CN103642743A - 一种全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法，属于发酵工程领域。通过在大肠杆菌中异源表达P.mirabilis氨基酸脱氨酶，并以此菌株转化L-苯丙氨酸生产α-苯丙酮酸，对转化条件进行了优化，实现了全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸。本发明与传统化学法相比，成本低、操作简单、环保，为工业化生物转化生产α-苯丙酮酸奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法，特别是以大肠杆菌表达重组脱氨酶基因，以此菌株转化L-苯丙氨酸生产α-苯丙酮酸，属于发酵工程领域。
背景技术
α-苯丙酮酸(PPA)是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性药物中间体。PPA还可用于制备苯乳酸，苯乳酸可作为抗菌物质。目前PPA生产主要是化学合成法，主要包括：乙酰氨基肉桂酸水解法、乙内酰脲与苯甲醛合成法和海因法。这些方法均需经过多步反应，对反应条件有较高要求，例如高压、高温等，产品得率低，对后期分离纯化加大了难度，易产生有毒有害产物。
L-氨基酸脱氨酶(EC1.4.3.2，L-AAD)催化L-氨基酸氧化脱氨基，生成相应α-酮酸和氨，多为黄素蛋白，二聚体结构。L-氨基酸脱氨酶主要存在于蛇毒和昆虫毒素中，在细菌、真菌、藻类中也存在。蛇毒氨基酸脱氨酶是研究最好的脱氨酶，但是价格昂贵，难以大规模使用。Proteus mirabilis KCTC2566有两种L-氨基酸脱氨酶，一种具有广泛的底物特异性，能够催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其对L-苯丙氨酸具有较高催化活性；另一种具有底物限制性，只对碱性氨基酸具有催化活性，尤其是L-组氨酸。大部分细菌L-氨基酸脱氨酶是胞外分泌型，但是这两种L-氨基酸脱氨酶都是膜蛋白。
在原核及真核生物中，20%-30%的基因编码膜蛋白，这些膜蛋白形成许多重要的超分子化合物。膜蛋白在许多疾病中发挥重要作用，将近半数药物的靶蛋白是膜蛋白。因此近些年，膜蛋白成为蛋白质组学及结构生物学的研究焦点。由于膜蛋白在双层膜上定位、插入以及正确折叠都是非常复杂的过程，表达系统的选择非常重要，膜蛋白表达有很多瓶颈尚未解决。
目前国外学者已对这两种L-氨基酸脱氨酶进行分离纯化及性质研究，但是目前尚未有利用此酶生产PPA的报道。
利用L-氨基酸脱氨酶为膜蛋白这一特性，我们开发了一种新的PPA生产模式-全细胞蛋白转化。全细胞转化相比分离酶具有如下优势：全细胞生物催化剂更容易制备，成本低；比分离酶更稳定，不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物；转化过程一步生成PPA，不需经多步反应。相比之下现有某些化学合成法虽然得率能够达到90%以上，但是能耗高、步骤繁琐、污染严重。因此全细胞转化这一节能环保的生产方式具有极大潜力，有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化PPA生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用全细胞转化高效生产PPA的方法，是将来源于P.mirabilis KCTC2566的脱氨酶基因在大肠杆菌中异源表达，以此菌株高效转化L-苯丙氨酸生产PPA，从而解决了工业化PPA生产高成本、低得率、污染严重的问题。
所述P.mirabilis KCTC2566购买于Korea Collection for Type Cultures，KCTC。
所述大肠杆菌基因工程菌的构建是以P.mirabilis KCTC2566的基因组DNA为模板，PCR扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的脱氨酶基因后连接到载体pET-20b(+)，将所得重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。具体地，是以P.mirabilis KCTC2566基因组DNA为模板，使用如下引物扩增目的基因：
正向引物：5’CGCGGATCCATGAACATTTCAAGGAGAAAGCTAC3’，下划线部分为BamHI酶切位点；反向引物：5’CCGCTCGAGTTACTTCTTAAAACGATCCAAACTAA3’，下划线部分为Xho I酶切位点。PCR产物纯化、酶切后，与载体pET-20b(+)连接，构建重组质粒pET-pma。
所述基因工程菌全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法，是将种子培养液按1%的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养至OD为1.0，添加终浓度0.4mM的IPTG，30℃诱导5h，收集细胞，取1.4-25.2g/L细胞、4-24g/L底物L-苯丙氨酸，pH5-9，25-45℃条件下，转化6-36h。优选底物L-苯丙氨酸浓度为14.0g/L，细胞浓度为8.4g/L，35℃，转化16h。
所述微生物菌株的种子培养与发酵培养基：种子培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl1g，自来水定容至100mL。发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54g的K2HPO4溶于水中，终体积为100mL，高压灭菌)。
本发明的有益效果：本发明成功实现了P.mirabilis中L-氨基酸脱氨酶在大肠杆菌中异源表达，并以此重组细胞一步转化L-苯丙氨酸生产α-苯丙酮酸。最优的转化条件为：L-苯丙氨酸浓度为14g/L和细胞浓度为8.4g/L，35℃转化16h，达到最大转化率25.2%。目前尚未有利用全细胞转化生产PPA的报道，此发明有望解决化学法生产PPA能耗高、步骤繁琐、污染严重的问题，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。
