肪酸酐反应生成相应的(R,S)-低脂肪酸酯,然后(S)-构型的酯在枯草杆菌蛋白酶催化下优先水解成(S)-3-喹宁醇,分离后溶液中的(R)-构型酯水解后得到(R)-喹宁醇,反应式如下所示:
又如,美国专利US7309699中公开了(+/-)-1-氮杂双环[2.2.2]壬-3-基苯甲酸利用(L)-酒石酸拆分,然后拆分产物利用氢氧化钠水解生成(R)-奎宁醇。
再如,中国专利申请CN101585835中公开了利用(L)-酒石酸对3-奎宁醇进行拆分得到(R)-奎宁醇的方法。
上述的化学方法村存在着收率较低,或者需要使用昂贵的金属催化剂的缺陷,后来为了解决这些问题,开始进行利用生物法进行催化来合成(R)-奎宁醇。主要包括以下方法:
比如,2003年M.Ikunaka报道了一种利用蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的蛋白酶来拆分3-奎宁醇衍生物的方法,转化率为42%,ee值达到96%,但是这种外消旋物质酶动力学拆分的理论最大转化率为50%,并有衍生反应。
后来,中国专利CN101864370公开了3-奎宁酮利用深红酵母(Rhodotorula rubra)X15的酵母菌株进行生物催化制备(R)-奎宁醇的方法。
接着,中国专利CN102952761公开了3-奎宁酮盐酸盐在诺卡氏菌WY1202催化下制备(R)-奎宁醇的方法。
再如,中国专利申请CN103555608中公开了3-奎宁酮在一种表达奎宁酮还原酶的放射形土壤杆菌催下制备(R)-奎宁醇的方法。
总之,利用生物法进行催化来合成(R)-奎宁醇比利用化学法得到(R)-奎宁醇收率明显提高,更适合工业化生产的进行。
发明内容
本发明在现有技术的基础上,通过大量的实验,提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好的羰基还原酶,以及使用该羰基还原酶催化合成(R)-奎宁醇,进而进一步合成索非那新的酶-化学合成方法。还提供了编码该羰基还原酶的核苷酸序列,含有该核苷酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该羰基还原酶的制备方法,以及该羰基还原酶在催化羰基底物不对称还原中的用途。
本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题:
本发明的第一方面提供了一种羰基还原酶,其是如下(a)或(b)的蛋白质:
(a)由SEQ ID No:2所示氨基酸序列组成的蛋白质。
SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质由环境DNA编码,具有羰基还原酶的功能,是一种新的羰基还原酶。
(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有羰基还原酶活性的蛋白质。
其中,所述的“几个”是指2个至100个,更佳地小于30个,最佳地小于10个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白,本发明人发现这样的融合蛋白同样具有羰基还原酶的活性。也就是说,只要由(a)衍生的蛋白质具有羰基还原酶的活性,且衍生方式如上所述,都可以达到本发明的发明目的。根据本发明,在如SEQ ID No:2所示氨基酸序列的蛋白质中进行1~5个氨基酸残基的突变,仍然保持羰基还原酶的活性。
SEQ ID No:2所示的羰基还原酶和其他已知羰基还原酶,如短小高加索乳杆菌醇脱氢酶之间的同一性为44%。本发明的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的羰基还原酶与已知羰基还原酶的氨基酸序列具有显著差异性。
在本文中,氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算,优选采用NCBI Blastp程序进行比对,默认参数。
本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸,其编码本发明的羰基还原酶。优选地,所述核酸是由SEQ ID No:1所示核苷酸序列组成的。
由SEQ ID No:1所示的核苷酸序列组成的核酸来源于环境基因组DNA,其可以从环境基因组中分离获得,也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得,也可以全基因人工合成获得。
本发明中,SEQ ID No:1所示的基因命名为BYK-CR,全长786bp。其中,其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第786个碱基止,起始密码子为ATG,终止密码子为TAA。该序列无内含子,其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示。
如本领域技术人员所知,由于密码子的简并性,编码SEQ ID No:2的氨基酸序列的核苷酸序列不仅仅局限于SEQ ID No:1。本发明的羰基还原酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID No:2所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外,还可以通过适当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核苷酸序列SEQ ID No:1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或添加来制得。
