CN103555608A - 一种奎宁酮还原酶及其在不对称合成(r)-3-奎宁醇中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种放射形土壤杆菌，其表达的奎宁酮还原酶及其基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，其重组酶及其制备方法，以及该重组酶作为催化剂在不对称还原3-奎宁酮制备(R)-3-奎宁醇中的应用。与制备(R)-3-奎宁醇的其他方法相比，使用本发明的奎宁酮还原酶所制备的(R)-3-奎宁醇不仅产物浓度高，而且光学纯度好，反应条件温和，操作简便，易于放大，因此在抗胆碱药物中间体的生产中具有很好的工业应用前景。

Description

一种奎宁酮还原酶及其在不对称合成(R)-3-奎宁醇中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)CGMCC7986，该放射形土壤杆菌表达的奎宁酮还原酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，及其重组酶和该重组酶的制备方法，还涉及该奎宁酮还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原3-奎宁酮以制备(R)-3-奎宁醇中的应用。 

背景技术

(R)-3-奎宁醇(分子式为C₇H₁₃NO，分子量为127.18，CAS号：25333-42-0)是合成多种抗胆碱药物(如他沙利定、瑞伐托酯等)的重要手性砌块。该类药物主要用于治疗慢性阻塞性肺病、老年痴呆症等。(R)-3-奎宁醇的手性合成技术具有广阔的应用前景。(R)-3-奎宁醇的合成有化学法和生物法两种。与化学方法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、立体选择性强等多种优点。生物法又包括动力学拆分和不对称合成。 

生物不对称合成法研究得较多的是用野生菌或重组工程菌的整细胞或游离酶进行催化。日本Sakayu Shimizu课题组利用从深红酵母(Rhodotorula rubra)中克隆得到的还原酶催化3-奎宁酮不对称还原得到(R)-3-奎宁醇，产物浓度达到618mM，且对映体过量值(ee)>99.9%，但此酶的K_m值高达145mM，这一高K_m值表明该酶对底物的亲和力较弱，底物浓度较低时反应速率较慢，底物浓度为120mM时，反应速率仅为最大速率的46%，导致反应时间的延长(Appl.Microbiol.Biotechnol.2009,83,617-626)。朱敦明等利用传统的土壤筛选法分离到两株微生物：诺卡氏菌(Nocardia sp.)WY1202和红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)WY1406，催化3-奎宁酮的不对称还原分别生成(R)-奎宁醇和(S)-奎宁醇，底物最高浓度为99mM(J.Mol.Catal.B-Enzym.2013,88,14-19)。日本Nobuya Itoh等人筛选到一株淡黄微杆菌(Microbacterium luteolum)JCM9174，该菌能够还原3-奎宁酮生成(R)-奎宁醇，并从中挖掘到两个NADH依赖性还原酶QNR和BacC，它们能催化313mM底物的转化，12小时转化率分别达到100%和94%，且ee>99.9%。QNR和BacC经纯化后，测得其比活力分别为8.4U/mg 和0.5U/mg(Appl.Environ.Microbiol.2013,79,1378-84)。 

然而，以上方法仅限于实验室规模，且存在酶自身活力低，产物浓度不高，以及反应时间较长等缺陷，不适合工业化生产(R)-3-奎宁醇(一般要求产物浓度应在100g/L以上)。因此，仍然需要筛选活力高、且能以较短反应时间获得较高产物浓度的奎宁酮还原酶，以满足工业化生产(R)-3-奎宁醇的需求。 

发明内容

针对生物催化不对称合成(R)-3-奎宁醇中现有酶的上述缺陷，发明人提供了一种放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)CGMCC7986，该菌株所表达奎宁酮还原酶的催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好。 

