CN102242085B - 一种环氧水解酶及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的环氧水解酶及其基因，含有该基因的重组表达子和重组表达转化体，利用重组表达转化体制备重组酶的方法，以及该重组环氧水解酶在催化外消旋环氧化物对映选择性水解以生产手性环氧化物或二醇中的用途。本发明所述的重组环氧水解酶来源于巨大芽孢杆菌，可作为催化剂用于合成多种光学活性环氧化物和邻位二醇，具有催化效率高，对映选择性强，反应条件温和对环境友好等优点。与野生菌的整细胞相比，本发明的环氧水解酶催化效果更佳，底物适用性更广，具有很好的工业应用前景。

Description

一种环氧水解酶及其基因和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种新的环氧水解酶及其基因，含有该基因的重组表达子和重组表达转化体，利用重组表达转化体制备重组酶的方法，以及该重组环氧水解酶在催化外消旋环氧化物对映选择性水解以生产手性环氧化物中的应用。

背景技术

光学活性的环氧化物及其水解产物邻位二醇在手性化合物的合成中被广泛应用，在医药、农药、铁电液晶、香料、精细化学品工业上有着极其重要的应用价值，如(S)-构型的缩水甘油芳基醚是手性氨基醇和生物活性物质(如β-受体阻断剂)合成的中间体(Curr.Med.Chem.2007，14：53-65)。目前光学纯环氧化物的制备方法主要有化学法和生物法。在化学催化中，应用合适的催化剂催化烯烃的不对称环化反应或外消旋环氧化物的水解反应可以获得单一构型的环氧化物或相应的邻位二醇，但是化学法存在着许多问题，如反应条件苛刻、底物谱较窄以及重金属污染等。相比之下，由环氧水解酶催化的消旋环氧化物的动力学拆分反应制备光学纯的环氧化物和相应的邻位二醇，由于具有以下优点而更具有吸引力：1)外消旋环氧化物的制备相对比较简单；2)环氧水解酶来源广泛，底物谱广，选择性好；3)酶促反应不需要辅酶或金属离子的协助；4)该酶能在非水溶剂中发挥催化功能。酶催化过程条件温和，几乎无环境污染，符合“绿色化学”的趋势，因此该方法在光学纯环氧化物的制备中非常具有潜力。

环氧水解酶(Epoxide hydrolase，EH，EC3.3.2.3)是广泛存在于植物、昆虫、哺乳动物以及微生物体内的一类水解酶，在不同的生物体内发挥不同的生理功能。其中以哺乳动物来源的EH发现得最早，研究得最成熟，主要参与内源或外源毒性物质的分解代谢。植物EH来源比较丰富，陆续发现大豆、拟南芥、菠萝、土豆、绿豆和烟叶等常见植物中都有EH存在，它们主要参与角质的合成，并与某些胁迫反应(如干旱胁迫)相关。微生物的基因组能够编码多种类型的EH(可溶性EH、白三烯A4水解酶和微粒体EH等)，它们在分解代谢自然环境中特定的碳源以及环境污染物的过程中发挥着重要的作用。由于微生物丰富的多样性、生长速度快、易于培养，酶的产量高等优点，目前EH最主要的来源还是微生物。国内外已有大量关于产EH微生物的筛选、纯化及其基因克隆表达的文献报道(Tetrahedron：Asymmetry 1998，9：459-466)。目前在市场上已有来源于黑曲霉(Aspergillus niger)，放射土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)和紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)的环氧水解酶制剂产品出售。尽管如此，由于可供选择的酶制剂种类少，且它们的底物作用范围有限，对于一些特定底物的对映选择性低等缺点，还无法满足大规模工业应用的要求。因此筛选高对映选择性和高活性的EH仍是目前研究的主要方向。

目前发现的EH催化外消旋缩水甘油芳基醚水解时，绝大多数都是优先水解(S)-构型的环氧底物，只有很少的EH能够优先水解(R)-构型的底物(Appl.Environ.Microbiol.2006，72：2905-2917)，进而得到对于合成β-阻断剂唯一有用的(S)-构型环氧化物。然而这些(R)-选择性EH的催化活性往往又都较低，如重组枯草芽孢杆菌(B.subtilis)环氧水解酶Bsueh，对于缩水甘油苯基醚的比活力仅为0.01μmol min^-1 mg^-1(Appl.Environ.Microbiol.2006，72：2905-2917)。因此获得对于缩水甘油芳基醚具有高活性且高对映选择性水解(R)-构型环氧键的EH，仍是一项挑战性的工作。通过Swiss-prot数据库检索，发现目前在芽孢杆菌属中已有18种菌种含有预测的EH基因，然而只有枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中的EH被克隆表达，其他菌种的EH克隆未见报道。