SEQ ID No:1的同系物也指启动子变体。在所述的核苷酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变,但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换,可提高目标蛋白的表达水平。
SEQ ID No:1的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID No:1所示序列的核酸进行杂交的核苷酸序列。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的方式进行:Cold Spring Harbor Laboratory Press,分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说,杂交可以按照如下步骤进行:将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交;杂交缓冲液的组成为0.1wt%SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2~8×SSC;20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液;杂交温度为50~70℃;在培养几个小时或过夜后,用清洗缓冲液清洗膜;清洗温度为室温,更优选为杂交温度;清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt% SDS溶液,更优选为5×SSC+0.1wt%SDS;当用这种清洗缓冲液清洗完膜后,就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的编码羰基还原酶的核苷酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明所述的编码羰基还原酶或其突变体的核苷酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体,如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等,优选质粒pET-21a。较佳地,可通过下述方法制得本发明的重组表达载体:将通过PCR扩增所得的目的核酸片段与表达载体pET-21a分别用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切,形成互补的粘性末端,经T4DNA连接酶连接,形成含有本发明的编码羰基还原酶的核苷酸序列的重组表达质粒pET21a-BYK-CR或含有编码其突变体的核苷酸序列的重组表达质粒。
本发明的第四个方面提供了一种包含本发明的重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞,只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制,且所携带的本发明的羰基还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌(E.coli),更优选E.coli BL21(DE3)。将前述重组表达质粒pET21a-BYK-CR或其突变体转化至E.coli BL21(DE3)中,即可获得本发明优选的基因工程菌株,即E.coli BL21(DE3)/pET21a-BYK-CR或其突变体。转化方法可选择本领域常规方法,如电转法,热击法等;较佳地选择热击法进行转化,热击条件较佳的是:42℃,热击90秒。
本发明的第五方面提供一种重组羰基还原酶的制备方法,包括培养本发明所述的重组表达转化体,以及从培养物中获得重组羰基还原酶。
其中,所述的重组表达转化体同前述介绍,可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞得到。所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转化体生长并表达本发明的羰基还原酶的培养基,对于大肠杆菌菌株,优选LB培养基(蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaCl 10g/L,pH 7.0)。培养方法和培养条件没有特殊的限制,可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择,只要能使转化体生长并表达本发明的羰基还原酶即可。其他培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行。对于大肠杆菌 菌株,摇瓶培养发酵较佳地选用下述方法:将本发明的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3)/pET21a-BYK-CR或其突变体)接种至含氨苄青霉素的LB培养基中培养,当培养液的光密度OD600达到0.6~0.8时,加入终浓度为0.05~1.0mmol/L(更佳地是0.1mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导,诱导温度16~37℃(更佳地是30℃),即可高效表达本发明所述重组醇脱氢酶。