另一方面，发明人提供了一种新的奎宁酮还原酶，所述奎宁酮还原酶的编码基因，含有所述基因的重组表达载体、重组表达转化体，以及所述奎宁酮还原酶的高效制备方法。 

另一方面，发明人还提供了利用所述放射形土壤杆菌、所述奎宁酮还原酶来催化不对称合成(R)-3-奎宁醇的方法。 

在一种实施方式中，本发明涉及放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)CGMCC7986，该菌所表达的奎宁酮还原酶能高效催化奎宁酮不对称还原以制备(R)-3-奎宁醇。例如，在底物浓度为10mM时，以所述放射形土壤杆菌的1g湿细胞为生物催化剂能在12小时内使奎宁酮的转化率达93%，产物的光学纯度为99%ee(R)。 

在另一种实施方式中，本发明涉及奎宁酮还原酶，所述酶是：(a)由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)由SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有奎宁酮还原酶活性的衍生蛋白质。在一个具体的实施方式中，所述衍生蛋白质具有SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。 

本发明还涉及蛋白质的编码基因，其编码的蛋白质可用于以奎宁酮为底物不对称还原制备(R)-3-奎宁醇。在一个具体的实施方式中，本发明提供编码上述蛋白质(a)或(b)的基因。在一个更具体的实施方式中，所述基因为奎宁酮还原酶基因，其具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。 

本发明的奎宁酮还原酶基因可以克隆自放射形土壤杆菌CGMCC7986或者按照本领域常规技术合成得到。 

本发明提供一种包含本发明还原酶基因的核苷酸序列的重组表达质粒。其可通过本领域常规方法将本发明的还原酶基因的核苷酸序列连接于各种合适载体上构建而成。所述载体可以是本领域的各种常规载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述载体优选质粒，更优选质粒pET28a。所述还原酶基因可以操作性连接于表达合适的调控序列，以实现所述奎宁酮还原酶的组成型或诱导型表达。 

本发明提供一种包含本发明还原酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中来制得所述重组表达转化体。所述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞，前提是能使所述重组表达载体稳定地自行复制，且其所携带的还原酶基因可被有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)或大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α。 

本发明还提供一种重组奎宁酮还原酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组奎宁酮还原酶。其中，培养所述重组表达转化体所用的培养基可选自本领域的常规培养基，前提是可使转化体生长并产生本发明的还原酶。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。 

本发明提供一种新型的奎宁酮还原酶作为催化剂，应用于3-奎宁酮的不对称还原以制备(R)-3-奎宁醇。所述不对称还原反应的底物为3-奎宁酮，具体的反应条件如底物浓度、pH、缓冲液组成、酶用量等可按本领域此类反应的常规条件进行选择。所述的不对称还原反应可在振荡或搅拌条件下进行。所述不对称还原反应的时间优选以转化率>99%为准。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法，从反应混和液中提取手性醇产物。 

本发明的积极进步效果在于：本发明提供了一种放射形土壤杆菌菌株，以及由该菌株表达的奎宁酮还原酶，所述菌株或其奎宁酮还原酶可以高效催化奎宁酮的不对称还原以制备光学纯(R)-3-奎宁醇。在底物浓度高达1.5mol/L(或242g/L)时，产物的光学纯度仍达99%ee以上。相对于其它不对称还原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，光学纯度好，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。 

通过随后的描述和所附权利要求，本领域技术人员会明白本申请的其他目标、 特征、优点和各方面。然而，应当理解，虽然表明了本申请的优选实施方式，但以下描述、所附的权利要求和具体实施例仅是为了说明而给出。本领域技术人员阅读下文后不难明白属于本发明构思和范围内的各种改变和改进。 

附图简要说明 

图1为奎宁酮还原酶催化3-奎宁酮生成(R)-3-奎宁醇的示意图。 

图2为不同野生菌对10mM奎宁酮的转化率。其中(●)表示放射形土壤杆菌Agrobacterium radiobacter CGMCC7986，(○)表示其它野生菌。 