目前已知巨大芽孢杆菌(B.megaterium)ECU1001，即CGMCC No.1293(J.Mol.Catal.B：Enzym.2001，13：61-68)可催化多种缩水甘油芳基醚水解生成光学活性手性环氧化物。但是以该野生菌株的整细胞作为催化剂时，由于酶产量很低，导致总体催化活性不高，从而限制了生物催化剂的优势发挥。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对以野生型巨大芽孢杆菌(B.megaterium)整细胞催化缩水甘油芳基醚不对称水解时酶产量较低，导致总体催化活性不高、底物谱较窄的缺陷，提供一种催化活性高、对映选择性强、底物适用性广、对环境友好的环氧水解酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，重组酶的制备方法，以及该重组环氧水解酶的应用。

本发明通过下述技术方案解决了上述问题：

本发明的第一方面提供一种环氧水解酶，其氨基酸序列如序列表中SEQID No.2或SEQ ID No.4所示。

本发明的该环氧水解酶来源于巨大芽孢杆菌(B.megaterium)ECU1001。巨大芽孢杆菌(B.megaterium)ECU1001现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.1293。该菌株是从土壤中筛选得到的，在发明专利(200510023852.3)及文献(J.Mol.Catal.B：Enzym.2001，13：61)中有详细说明。

本发明的第二方面提供一种环氧水解酶基因，其(1)碱基序列如序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示；或(2)编码氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.2或SEQ ID No.4所示的蛋白质。

本发明的环氧水解酶基因来源于巨大芽孢杆菌(B.megaterium)CGMCCNo.1293。具体制备方法可为：根据Genbank中收录的巨大芽孢杆菌QMB1551的水解酶基因序列和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)ATCC 10987的水解酶基因序列设计合成引物。较佳的，引物1(扩增BMEH I基因)为：上游引物：CACGGATCCATGAGTAAACAGTATATAAACGT，下游引物：GGCGTCGACTTACTTATTTAAAAAATTCCACAT；引物2(扩增BMEH II基因)为：上游引物：CACGGATCCATGGAGAAAGTAAAAGCAATACT，下游引物：GGCGTCGACTTACACATTAGACTTTCCTTTTTC。然后以巨大芽孢杆菌(B.megaterium)CGMCC No.1293的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得两条完整的环氧水解酶全长基因序列，分别为：

1)碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的基因，命名为BMEH I，全长864bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第861个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

2)碱基序列如序列表中SEQ ID No.3所示的基因，命名为BMEH II，全长747bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第744个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。

如本领域技术人员所知，本发明的环氧水解酶基因的碱基序列也可以是编码序列表中SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示氨基酸序列的其他任何碱基序列。

本发明的第三方面提供一种包含本发明的环氧水解酶基因的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的环氧水解酶基因的连接于各种表达载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的环氧水解酶基因产物与载体pMD-18T连接，形成克隆载体pBMEHI-18T或pBMEHII-18T，之后将克隆载体和表达载体pET28a用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切，形成互补的粘性末端，再经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的环氧水解酶基因的重组表达载体pET-BMEHI或pET-BMEHII。

本发明的第四方面提供一种包含本发明的环氧水解酶基因重组表达载体的重组表达转化体。其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的环氧水解酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)或E.coliDH5α。将前述重组表达质粒pET-BMEHI或pET-BMEHII转化至E.coliBL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET-BMEHI或E.coli BL21(DE3)/pET-BMEHII。

本发明的第五方面提供一种重组环氧水解酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组表达的环氧水解酶。其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物得到。其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可为本领域任何可使转化体生长并产生本发明的环氧水解酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生本发明所述的环氧水解酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及的的重组大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3)重组表达转化体接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5-0.7(优选0.6)时，在终浓度为0.1-1.0mmol/L(优选0.5mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组环氧水解酶。

本发明的第六方面提供一种本发明的环氧水解酶作为催化剂在对映选择性动力学拆分外消旋环氧化物以制备光学纯手性环氧化物中的应用。

较佳的，所述的应用按下述方法进行：在pH 6-9的磷酸盐缓冲液中，在本发明的环氧水解酶或重组环氧水解酶的作用下，将外消旋环氧化物进行不对称水解反应，制得光学活性手性环氧化物。