本发明中催化3-奎宁酮进行不对称还原反应形成(R)-奎宁醇的催化剂,可以是上述重组转化体的培养物,也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物中的羰基还原酶进行分离和/或纯化得到的分离产品,或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。
本发明的第六个方面提供了一种本发明的羰基还原酶或重组羰基还原酶在催化3-奎宁酮进行不对称还原反应形成(R)-奎宁醇中的应用。
本发明所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择,较佳地,所述应用包括下述步骤:在pH5.0~8.0的水溶液中,在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖存在下,在本发明所述的羰基还原酶或重组羰基还原酶的催化下,3-奎宁酮进行不对称还原反应,形成(R)-奎宁醇。
其中3-奎宁酮在反应液中的较佳浓度为10~400g/L。本发明的羰基还原酶的用量为催化有效量,较佳地为200~1000U/L。葡萄糖脱氢酶的用量较佳地为5000U/L。葡萄糖的用量较佳地为10~500g/L。所述的水溶液可为本领域常规缓冲液,只要其pH范围在5.0~8.0即可,优选磷酸盐缓冲液,如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳地为0.05~0.2mol/L,所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称还原反应较佳的是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳地为20~40℃,更佳地为30℃。所述的不对称还原反应的时间较佳地以反应过程中,产物浓度不再持续提高的时间为准。不对称还原反应结束后,可按本领域常规方法从反应液中提取(R)-奎宁醇,例如可以是:在反应溶液中加入酸(比如稀盐酸等)调节pH至2左右使蛋白质沉淀,然后利用硅藻土过滤,滤液利用碱(比如氢氧化钠溶液等)调节pH至12左右,接着用有机溶剂(比如正丁醇等)进行萃取,有机相干燥,过滤,蒸馏得到(R)-奎宁醇。
本发明中,使用粗酶液做催化剂,较佳地应添加辅酶。如果用静息细胞做催化剂则不需要加辅酶,只需利用细胞内所含有的辅酶即可。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:本发明针对已经报道的反应收率低、原料成本昂贵、反应不完全、对应选择性不高或者添加了价格昂贵的辅酶等问题,提供了一种新的羰基还原酶及利用重组羰基还原酶结合辅酶进行不对称还原的方法。在催化浓度高达400g/L的底物时,产物的光学纯度仍高达99%以上,且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于其它不对称还原制备方法,使用本发明方法制备所得的产物浓度高,不必额外添加昂贵的辅酶NAD+,并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点,因此具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1羰基还原酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M为DNA分子量标准,泳道1为PCR扩增的的羰基还原酶基因
图2羰基还原酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。M为分子量标准,泳道1为全菌蛋白裂解液。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明,但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1奎宁酮还原酶基因分离
从上海市奉贤区四团镇朱家村采集土壤样本并提取DNA(提取方法参照Chroma Spin TE-1000,Clontech Laboratories,Inc.,USA),通过控制酶量与反应时间,用Sau3AI部分酶切形成GATC粘性末端,电泳回收0.5~4kb大小的片段,连接到经BamHI酶切的pET-21a表达载体上,酶连产物转化E.coli DH5α并涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上,构建质粒文库。挑选阳性克隆接种到加有1000μL LB(含100μg/mL氨苄青霉素)的96深孔孔板中,37℃培养5~6小时待OD600达到0.8~1.0。利用排枪吸取200μl新鲜菌液转接至新鲜制备的含 100mg/mL氨苄青霉素和1mM IPTG的1000μL LB的96孔深孔板中,25℃培养12小时诱导表达。离心去上清收集菌体,重悬于1/10体积的含溶菌酶和核酸酶的0.1M的磷酸钠缓冲液中,4℃裂解1~2小时使酶液充分释放后离心收取上清,制得粗酶液。奎宁酮还原酶需在辅酶NADH的驱动方能催化底物还原,NADH在340nm下有特异性吸收峰,通过利用酶标仪检测NADH在340nm下吸光值的变化来鉴定奎宁酮还原酶活性。鉴定方法如下:利用排枪将96孔板中的粗酶液转移至经30℃孵育的含有2mM 3-奎宁酮底物、3mM葡萄糖、1单位葡萄糖脱氢酶、0.1mM NAD+的200μL的磷酸盐缓冲液中进行反应。利用酶标仪高通量实时监测340nm处的吸光值变化,初步筛选出吸光值变化明显,奎宁酮还原酶活性较强的重组菌株,重复实验验证并从中筛选出酶活最好的重组菌株。提取质粒并测序。用NCBI的ORF Finder分析其开放读码框(ORF),得到ORF核苷酸序列SEQ ID NO:1,并进一步得到其编码的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