图3为基因ArQR的PCR扩增电泳图谱，其中：1～2.基因ArQR的PCR扩增产物；3.DNA Marker(Marker III，北京天根生化科技有限公司)。 

图4为重组还原酶ArQR的聚丙烯凝胶电泳图。 

图5为重组表达质粒pET-ArQR的构建示意图。 

发明详述 

本说明书中，除非另有注明具体条件，实施例中各实验方法均按照常规方法和条件或按照试剂说明书进行。除非另有明确标注，各组分的含量均以质量/体积(w/v)含量表示。 

活性奎宁酮还原酶的基因克隆 

发明人以3-奎宁酮为底物，对本实验室分离保藏的野生菌种进行筛选，发现一株能够高效催化3-奎宁酮还原生成(R)-3-奎宁醇的放射形土壤杆菌ECU2556(原分离自上海植物园，现保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号(邮政编码100101)中国科学院微生物研究所内的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2013年8月9日，保藏号为：CGMCC7986)。 

发明人采用鸟枪法来克隆上述放射形土壤杆菌中的奎宁酮还原酶。首先将上述放射形土壤杆菌在含蛋白胨5g/L、肉浸膏3g/L，pH为7.0的培养基中于30℃下培养2天。所得培养液经离心获得菌体沉淀，并以本领域常规技术提取获得总DNA。所得总DNA可采用限制性内切酶进行酶切以形成特定的粘性末端，例如，可通过Sau3AI酶切形成GATC粘性末端。通过控制酶用量和反应时间，把总DNA酶切成1～5kb的片段并进行回收。将这些片段与BamHI(识别序列GGATCC)酶切的pET-28a载体以相同粘性末端高效连接。用酶连产物 转化感受态细胞E.coli DH5α后，涂布到含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基平板上，倒置平皿，于37℃培养12～16小时后，挑取白色单菌落进行活性筛选。用无菌牙签将单菌接种至LB固体培养基平板进行保存，随后接种至96孔深孔板培养，待OD₆₀₀达到0.6～0.8时，加入0.2mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，25℃诱导12h后，离心培养液收集细胞，用pH7.0的缓冲液悬浮所得细胞，利用溶菌酶进行细胞破碎后离心，收取上清液，加入甘油至终浓度10%后即为粗酶液，于-80℃保存备用。通过检测340nm处吸光值变化的方式，利用分光光度计对细胞破碎液进行奎宁酮还原活性鉴定。还原酶活力测定方法如下：反应介质(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0)中，加入2mmol/L3-奎宁酮，0.1mmol/L NADH，30℃保温2分钟后加入适量粗酶液，迅速混匀，实时检测340nm处的吸光值变化。检测发现有一个重组菌株的破碎液具有显著的奎宁酮还原活性。 

由上海赛音生物技术公司对获得的具有显著奎宁酮还原活性的阳性克隆中所插入的外源片段进行测序。测定结果表明，外源片段长度为1590bp，利用ORF Finder在线预测开放阅读框(ORF)，发现其中600bp～1200bp的开放阅读框只有一个，根据这个ORF进行引物设计，所用的上游引物为：GAATTCCATATGGAGGCTTCATTGTCGG；下游引物为：CGCGGATCCTCAGTCCATGCGAACGCCAC。然后以放射形土壤杆菌Agrobacterium radiobacter CGMCC7986的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得包含奎宁酮还原酶全长基因的PCR产物，序列如SEQ ID No.5所示。 

本发明中，所得奎宁酮还原酶全长基因命名为ArQR，其碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示，全长786bp，其起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，序列中无内含子，编码序列(CDS)从第1个碱基起至第783个碱基止，所编码的蛋白质具有如序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。 

由于密码子的简并性，编码SEQ ID No.2的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID No.1。本领域技术人员可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来获得该碱基序列的同系物，本发明涵盖这些同系物，只要其表达的重组酶保持奎宁酮还原活性即可。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ ID No.1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失 或增加来制得。 

奎宁酮还原酶的重组表达 

本发明的重组表达载体可通过下述示例性方法制得：将通过PCR扩增所得的包含奎宁酮还原酶基因的PCR产物(如SEQ ID No.5所示)用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切，形成互补的粘性末端，同时将克隆载体片段和表达载体pET28a用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切，经T4DNA连接酶连接经过酶切的基因片段和表达载体，形成含有本发明的奎宁酮还原酶基因的重组表达质粒pET-ArQR。将所述重组表达质粒pET-ArQR转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-ArQR。 

