CN103820506A - 一种基因重组菌发酵生产辅酶q10的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基因重组菌发酵生产辅酶Q10的方法,将NAD激酶基因转入高效表达还原性辅酶Q10的菌株；所述的重组菌优化的培养条件为：（1）斜面活化；（2）种子培养；（3）发酵培养。本发明通过基因工程手段构建的重组菌，稳定性强，其辅酶Q10产量较出发菌株提高了21.6%，达到1.63g/L，能够达到工业生产的要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产辅酶Q10的方法，尤其是涉及一种基因重组菌发酵生产辅酶Q10的方法。
背景技术
辅酶Q是一种天然存在的脂溶性醌类化合物，主要存在于原核生物细胞质膜和真核生物线粒体内膜中。结构上是由苯环和长度不同的类异戊二烯侧链两部分构成。由于不同生物中聚异戊二烯焦磷酸合成酶的编码不同，使得不同的生物体产生的辅酶Q种类各不相同。辅酶Q10是呼吸链上的一种电子传递体，具有抗氧化功能，广泛运用于心血管类疾病、肝炎、癌症、艾滋病等综合治疗及提高人体免疫力。
目前，辅酶Q10的生产方法主要有3种：动植物组织提取法、化学合成法和微生物发酵法。
1. 动植物组织提取法
动植物组织提取法曾经是辅酶Q10唯一的生产方法。该法利用了辅酶Q10广泛存在于动植物体内，特别是动物的肝脏内的特点。动植物组织提取法又可分为皂化法(醇-碱皂化法)、溶剂萃取法(醇-醚混合提取法)、吸附层析法等。
2．化学合成法
随着从废次烟叶中提取分离茄尼醇技术的成功及其工业化的实现，以全E式结构的茄尼醇为原料合成辅酶Q10的研究引起了化学家的广泛关注。目前，通过茄尼醇合成辅酶Q10主要有两条途径：一是茄尼醇经多步反应制备成癸异戊二烯醇衍生物，再与2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌（Q0）及其衍生物多步合成辅酶Q10的侧链直接引入法；二是用2,3-二甲氧基-5-甲基-1-4-苯醌（Q0)或四甲氧基甲苯先制备成含有异戊烯结构的中间体，再与茄尼醇衍生物经偶联、氧化合成辅酶Q10的侧链延长法。
3．微生物发酵法
20世纪70年代初期，就在化学合成法徘徊不前之际，人们想到了利用微生物培养获取辅酶Q10的方法，现已发现了很多产辅酶Q10的菌株。
与其它制备方法相比，微生物发酵法生产辅酶Q10具有不受原料限制，原料成本低，分离过程相对简单，不存在手性问题，易控制可实现大规模生产及发展前景广阔等优点。
但现有的应用于辅酶Q10生产的菌株产量都较低，难于实现大规模工业化生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种基因重组菌发酵生产辅酶Q10的方法，与出发菌株相比，重组菌株能够有效提高辅酶Q10的产量。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种基因重组菌发酵生产辅酶Q10的方法，将一种与呼吸代谢、电子传递及能量转换相关的酶的基因转入高效表达还原性辅酶Q10的菌株。
所述与呼吸代谢、电子传递及能量转换相关的酶的基因为：NAD激酶基因。
所述高效表达还原性辅酶Q10的出发菌株为：类红球细菌（Rhodobacter sphaeroides）。
所述类红球细菌（Rhodobacter sphaeroides）保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.1.2569。
所述的基因操作过程包括所涉及的目的基因的PCR扩增程序、表达载体的构建及检验方法、目的基因电转导方式。
所述重组菌的优化培养条件为：
（1）斜面活化（g/L）：葡萄糖 10-25，牛肉膏 5-15，酵母粉 5-20，氯化钠 5-10，琼脂粉 5-20，pH5-8，121℃灭菌20 min，确定无污染后接种重组菌，28-35℃培养2-8天；