附图说明
图1重组质粒的构建图
图2全细胞转化优化结果图；a，底物浓度对转化率的影响；b，生物催化剂浓度对转化率的影响；c，pH对PPA产量的影响；d，温度对PPA产量的影响；e，转化时间对转化率的影响。
具体实施方式
材料与方法
种子培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl1g，自来水定容至100mL。
发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的含有17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液。
α-苯丙酮酸含量测定：将转化体系进行离心，取上清稀释一定倍数，与2.5mL三氯化铁反应，测定640nm下的吸光度，代入标准曲线方程。
实施例1L-氨基酸脱氨酶重组质粒构建
以P.mirabilis KCTC2566基因组DNA为模板，使用如下引物扩增目的基因：
5’CGCGGATCCATGAACATTTCAAGGAGAAAGCTAC3’(正向引物)和
5’CCGCTCGAGTTACTTCTTAAAACGATCCAAACTAA3’(反向引物)，划线部分分别为BamHI和Xho I酶切位点。所得目的基因序列如SEQ ID NO.1所示，PCR产物纯化、酶切后，与载体pET-20b(+)连接，构建重组质粒pET-pma(如图1)。
实施例2重组大肠杆菌构建
将实施例1重组质粒pET-pma转化克隆宿主E.coli JM109，挑取在LB氨苄抗性平板上生长的单菌落，PCR扩增，挑选到阳性转化子提取质粒，双酶切验证，条带正确的进行测序，序列正确的转化表达宿主E.coli BL21。转化BL21平板单菌落接种种子培养基过夜培养，1%的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养至OD为1.0，添加终浓度0.4mM的IPTG，30℃诱导5h。
实施例3全细胞转化L-苯丙氨酸条件优化
收集实施例2的重组大肠杆菌诱导细胞，在Tris-HCl(pH=7.6)溶液中进行全细胞转化。细胞浓度为12.6g/L(细胞干重)时，分别在不同浓度L-苯丙氨酸(2g/L，4g/L，8g/L，14g/L，20g/L，24g/L)条件下，37℃，转化12h，考察底物浓度对转化的影响，最优L-苯丙氨酸浓度为14g/L时，转化率达到最大20.4％；L-苯丙氨酸浓度14g/L时，加入不同浓度的生物催化剂(1.4g/L，4.2g/L，8.4g/L，12.6g/L，16.8g/L，25.2g/L，细胞干重)，37℃，转化12h，研究细胞浓度对转化的影响，最优细胞浓度为8.4g/L时，转化率为23.7％；在最优底物浓度和细胞浓度条件下，研究不同pH(5，6，7，8，9)和温度(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)对转化的影响，pH对转化影响不大，最优温度为35℃时，转化率为24.2％；在上述最优条件基础上，研究不同转化时间（6h，12h，16h，20h，24h，30h，36h）对转化率的影响，发现转化16h时，转化率达到25.2%，转化20h时，转化率只有0.3%的小幅增长，从经济角度考虑，转化16h为最佳(如图2)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种用于生产α-苯丙酮酸的基因工程菌，其特征在于，是重组表达了脱氨酶基因的大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述脱氨酶基因来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)。
3.一种构建权利要求2所述基因工程菌的方法，其特征在于，具体步骤为以P.mirabilisKCTC2566的基因组DNA为模板，PCR扩增核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的脱氨酶基因后连接到载体pET-20b(+)，将所得重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。
4.权利要求1所述基因工程菌在生产α-苯丙酮酸中的应用。
5.一种应用权利要求2所述基因工程菌全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法，其特征在于，将种子培养液按1%的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养至OD为1.0，添加终浓度0.4mM的IPTG，30℃诱导5h，收集细胞，将1.4-25.2g/L细胞、4-24g/L底物L-苯丙氨酸，pH5-9，25-45℃条件下，转化6-36h，将转化体系进行离心，上清含α-苯丙酮酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述底物L-苯丙氨酸浓度为14.0g/L，细胞浓度为8.4g/L，35℃，转化16h。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，种子培养基组成为：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl1g，自来水定容至100mL。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵培养基组成为：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL；各组分溶解后高压灭菌，冷却到60℃，再加100mL灭菌的含17mmol/LKH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液。
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