在所述重组表达转化体是大肠杆菌时，优选LB培养基，该培养基含有蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生奎宁酮还原酶即可。转化体的培养和奎宁酮还原酶的产生，可优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3))接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5-0.7(优选0.6)时，在终浓度为0.1-1.0mmol/L(优选0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组奎宁酮还原酶。 

奎宁酮的不对称还原 

可以利用本发明的奎宁酮还原酶如图1所示将奎宁酮不对称还原生成光学活性的奎宁醇。具体而言，可按下述示例性方法进行：在pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD⁺的存在下，在本发明的奎宁酮还原酶或重组奎宁酮还原酶的作用下，对3-奎宁酮进行不对称还原反应，制得光学活性(R)-3-奎宁醇。优选如下：底物3-奎宁酮在反应液中的浓度可以为0.5～1.5mol/L。本发明奎宁酮还原酶的酶活单位1U定义为每分钟催化1μmol底物生成产物所需的酶量。根据所采用的反应体系，奎宁酮还原酶可以不同，例如，其用量可以为25～50kU/L。在奎宁酮的不对称还原时，为了进行辅酶循环，向反应体系中额外添加葡萄糖和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(制备方法参见：Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology2011,38,633–641)。取 决于不同反应体系，葡萄糖脱氢酶的活力单位可以与奎宁酮还原酶的活力单位相当，例如葡萄糖脱氢酶的用量可以为25～50kU/L。葡萄糖的用量可以为149～445g/L，NAD⁺的用量可以为0～1mmol/L。所述磷酸盐缓冲液可以是本领域常规的任何磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度可以为0.05～0.2mol/L。所述的不对称还原反应的温度可以为25～35℃，优选30℃。 

在符合本领域常识的基础上，可任意组合上述各种条件以得到本发明的实施方式。 

除非另有说明，本发明所用试剂和原料均为市售可得。 

具体实施方式

本发明人从本实验室保藏的野生菌中进行奎宁酮还原的功能测定，挑选出能够还原3-奎宁酮生成(R)-3-奎宁醇的菌种，通过鸟枪法获得能够高效的不对称催化还原3-奎宁酮生成(R)-3-奎宁醇的基因，从而完成了本发明。 

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。 

下列实施例中的材料来源为： 

放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)CGMCC7986。 

表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。 

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。 

实施例2～3所描述的过程如图5所示。 

实施例1野生型放射形土壤杆菌催化3-奎宁酮的不对称还原 

放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)CGMCC7986在含蛋白胨5g/L、肉浸膏3g/L，pH为7.0的培养基中于30℃下培养2天。所得培养液经离心获得菌体沉淀，以10g/L所述放射形土壤杆菌的湿细胞为生物催化剂，在底物浓度为10mM时，能在12小时内使奎宁酮的转化率达93%，产物的光学纯度为99%ee(R)。 

实施例2奎宁酮还原酶基因的克隆 

根据鸟枪法克隆所得到的开放阅读框为依据，设计PCR引物如下： 

上游引物:GAATTCCATATGGAGGCTTCATTGTCGG； 

下游引物为:CGCGGATCCTCAGTCCATGCGAACGCCAC 

其中，上游引物中带下划线部分为NdeI酶切位点，下游引物中带下划线部分为BamHI酶切位点。 

以Agrobacterium radiobacter CGMCC7986的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix25μl，上游引物和下游引物各1.5μl(0.3μmol/L)，DNA模板1.5μl(0.1μg)，DMSO2μl和ddH₂O19μl。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性1min；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收700～900bp区间的目标条带(图3)。获得包含奎宁酮还原酶全长基因的PCR产物，其碱基序列如SEQ ID No.5所示，经DNA测序，奎宁酮还原酶基因全长786bp，命名为ArQR，其碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示。 