（2）种子培养（g/L）：葡萄糖 10-30，玉米浆 5-20，酵母粉 5-25，硝酸钠 2-8，磷酸二氢钾 1-2，七水硫酸镁 0.2-1，pH5-8，121℃灭菌20 min，冷却后从活化好的斜面取一环菌体接种，25-38℃震荡培养5-32小时；
（3）发酵培养（g/L）：葡萄糖 30-80，玉米浆 5-40，酵母粉 5-25，硝酸钠 2-10，磷酸二氢钾 1-2，七水硫酸镁 0.2-1，一水硫酸锰 0.01-0.05，七水硫酸亚铁 0.01-0.05，生物素 （1-9）×10-5，pH5-8，121-125℃灭菌20 min，接种量为1-10%，25-38℃震荡培养2-7天。
本发明通过前期发酵菌株代谢途径的分析，找到了影响菌株生产性能的酶，通过基因工程手段，采用一系列分子生物学技术，构建了新的基因工程重组菌，其辅酶Q10产量得到了显著的提升。进一步通过发酵培养基的优化，找到了适用于该重组菌的培养基，其辅酶Q10产量得到了进一步提升。
本发明利用微生物发酵法生产辅酶 Q10，与其它制备方法相比，具有不受原料限制，原料成本低，分离过程相对简单，不存在手性问题，易控制，可实现大规模生产及发展前景广阔等优点。同时，本发明通过基因工程手段，改进了菌株呼吸代谢、电子传递及能量代谢的流量，使其对氧气及碳源的利用效率大大提高，生长速率和辅酶Q10的产量都有显著的提升，其辅酶Q10产量较出发菌株提高21.6%，达到1.63 g/L。该菌株性能稳定，能满足工业化生产的要求。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例包括以下步骤：
1、目的基因的扩增
包括以下步骤：
（1）根据根据GenBank公布的NAD激酶基因ppnK序列，引物设计如下：
ppnK F Xba I：5’-GC TCTAGA ATGACTGCACCCACGAACG-3’
ppnK R Sal I：5’-GC GTCGAC TTACCCCGCTGACCTGG-3’
下划线部分为限制性酶Xba I及Sal I酶切位点。引物由上海某基因公司合成。
（2）Rhodobacter sphaeroides基因组DNA的提取。PCR扩增出ppnK片段，并通过核酸电泳进行回收。
（3）将胶回收后的目的片段与pMD19-T Simple Vector连接，连接体系组成如下：
| 试剂 | 体积 |
| pMD19-T Simple Vector | 0.2 μL (约50 ng) |
| 加A后PCR产物 | 4.8 μL (约300 ng) |
| 10 × Ligation buffer | 1 μL |
| T4 DNA Ligase (5 U/μL) | 1 μL |
| ddH2O | 3 μL |
将连接体系混合均匀，于16 ℃恒温水浴中连接过夜。
（4）制备大肠杆菌E. coli JM109感受态，并将连接体系转化入感受态细胞。将转化后的菌液涂布于含50 μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基中，倒置平板，于37℃培养16 h，可见相应菌落。从平板上随机挑取菌落于LB培养基中培养过夜，提取质粒后用自动序列仪进行测序（测序采用Sanger双脱氧末端终止法，由上海生工生物工程有限公司完成）。用DNAMAN软件对测序结果进行分析。
（5）目的片段与表达载体的连接：将已携带目的基因片段的重组T载体进行双酶切，核酸胶回收，获得纯化的带粘性末端的目的基因片段；将经双酶切获得的目的基因片段与经同样双酶切处理的表达载体pJC1-tac进行连接。
（6）电转化：将连接有目的片段ppnK的表达体系pJC1-tac-ppnK电转化入Rhodobacter sphaeroides感受态细胞，涂布在0.5wt%葡萄糖和10 μg/ml卡那霉素的固体LB平板上，于30℃培养36 h后长出转化子。经检验，共有15株含有重组质粒，即为含有ppnK基因的重组菌株。
