CN105368766A - 一株生产戊二胺的基因工程菌及其制备戊二胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种戊二胺生产菌株及其高效生产戊二胺的工艺。所述菌株在赖氨酸脱羧酶启动子ldcCp被替换为环境/营养因素控制型启动子的同时表达信号肽，其催化合成戊二胺的酶的活力得到极大提高并可通过环境温度进行调节，最终表达的酶介于细胞内膜与细胞壁之间，而不释放的发酵体系中，可达到戊二胺高效转化的目的和效果。实现在25～50℃的条件下，分别经过发酵培养菌体，变温高效产酶和目标产物快速转化三个阶段，产戊二胺水平达到106-116.8g/L，赖氨酸转化率达到了理论转化率的91％～97％。

Description

一株生产戊二胺的基因工程菌及其制备戊二胺的方法

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株能高效生产戊二胺的基因工程菌及其应用。

背景技术：

1,5-戊二胺，又名尸胺(cadaverine)、1,5-二氨基戊烷、五亚甲基二胺或尸毒素，是脂肪族生物胺类(包括精胺、腐胺、亚精胺和戊二胺等)中的一种。1885年，德国柏林的医师LudwigBrieger在腐败的尸体中首次发现该胺类，并以此得名尸胺。在细胞内，戊二胺是赖氨酸合成途径的延伸反应，是赖氨酸在赖氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.18)的作用下脱羧产生的(如附图1)，作为一种肉毒胺存在于腐败物中，与鸟氨酸的脱羧产物腐胺一样都是生物尸体腐败产生的气味中的一种成分。这种二胺不仅与腐败作用有关，生物活体在生命代谢中也会产生少量的戊二胺，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱。

戊二胺具有许多重要的生理功能，如戊二胺是微生物细胞内调节铁离子浓度的“铁亲和系统”和一些严格厌氧的革兰氏阴性菌肽聚糖的主要组成成分；戊二胺在关闭微孔蛋白通道和保护大肠杆菌免受氧的毒害方面也起着重要的作用；内源性戊二胺的分泌以及胞内高浓度戊二胺积累可导致外膜渗透性降低，抑制某些抗生素如头孢霉素类抗生素的作用。

戊二胺在农业、医学和工业上均具有广泛的应用。在农业上，外源施加戊二胺可以改善坐果和促进果实发育，提高果实的产量；在医学上，它也可作为一种有效治疗痢疾的药物；在工业上，戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料。

微生物法生产戊二胺，是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径，而现有技术更多的关注在赖氨酸脱羧酶的表达和重组菌的构建等。

如：由日本的东丽株式会社申请的专利号为公开号为CN102844440A的中国专利《1,5-戊二胺的制造方法》公开了一种利用微生物发酵的1,5-戊二胺的制造方法，所使用的微生物是染色体中具有LDC基因的棒状杆菌，可使棒状杆菌在培养过程中持续保持20mU/mg蛋白以上的赖氨酸脱羧酶活性。

德国的巴斯夫欧洲公司申请的公开号为CN101389765A的专利《生产尸胺的方法》公开了一种通过构建重组微生物并培养所述微生物来生产尸胺的方法

德国的赢创德固赛有限责任公司申请的公开号为CN101240258A的专利则公布了戊二胺制备相关专利关注的是发酵条件优化和重组菌构建过程的保护。

可见，现有技术并没有在如何更高效的制备用于戊二胺合成的催化细胞方面进行技术创新性研究。本发明则通过建立戊二胺合成所需催化细胞及其高效制备方法，从而实现戊二胺的大规模制备过程。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明提供一种可高效生产戊二胺的基因工程菌以及利用其制备戊二胺的高效制备工艺。

本发明所提供的技术方案之一是，提供一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，所述基因工程菌其赖氨酸脱羧酶启动子ldcCp被替换为环境/营养因素控制型启动子，使得生产菌株在生长过程中不大量合成目标酶，即目标酶的痕量合成不影响细胞生长，而在生长完成后通过改变环境/营养因素快速过量表达目标酶及其辅因子。