上述应用中，所述的不对称水解反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：

所述的外消旋环氧化物较佳的为缩水甘油芳基醚或苯乙烯氧化物化合物。所述的缩水甘油芳基醚中的芳基较佳的为苯基或萘基，本发明优选如式1、2或3所示的外消旋环氧化物：

其中，R₁为-H、-Cl、-NO₂或-CH₃，R₁取代的位置为苯基的邻位、间位或对位；R₂为-H、-Cl或-NO₂，R₂取代的位置为苯基的邻位、间位或对位。

所述的外消旋环氧化物在反应液中的浓度为0.1～200mmol/L，较佳的为1～20mmol/L。本发明中重组环氧水解酶的用量为催化有效量，较佳的为8～800U/mL。每单位环氧水解酶活力(U)定义为在分析条件下，每分钟催化水解1μmol缩水甘油苯基醚所需的酶量。所述的磷酸盐缓冲液可为本领域常规磷酸盐缓冲液，如磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05～0.1mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的水解反应的温度较佳的为20～35℃。所述的水解反应的时间较佳的以剩余的环氧化物的ee＞99％为准，一般为1分钟～3小时。水解反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取(S)-或(R)-型手性环氧化物。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的BMEH I与已知的EH相似性很低(＜38％)，该酶具有非常少见的反常规的对映选择性，且比活和选择性都很高。如表1所示，BMEH I对于缩水甘油苯基醚(实施例4)E值达到58，它是目前发现的对于该底物选择性最高的一种天然EH。另外本发明还首次发现BMEH I对于邻硝基缩水甘油苯基醚的选择性(实施例8)与其它缩水甘油芳基醚的相反，该现象的研究将加深对EHs催化机制的理解。与BMEH II相似的基因全部为芽孢杆菌属的预测的水解酶，BMEH II为首次成功克隆表达并被证实为环氧水解酶，因此对该酶的研究也具有重要意义。本发明的环氧水解酶或其重组酶可作为催化剂应用于制备手性环氧化物，具有催化效率高，对映选择性强，反应条件温和，对环境友好。与野生菌的整细胞相比，本发明的环氧水解酶催化效果更佳，底物适用性更广，具有很好的工业应用前景。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1为基因BMEH I的PCR扩增电泳图谱。其中，1、基因BMEH I的PCR扩增产物；2、DNAMarker(Marker IV，北京天根生化科技有限公司)。

图2为基因BMEH II的PCR扩增电泳图谱。其中，1、基因BMEH II的PCR扩增产物；2、DNA Marker(Marker IV，北京天根生化科技有限公司)。

图3为克隆质粒pBMEHI-18T的BamHI和SalI的双酶切分析图谱。其中，1、DNA Marker(Marker IV，北京天根生化科技有限公司)；2、pBMEHI-18T/BamHI+SalI。

图4为克隆质粒pBMEHII-18T的BamHI和SalI的双酶切分析图谱。其中，1、DNA Marker(Marker IV，北京天根生化科技有限公司)；2、pBMEHII-18T/BamHI+SalI。

图5为重组表达质粒pET-BMEH I的构建示意图。

图6为重组表达质粒pET-BMEH II的构建示意图。

图7为重组环氧水解酶BMEH I和BMEH II的聚丙烯凝胶电泳图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下列实施例中的材料来源为：

巨大芽孢杆菌(B.megaterium)CGMCC No.1293：该菌株从土壤中分离得到，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

质粒pMD18-T购自大连TaKaRa公司。

表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

实施例1～2过程如图5～6所示。

实施例1 环氧水解酶基因的克隆

依据Genbank中收录的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)QM B1551水解酶基因序列BMQ_2920和蜡状芽孢杆菌(B.cereus)ATCC 10987水解酶基因序列BCE_0353，设计PCR引物如下：

引物1(扩增BMEH I基因)：

上游引物：CACGGATCCATGAGTAAACAGTATATAAACGT

下游引物：GGCGTCGACTTACTTATTTAAAAAATTCCACAT

引物2(扩增BMEH II基因)：

上游引物：CACGGATCCATGGAGAAAGTAAAAGCAATACT

下游引物：GGCGTCGACTTACACATTAGACTTTCCTTTTTC

其中，上游引物下划线部分为BamHI酶切位点，下游引物下划线部分为SalI酶切位点。

以巨大芽孢杆菌(B.megaterium)CGMCC No.1293的基因组DNA为模板，分别用引物1和引物2进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix15μl，上游引物和下游引物各1μl(0.3μmol/L)，DNA模板1μl(0.1μg)和ddH₂O 12μl。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性5min；(2)94℃，变性45s；(3)60℃退火1min；(4)72℃延伸1min；步骤2～4重复35次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收700～900bp区间的目标条带(分别见图1和图2)。送上海生工公司测序，确认是目的条带，分别获得一条完整的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)CGMCC No.1293的环氧水解酶全长基因序列：