实施例2
本实施例包括以下步骤：
（1）重组菌培养
将获得的15株重组菌接种于种子培养基，每个三个平行，于32℃，180 rpm摇床培养84小时。
（2）产物提取
用6 M盐酸将发酵液pH调至3.5，之后加入6 M氢氧化钠将pH调至7.0；收集菌液于8000 rpm离心10 min；收集菌体，加入石油醚，于45℃，180 rpm下回流提取2小时，提取液8000 rpm下离心10 min，取上清液浓缩至干，加入无水乙醇溶解，过滤后待测。
（3）HPLC检测
样品检测方法（参照中国药典辅酶Q10检测方法）
色 谱 柱：BDS C18 5μm 250 mm×4.6 mm
流 动 相：甲醇：无水乙醇＝50:50
检测波长：275 nm
流 速：1.0 ml/min
柱 温：35℃
进 样 量：20μl
通过检测，出发菌株的辅酶Q10产量约为1.28 g/L，与出发菌相比，15株重组菌株生长较快，其辅酶Q10产量也均有不同程度的提高，其中，3号菌株的产量最高，达到1.55 g/L。
实施例3
本实施例包括以下步骤：
通过正交实验，确定了3号重组菌株的最佳发酵培养基为（g/L）：葡萄糖 40，玉米浆 20，酵母粉 15，硝酸钠 5，磷酸二氢钾 1.5，七水硫酸镁 0.5，一水硫酸锰 0.01，七水硫酸亚铁 0.01，生物素 1×10-5，pH7.0。
将出发菌与重组菌分别接种于种子培养基，32℃震荡培养24小时后，转接于优化好的发酵培养基，每组设三个平行，接种量为相当于培养基的2wt%，32℃震荡培养84小时。
按实施例2方法进行提取与HPLC检测，结果显示，重组菌株的生长速率和最终菌体量均高于出发菌株，其辅酶Q10产量达到1.63 g/L，与出发菌株1.34 g/L的产量相比，其产量提高了21.6%。
Claims (3)
1. 一种基因重组菌发酵生产辅酶Q10的方法，其特征在于，将NAD激酶基因转入高效表达还原性辅酶Q10的菌株。
2.根据权利要求1所述的基因重组菌发酵生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述高效表达还原性辅酶Q10的出发菌株为：类红球细菌（Rhodobacter sphaeroides）；所述类红球细菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.1.25691.2569。
3.根据权利要求1或2所述的基因重组菌发酵生产辅酶Q10的方法，其特征在于，所述重组菌的培养条件为：
（1）斜面活化：葡萄糖 10-25 g/L，牛肉膏 5-15 g/L，酵母粉 5-20 g/L，氯化钠 5-10 g/L，琼脂粉 5-20 g/L，pH5-8，121℃灭菌20 min，确定无污染后接种重组菌，28-35℃培养2-8天；
（2）种子培养：葡萄糖 10-30 g/L，玉米浆 5-20 g/L，酵母粉 5-25 g/L，硝酸钠 2-8 g/L，磷酸二氢钾 1-2 g/L，七水硫酸镁 0.2-1 g/L，pH5-8，121℃灭菌20 min，冷却后从活化好的斜面取一环菌体接种，25-38℃震荡培养5-32小时；
（3）发酵培养：葡萄糖 30-80 g/L，玉米浆 5-40 g/L，酵母粉 5-25 g/L，硝酸钠 2-10 g/L，磷酸二氢钾 1-2 g/L，七水硫酸镁 0.2-1 g/L，一水硫酸锰 0.01-0.05 g/L，七水硫酸亚铁 0.01-0.05 g/L，生物素 （1-9）×10-5 g/L，pH5-8，121-125℃灭菌20 min，接种量为1-10%，25-38℃震荡培养2-7天。
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