进一步的，所述基因工程菌其出发菌株，可以为大肠杆菌K12、DH5α、W3110、BL21、MG1655等；

更进一步的，所述出发菌株为大肠杆菌B0013-070；

进一步的，所述环境/营养因素控制型启动子可以是pH、温度、溶氧等控制型启动子，也可以是多种营养因素如乳糖、木糖、阿拉伯糖等控制型启动子；

更进一步的，所述控制型启动子为温度调控性启动子p_R-p_L启动子；

所述p_R-p_L启动子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示；

进一步的，所述基因工程菌在替换启动子的同时表达信号肽，使得重组菌株可以在细胞周质空间大量表达赖氨酸脱羧酶；

所述信号肽由基因pelBs编码，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示；

进一步的，本发明所提供的基因工程菌为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)42#,所述菌株已于2014年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号CGMCCNo.10240。

更进一步地，本发明菌种在较低的温度下，如25～36℃，目标酶编码基因ldcC的转录被强烈抑制；而在较高温度下，如37～50℃，目标酶编码基因ldcC的转录被强烈启动。

本发明所提供的技术方案之二：是一种制备戊二胺的高效工艺，所述制备工艺是利用技术方案一所述的基因工程菌为生产菌株发酵生产戊二胺，在发酵初期的6～12h内，培养温度控制在25～36℃，进行菌体的快速生长；在余下的发酵阶段温度控制在37～50℃，诱导产酶1～5h，转化2～8h，产戊二胺水平达到10.6～11.6％(w/v)或以上；其工艺特征是：25～50℃的条件下，分别经过发酵培养菌体，变温高效产酶和目标产物快速转化三个阶段，产戊二胺水平达到106-116.8g/L，赖氨酸转化率达到了理论转化率的91％～97％；

进一步的，发酵过程中使用的培养基为全合成培养基；

更进一步地，本发明建立的关键酶高效制备工艺和快速转化工艺不限于戊二胺的制备，还包括具有类似反应过程的其他化学品，如丙酮酸、丙氨酸、乳酸、α-酮戊二酸、丁二酸、衣康酸以及多种功能糖等等。

有益效果：

1、本发明提供的基因工程菌具有明显的高效转化赖氨酸合成戊二胺的能力，菌种在25～50℃的条件下培养6～12h，诱导产酶1～5h，转化2～8h，从培养细胞到戊二胺转化完成工耗时9-25h,产戊二胺水平达到10.6～11.6％(w/v)或以上，产量达到106-116.8g/L；

2、本发明中使用的表达宿主菌其表达酶的过程在细胞膜完成，最终表达的酶介于细胞内膜与细胞壁之间，而不释放的发酵体系中，进而可以实现催化细胞的重复使用。

3、由于本发明所制备的基因工程就其出发菌株为大肠杆菌，因此表达催化剂的细胞同时可以完成辅因子的合成，在用于赖氨酸转化为戊二胺的过程中可以使用完整的细胞直接进行底物到产物的转化，细胞同时起到了提供催化剂作用的场所和保护催化剂活性的作用，其中辅因子的存在为催化剂的高活性提供了保证。

4、本发明的戊二胺生物转化基因工程菌，在菌体培养过程中，采用全合成培养基，培养液澄清，有利于后续产品分离提取；本发明转化过程使用的原料可以是未经后提取处理的赖氨酸发酵料液；本发明转化过程的效率不受赖氨酸发酵料液残余物的影响；本发明涉及的转化过程完成后形成的戊二胺盐易于后提取和纯化。5、本发明的戊二胺生物转化基因工程菌，在菌体培养、诱导产酶和高效转化过程中，戊二胺积累达较高水平，为后续提取纯化提供了便捷。

6、本发明的戊二胺高效转化过程：用于催化的菌体细胞生长温度在25～36℃下利用葡萄糖快速生长6～12h，形成菌体；快速诱导产酶1～5h后，在37～50℃下快速转化赖氨酸合成戊二胺。即：运用本发明的重组菌及其戊二胺制备工艺，戊二胺的生产过程仅需改变发酵温度控制参数，即可实现以赖氨酸为原料高效生成戊二胺。