实施例2重组奎宁酮还原酶的表达
根据SEQ ID NO:1合成引物对P1(核苷酸序列为SEQ ID NO:3)和P2(核苷酸序列为SEQ ID NO:4)。使用P1和P2扩增全长ORF序列,PCR体系如下:10×KOD-Plus PCR buffer 2μL,25mM MgSO4 1.2μL,2mM dNTP 2μL,KOD-Plus PCR高保真酶0.3μL,实施例1获得的质粒DNA模板0.5μL(含DNA模板0.1μg),ddH2O 13μL,P1和P2各0.5μL(10mmol/L)。PCR扩增步骤为:(1)95℃,预变性3min;(2)98℃,变性15s;(3)56℃退火30s;(4)72℃延伸1min;步骤(2)~(4)重复30次;(5)72℃继续延伸10min,冷却至12℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化(电泳结果见图1),利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收750~1000bp区间的目标条带,获得一条完整的ORF序列,经DNA测序,全长786bp。
PCR产物切胶回收后,用NdeI/EcoRI酶切后连接到pET21a原核表达载体,并转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞,在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板培养,挑选阳性菌落(BYK-CR基因工程大肠杆菌)接种到100mL液体LB培养基中进行培养。过夜培养物转入1L新鲜的LB液体培养基,培养到OD600达0.6~0.8,加入IPTG至终浓度为100μM诱导重组蛋白表达,降温至30℃继续培养24小时。5000rpm离心收集菌体,用0.2M pH7.0的磷酸钠缓冲液洗一次,每1g菌体重悬于5mL上述磷酸盐缓冲液中,超声波破碎后,SDS-PAGE检验表达水平,电泳结果见图2。
实施例3酶活测定方法
羰基还原酶酶活(U)的定义为每分钟催化1μmol NADH氧化所需要的酶量。
羰基还原酶酶活(U)的测定方法是:在2mL反应液中,加入2mM 3-奎宁酮为底物,0.1mM NADPH为辅因子,再加入20μL粗酶液,测定1分钟内OD340的降低速度为ΔA340。每mL酶液的比酶活U=ΔA340×1000/(6220×20),即每mL裂解液的比酶活力。
实施例4高密度发酵
将按照实施例2获得的BYK-CR基因工程大肠杆菌接种于装有200mL LB液体培养基的1L摇瓶中,于37℃,180~220rpm培养10~16h。将上述培养好的种子培养液按10%(v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基(M9培养基,含葡萄糖4g/L、磷酸氢二钠12.8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵1g/L、硫酸钠0.5g/L、氯化钙0.0152g/L、六水氯化镁0.41g/L)中,在20~30℃,300~800rpm,空气流量2~6L/min的条件下培养。培养6~10h后,以5~20mL/h的速率流加含60%甘油的补料培养基,持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至OD600达到20~40时,添加0.1~1mM IPTG开始诱导。诱导10~20h后放罐,5000rpm离心收集菌体。
实施例53-奎宁酮的不对称还原反应
将400g 3-奎宁酮底物(或其盐酸盐)溶于适量磷酸钠缓冲液,用饱和Na2CO3溶液调节pH至6.0,加入实施例2的全菌裂解液200mL、葡萄糖500g和葡萄糖脱氢酶5000U(购自sigma)、以及0.2mmol/L的NAD+,添加磷酸钠缓冲液定容至1L,30℃搅拌反应2~4小时,饱和Na2CO3控制反应pH在6.0左右,TLC检测反应进程。反应结束后调pH至2.0,升温至70℃加热1小时使蛋白质变性,加硅藻土过滤除去变性蛋白质,后调pH至13.0;等体积正丁醇萃取2次,并用等体积正丁醇洗涤滤渣一次,合并有机相,无水硫酸钠干燥,减压旋干溶剂,得到粗产物,测定纯度。结果如下:纯度95.0~97.0%,摩尔收率88~92%,e.e.值>99%。
TLC条件:乙酸乙酯:乙醇:氨水=10:3:1,碘缸显色。
GC检测反应进度,GC条件为:初始温度100℃,每分钟升高10℃,终温280℃;
e.e.值测定:Chiralpak AD-H柱,正己烷:乙醇(0.1%DEA)=90:10,0.8mL/min,220nm,Agilent1260。
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