实施例3重组表达质粒和重组表达转化体的制备 

将实施例2所得的包含奎宁酮还原酶基因的PCR产物在37℃用限制性内切酶NdeI和BamHI双酶切12小时，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。在T4DNA连接酶的作用下，将目标片段与同样经NdeI和BamHI酶切后的载体质粒pET28a，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET-ArQR。 

将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-ArQR，菌落PCR证实为阳性克隆。 

实施例4重组奎宁酮还原酶的表达 

将实施例3所得的重组大肠杆菌，接种至含硫酸卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1%(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12小时后，将培养液离心，收集细胞，并用生 理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于10mL pH7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组奎宁酮还原酶的粗酶液，加入甘油至终浓度10%后如前文所述冷冻保存。所得粗酶液中蛋白浓度为4mg/mL。粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析(图4)，重组蛋白在细胞中以部分可溶的形式存在，另外有部分蛋白存在于细胞碎片中。 

实施例5重组奎宁酮还原酶和葡萄糖脱氢酶活力的测定 

利用分光光度计，通过检测340nm处吸光值的变化来测定还原酶和葡萄糖脱氢酶的活力。 

还原酶活力的测定方法如下：1ml反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0)中，加入2mmol/L3-奎宁酮，0.1mmol/L NADH，30℃保温2分钟后加入实施例4制备的适量粗酶液，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。测得该粗酶液的比活为70U/mg粗蛋白。 

葡萄糖脱氢酶活力测定方法如下：1ml反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0)中，加入10mmol/L葡萄糖，1mmol/L NAD⁺，30℃保温2分钟后加入葡萄糖脱氢酶(制备方法参见：Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology2011,38,633–641)，迅速混匀，实时检测340nm处吸光值的变化。 

酶活力的计算公式为：酶活力(U)=EW×V×10³/(6220×l)；式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位mL；6220为NADH的摩尔消光系数，单位L/(mol·cm)；l为光程距离，单位cm。每单位奎宁酮还原酶的定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol NADH氧化所需的酶量。每单位葡萄糖脱氢酶的定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol NAD⁺还原所需的酶量。 

实施例6重组奎宁酮还原酶ArQR催化3-奎宁酮的不对称还原 

在0.4ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH7.0)中加入ArQR粗酶液(如实施例4所述制备)和葡萄糖脱氢酶粗酶液(制备方法参见：Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology2011,38,633–641)，使奎宁酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的含量各为5U，加入3-奎宁酮、NAD⁺和葡萄糖至终浓度分别为10mmol/L、0.5mmol/L和3g/L。在30℃，1100rpm振荡反应3小时。反应结束后用NaOH调至pH约13，加入0.4mL三氯甲烷进行萃取，萃取两次，萃取液 合并后加无水硫酸钠干燥过夜，然后分析测定底物转化率和还原产物的ee值。 

产物ee值的具体分析条件如下： 

使用气相色谱仪进行分析，色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB，以氮气为载气，进样口温度220℃，检测器温度220℃，柱温140℃。 

测得用ArQR以上述条件不对称还原3-奎宁酮所得(R)-3-奎宁醇的转化率大于99%，产物的ee值大于99.0%(R)。 

实施例7-8重组奎宁酮还原酶ArQR催化3-奎宁酮的不对称还原 

在10ml磷酸钾缓冲液(200mmol/L，pH7.0)中加入实施例4制备的ArQR粗酶液和葡萄糖脱氢酶粗酶液使奎宁酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的含量各为900U，加入3-奎宁酮、葡萄糖和NAD⁺至终浓度分别为1mol/L、270g/L和0.1mmol/L(实施例7)或1.5mol/L、405g/L和0.1mmol/L(实施例8)。反应都在30℃下进行，通过补充碱液NaOH使pH控制为7.0，直至反应完全，即控制pH的碱液NaOH不再滴加，滴定曲线趋平。实施例7用时1.5小时，实施例8用时4.5小时。反应结束后用NaOH将pH调至约13，反应液用10mL三氯甲烷萃取两次，萃取液合并后加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。具体分析条件为：以氮气为载气，进样口温度220℃，检测器温度220℃，柱温140℃。结果见表2。 