附图说明

图1赖氨酸脱羧反应；

图2重组质粒pT-ldcC的物理图谱；

图3赖氨酸脱羧酶启动子功能鉴定结果；

图4赖氨酸脱羧酶信号肽功能鉴定结果；

图5戊二胺高效制备流程图；

图6戊二胺HPLC检测图谱；

图7小试水平戊二胺转化进程；

图8规模化生产下戊二胺转化进程。

具体实施方式：

实施例1：大肠杆菌染色体赖氨酸脱羧酶温度调控型启动子和信号肽的替换

1，ldcC基因部分序列的克隆

以大肠杆菌B0013-070染色体DNA为模板，用引物ldc-up1(SEQIDNO:3)和ldc-up2(SEQIDNO:4)进行PCR扩增ldcC5'端及其上游序列(ldcC-up)，两端通过引物加入EcoRI位点。PCR产物大小～920bp；将PCR产物克隆入pMD-18T-simple，获得重组质粒pLDC-UP；

ldc-up1：GGAATTCGCAACCTGCGTGAAATGTC；EcoRI

ldc-up2：GGAATTCTGAACGGCGGTGTAATGTT；EcoRI

2，ldcC基因重组同源臂的获得

EcoRI酶切重组质粒pLDC-UP释放915bp和2.7kb片段；以重组质粒pLDC-up的DNA为模板，用引物ldc-invF(SEQIDNO:5)和ldc-invR(SEQIDNO:6)进行反向PCR扩增，PCR产物为ldcC基因上游部分序列含启动子部分，即LDC-up大小～3.57kb。

ldc-invF：GTTCGGATCCGAACATCATTGCCATTATGGGAC；BamHI

ldc-invR：GGGCTCAAACCGTGGCGATAAA

3，温控型启动子和分泌型信号肽的获得

PCR扩增pPL451(Gene,1996,176:49～53)的pL启动子(引物pL-F(SEQIDNO:7)和pL-R(SEQIDNO:8))，PCR产物大小～1.37kb。PCR产物用BamHI和SpeI(BcuI)酶切、pET-20b用BglII和XbaI、连接转化温控型启动子片段pL和信号肽序列pelBs获得质粒pPL-pelBs,大小5.0kb；SmaI和BamHI双酶切pPL-pelBs，胶分离pL-pelBs片段，大小1.48kb。

pL-F：ATCAGGATCCCGGGTGATGATTATCAGCCAGCAGAGATT；BamHI/SmaI

pL-R:TTGGGACTAGTCCCAATGCTTCGTTTCG；SpeI

4，替换启动子和信号肽突变盒的获得

PCR产物LDC-up用BamHI酶切、SmaI+BamHI酶切pPL-pelBs，胶回收pL-pelBs(1.48kb)片段；连接转化大肠杆菌获得质粒pLDC::pL-pelBs，用EcoRI酶切释放2.7kb+2.36kb片段；在SmaI位点克隆入庆大霉素抗性基因difGm盒，获得质粒pLDC::pL-pelBs-Gm。

5，ldcC基因启动子和信号肽同源重组替换

用EcoRI酶切释放2.7kb+3.36kb片段；胶回收pLDC::pL-pelBs-Gm/EcoRI的3.36kb片段(用引物ldc-up1和ldc-up2进行PCR制备3.36kb片段，DpnI酶切，纯化后电转化)，电转化已经含有pKD46的B0013-070菌株中。获得ldcC基因启动子替换为pL的重组菌41#菌株。

6，游离质粒中ldcC基因启动子和信号肽的替换

SmaI和BamHI双酶切pPL-pelBs，胶分离pL-pelBs片段，与以pET20b-ldcC为模板用引物Ec-RlC3(SEQIDNO:9)和Ec-RlC4(SEQIDNO:10)进行反向PCR扩增并用限制性内切酶，如BglII进行酶切获得ldcC基因产物连接，从而获得重组质粒pT-cI^ts857-p_R-p_L-pelBs-ldcC简称，pT-ldcC，其物理图谱如图2所示，该重组质粒包含温控型启动子，信号肽和ldcC完整基因，具备温控分泌表达ldcC的功能。将重组质粒pT-ldcC电转化41#菌株，获得重组菌种42#(pT-ldcC)，该菌种专利保藏号为：CGMCCNo.10240。