基因1，命名为BMEH I，全长864bp，碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

基因2，命名为BMEH II，全长747bp，碱基序列如序列表中SEQ ID No.3所示。

实施例2 重组表达载体(质粒)和重组表达转化体的制备

将实施例1所得的PCR产物与pMD-18T载体连接，分别构建克隆质粒pBMEHI-18T和pBMEHII-18T。之后分别转化至E.coli DH5α感受态细胞。通过菌落PCR筛选阳性克隆，提取质粒，在37℃用限制性内切酶BamHI和SalI双酶切12h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段，其中含有正确的插入片段(分别见图3和图4)。将目标片段与同样经BamHI和SalI酶切后的质粒pET28a混合，在T4DNA连接酶的作用下，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET-BMEHI和pET-BMEHII。

分别将上述重组表达质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中。在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，培养重组菌株，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，分别获得2株阳性重组转化体E.coli BL21(DE3)/pET-BMEHI和E.coli BL21DE3)/pET-BMEHII。

实施例3 重组环氧水解酶的表达

分别将实施例2所得的2株重组大肠杆菌，接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。按1％(v/v)的接种量接入装有50ml LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)的250ml三角瓶中，置37℃、180rpm摇床震荡培养。当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG作为诱导剂。16℃诱导20h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次。将所得的静息细胞悬浮于100mmol/L，pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，在冰浴中超声破碎(功率400W，工作6s，间隙4s，超声99次)。8800rpm离心20min收集上清液，即为重组环氧水解酶的粗酶液。粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析(分别见图7A、B)，两个重组蛋白以部分可溶的形式存在。

实施例4-19 重组环氧水解酶BMEH I催化动力学拆分环氧化合物

取BMEHI粗酶冻干粉溶解于磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中，混匀后于30℃保温10min，再加入含有环氧底物的DMSO溶液(200mmol/L)，反应液总体积为0.5ml，反应体系中环氧底物的终浓度见表1。反应液于30℃，1100rpm振荡反应一定时间(见表1)，反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱Beta-DEX^TM 120)或液相色谱(手性OD-H柱或AD-H柱或OJ-H柱)分析测定底物转化率和剩余底物的ee值。结果见表1。

剩余环氧底物ee值的具体分析条件如下：

实施例4-7和12，13：Chiralcel OD-H(Daicel，Japan)

实施例8，10，14和18，19：ChiralpakAD-H(Daicel，Japan)

实施例15和16：Beta-DEX^TM 120(Sulpeco Inc，USA)

实施例9，11和17：Chiralcel OJ-H(Daicel，Japan)

表1重组环氧水解酶BMEH I催化环氧化合物水解反应的结果

[a]n.d.：未测定

实施例20-26 重组环氧水解酶BMEH II催化拆分环氧化合物

取BMEH II粗酶冻干粉溶解于磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中，混匀后于30℃保温10min，再加入含有环氧底物的DMSO溶液(200mmol/L)，反应液总体积为0.5ml，反应体系中环氧底物的终浓度见表2。反应液于30℃，1100rpm振荡反应一定时间(见表2)，反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱Beta-DEX 120)或液相色谱(手性OD-H柱或AD-H柱或OJ-H柱)分析测定底物转化率和剩余底物的ee值。结果见表2。

剩余环氧底物ee值分析的条件同实施例4和14-19中所述。

表2重组环氧水解酶BMEH II催化环氧化物不对称水解反应的结果

[a]n.d.：未测定

Claims (11)

1.一种环氧水解酶，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

2.一种环氧水解酶基因，其特征在于，其编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质。

3.一种环氧水解酶基因，其特征在于，其碱基序列如序列表中SEQ IDNo.1所示。

4.一种包含如权利要求2或3所述的环氧水解酶基因的重组表达载体。

5.一种包含如权利要求4所述的重组表达载体的重组表达转化体。

6.一种重组环氧水解酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：培养如权利要求5所述的重组表达转化体，获得重组表达的环氧水解酶。

7.一种如权利要求1所述的环氧水解酶作为催化剂在对映选择性动力学拆分外消旋环氧化物以制备光学纯手性环氧化物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用按下述方法进行：在pH 6-9的磷酸盐缓冲液中，在如权利要求1所述的环氧水解酶的作用下，将外消旋环氧化物进行不对称水解反应，制得光学纯手性环氧化物。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的外消旋环氧化物为缩水甘油芳基醚或苯乙烯氧化物化合物，所述的缩水甘油芳基醚中的芳基为苯基或萘基。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的外消旋环氧化物为如式1、2或3所示的外消旋环氧化物：

式1        式2           式3

其中，R₁为-H、-Cl、-NO₂或-CH₃，R₁取代的位置为苯基的邻位、间位或对位；R₂为-H、-Cl或-NO₂，R₂取代的位置为苯基的对位。

11.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的外消旋环氧化物在反应液中的浓度为1～20mmol/L；所述的环氧水解酶的用量为8～800U/mL；所述的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度为0.05～0.1mol/L；所述的水解反应的温度为20～35℃。

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