表2.ArQR催化3-奎宁酮不对称还原的结果 

实施例9奎宁酮还原酶的点突变 

对实施例2所得的奎宁酮还原酶ArQR全长基因序列(SEQ ID No.1)进行碱基突变，分别将还原酶基因编码序列的第75位的A突变为C，第321位的C突变为G，第525位的T突变为A，第621位的C突变为T(除321位的突变 外，其余均为沉默突变)，从而得到如SEQ ID No.3所示的突变基因的碱基序列。其编码的氨基酸序列为SEQ ID No.4，即将放射性农杆菌ECU2556的还原酶(SEQ ID No.2)第107位的Asp突变为Glu，因此该突变基因所编码的奎宁酮还原酶命名为ArQR D107E。如实施例3所述的方法用该突变基因制备重组转化体，并按照实施例4的方法制备静息细胞和ArQR D107E粗酶。 

实施例10-11突变奎宁酮还原酶ArQR D107E催化3-奎宁酮的不对称还原 

在10ml磷酸钾缓冲液(200mmol/L，pH7.0)中加入实施例9制备的ArQR D107E粗酶液和葡萄糖脱氢酶粗酶液使奎宁酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的含量各为900U，加入3-奎宁酮、葡萄糖和NAD⁺至终浓度分别为1mol/L、270g/L和0.1mmol/L(实施例10)或1.5mol/L、405g/L和0.1mmol/L(实施例11)。反应在30℃下进行，通过补充碱液NaOH使pH控制为7.0，直至反应完全，即控制pH的碱液NaOH不再滴加，滴定曲线趋平，实施例10用时1.2小时，实施例11用时4.0小时。反应结束后将pH调至约13，反应液用三氯甲烷萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。具体分析条件为：以氮气为载气，进样口温度220℃，检测器温度220℃，柱温140℃。结果见表3。 

表3.ArQR催化3-奎宁酮不对称还原的结果 

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

序列表

 

Claims (10)

1.一种放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)CGMCC7986，其特征在于，所述放射形土壤杆菌表达奎宁酮还原酶。 

2.一种奎宁酮还原酶，其特征在于，所述奎宁酮还原酶是： 

(a)具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质；或 

(b)由SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有奎宁酮还原酶活性的衍生蛋白质。 

3.如权利要求2所述的奎宁酮还原酶，其特征在于：所述具有奎宁酮还原酶活性的衍生蛋白质是具有SEQ ID No.4所示氨基酸序列的蛋白质。 

4.一种奎宁酮还原酶的编码基因，其特征在于，所述基因编码的蛋白质是： 

(a)具有SEQ ID No.2或4所示氨基酸序列的蛋白质；或 

(b)由SEQ ID No.2或4所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有奎宁酮还原酶活性的衍生蛋白质。 

5.如权利要求4所述的编码基因，其特征在于，所述基因的碱基序列为： 

(1)如SEQ ID No.1所示； 

(2)如SEQ ID No.3所示； 

(3)对(1)或(2)所示碱基序列的一个或多个碱基进行替换、缺失或增加得到的多聚核苷酸的同系物，前提是其所编码的蛋白质仍具有奎宁酮还原酶活性。 

6.一种重组表达载体，其包含如权利要求4或5所述的奎宁酮还原酶编码基因。 

7.一种重组表达转化体，其包含如权利要求6所述的重组表达载体。 

8.一种重组奎宁酮还原酶的制备方法，所述方法包括：培养如权利要求7所述的重组表达转化体，获得重组表达的奎宁酮还原酶或含奎宁酮还原酶的重组生物细胞。 

9.用如权利要求2所述的奎宁酮还原酶或如权利要求8所述方法获得的重组奎宁酮还原酶催化3-奎宁酮不对称还原制备(R)-3-奎宁醇的方法。 

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于： 

所述奎宁酮还原酶催化3-奎宁酮不对称还原在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD⁺的存在下进行，和/或 

反应条件为：反应温度25～35℃，pH6.5～7.5。 

Images