Ec-RlC3：TCCTGGCCACGGGTGCGCATGAT

Ec-RlC4：GGAAGATCTGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGC；BglII

实施例2：菌种42#(pT-ldcC)中p_R-p_L启动子活性的确定

专利菌株42#(pT-ldcC)和出发菌株B0013-070在25～36℃和37～50℃进行培养2～10h，其培养基为(g/L)：酵母膏15，蛋白胨0.5，无水MgSO₄0.25，葡萄糖5。并测定它们的细胞破碎液赖氨酸脱羧酶(LDC)比酶活，典型的结果如图3所示。其中细胞破碎液的制备过程如下，30mL发酵液于50mL离心管中，6000rpm离心8min；弃去上清，加入10mLddH₂O，漩涡震荡混匀，补加ddH₂O至30mL，6000rpm离心8min；弃去上清，加入10mLPBS，漩涡震荡混匀，补加PBS至30mL，6000rpm离心8min。重复洗涤细胞1次。加入10mLPBS重悬菌体，超声破碎。(超声破碎条件：超声3s，间隙2s，温度25℃，破碎时间30min，功率40％)；4℃，8000rpm离心15min，除去细胞碎片。

菌种42#在30℃仅产生极低量的LDC活性。在42℃培养，菌种42#(pT-ldcC)的LDC活性是出发菌株42#的20倍，可以满足戊二胺快速形成的需要。菌种42#(pT-ldcC)在42℃培养的LDC比酶活值标定为100％，与此相比，该菌种在30℃生长时LDC酶活显著降低。说明通过温度的变化来控制菌种42#(pT-ldcC)的p_R-p_L启动子有效地控制了ldcC基因的表达。

实施例3菌种42#(pT-ldcC)细胞活性及赖氨酸脱羧酶的分泌表达过程鉴定

专利菌株42#(pT-ldcC)和出发菌株B0013-070在25～36℃和37～50℃进行培养2～10h，其培养基为(g/L)：酵母膏0～20，蛋白胨0～20，无水MgSO₄0～10，葡萄糖5。并通过添加乳糖，IPTG等加强赖氨酸脱羧酶的表达过程。发酵液6000rpm离心8min取上清直接测定酶活作为发酵液中的酶活；离心收集的细胞经培养基重悬为起始体积后测定的酶活作为细胞周质空间的酶活；细胞破碎液测定的酶活作为细胞周质空间和胞内总的酶活。典型测定结果如图4所示。

菌种42#(pT-ldcC)培养并诱导产酶后细胞破碎液的LDC比酶活值标定为100％。发酵液中酶活极低，细胞周质空间酶活接近细胞破碎液的酶活。可见信号肽有效的将赖氨酸脱羧酶表达至细胞的周质空间。

实施例47L发酵罐中菌体培养诱导产酶及转化赖氨酸形成戊二胺

菌种42#(pT-ldcC)在7L发酵罐中进行赖氨酸脱羧形成戊二胺来检验温度调控的LDC表达在可控生产条件下的效果。菌种42#(pT-ldcC)在25～36℃进行好氧培养至OD₆₀₀值约为15～40，将发酵罐温度设定为37～50℃继续好氧培养0～120min，再将通气量设为0～0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段发酵温度为37～50℃，赖氨酸添加量为166～176g/L。其发酵培养基为(g/L)：磷酸氢二铵0～25，磷酸二氢钾0～5，磷酸氢二钠，0～25，氯化钠0～5，MgSO₄0～0.5，FeSO₄0～1，FeCl₃0～1，CoCl₂0～1，CuCl₂0～1，CoCl₂0～1，Na₂MoO₄0～1，H₃BO₃0～1，MnCl₂0～1，硫胺素0～1，IPTG0～5，乳糖0～10，葡萄糖0～50，pH6.0～7.5。戊二胺高效制备流程图如图5所示。戊二胺HPLC检测结果如图6所示。发酵过程中赖氨酸、戊二胺、赖氨酸脱羧酶酶活和菌体浓度如图7所示。

菌种42#(pT-ldcC)发酵罐发酵结果表明在好氧阶段成功将葡萄糖用于菌体量的积累，转化阶段快速将赖氨酸转化为戊二胺。最终发酵液中，戊二胺产量高达106.5～116.8g/L。赖氨酸转化率达到了理论转化率的91％～97％。

实施例5——菌种10吨发酵罐中5批次发酵转化制备戊二胺

将实施例4中的发酵工艺放大至10吨规模。以满足葡萄糖和赖氨酸的连续补加为参考指标对发酵罐和流加罐进行选择，并按照工厂里的常规操作完成运行前发酵罐的准备工作。主发酵罐一个，葡萄糖补料罐一个，赖氨酸补料罐一个和种子罐一个。配置70％葡萄糖，加热溶解后，灭菌备用。浓缩后赖氨酸提取溶液，灭菌后，搅拌备用。配置培养基，并灭菌，然后进行接种，开始发酵，25～36℃，通风180～340L/h搅拌0～600r/min。12h后进入诱导产酶阶段，发酵温度提高为37～50℃。每隔2个小时测定葡萄糖含量，1～5％初糖耗尽，停止通风，搅拌速度降至0～180r/min。进入转化制备戊二胺阶段，陶瓷膜浓缩上述高活性细胞，并添加8吨赖氨酸终浓度为17％的发酵料液，转化温度为37～50℃。3h后，赖氨酸消耗至～0.6g/L以下后结束转化过程，进行产品的后提取和晶体制备。单批转化结束，陶瓷膜过滤回收菌体，并重新投料进行下批次的转化过程。连续完成5批转化过程。发酵过程中赖氨酸、戊二胺、赖氨酸脱羧酶酶活和菌体浓度如图8所示。

表1：五批次10吨罐连续转化生产结果

综上所述，本发明通过基因工程技术对出发菌染色体上的赖氨酸脱羧酶编码基因的表达进行简易条件下的动态调控，从而实现了重组菌从催化赖氨酸高效生产戊二胺的简洁制备工艺。本发明技术经过简单修改后，同样可以用于其它工业上重要的微生物代谢产物，但不限于，如L-乳酸、乙酸、丙酮酸、丁二酸、苹果酸等多种有机酸；脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、精氨酸等多种氨基酸；硫胺素、维生素B₁₂等多种微生物；或，乙醇、丙醇等短链醇的菌种构建、发酵生产和新工艺技术的建立与应用。

Claims (8)

1.一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌其赖氨酸脱羧酶启动子ldcCp被替换为环境/营养因素控制型启动子的同时表达信号肽。

2.如权利要求1所述的一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，其特征在于，出发菌株为大肠杆菌K12或DH5α或W3110或BL21或MG1655。

3.如权利要求1所述的一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，其特征在于，所述环境/营养因素控制型启动子是pH、温度、溶氧、乳糖、木糖、阿拉伯糖控制型启动子。

4.如权利要求1或3所述的一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，其特征在于，所述环境/营养因素控制型启动子是p_R-p_L启动子，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示。

5.如权利要求1所述的一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，其特征在于，所述信号肽由pelBs基因编码，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示。

6.如权利要求1所述的一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)42#,保藏编号CGMCCNo.10240。

7.一种利用权利要求1所述基因工程菌生产戊二胺的方法，其特征在于，在发酵初期的6～12h内，培养温度控制在25～36℃，进行菌体的快速生长；在余下的发酵阶段温度控制在37～50℃，诱导产酶1～5h，转化生产戊二胺2～8h。

8.如权利要求7所述的一种生产戊二胺的方法，其特征在于，发酵过程中使用的培养基为全合成培养基。